PITC柱前衍生-反相高效液相色譜法測(cè)定黃酒中游離氨基酸和生物胺

芮鴻飛，張曉瑜，劉興泉*，吳峰華，王卓然，李凱利

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

PITC柱前衍生-反相高效液相色譜法測(cè)定黃酒中游離氨基酸和生物胺

芮鴻飛，張曉瑜，劉興泉*，吳峰華，王卓然，李凱利

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

建立柱前衍生-反相高效液相色譜，同時(shí)測(cè)定黃酒中17 種氨基酸及7 種生物胺含量的方法。采用異硫氰酸苯酯柱前衍生試劑，采用Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析，以乙酸鈉溶液和乙腈溶液混合液進(jìn)行梯度洗脫，在254 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行氨基酸和生物胺的含量分析。氨基酸和生物胺在2.0～500 mg/L和0.5～125 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2大于0.99，平均回收率在86.44%～99.75%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.31%～3.53%之間；檢出限為0.02～0.25 mg/L，定量限為0.25～4.50 mg/L。方法線性范圍廣、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，適用于黃酒中氨基酸及生物胺的檢測(cè)。

黃酒；氨基酸；生物胺；反相高效液相色譜

芮鴻飛， 張曉瑜， 劉興泉， 等. PITC柱前衍生-反相高效液相色譜法測(cè)定黃酒中游離氨基酸和生物胺［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（8）: 159-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608028. http://www.spkx.net.cn

RUI Hongfei， ZHANG Xiaoyu， LIU Xingquan， et al. Simultaneous determination of free amino acids and biogenic amines in chinese rice wine by RP-HPLC with pre-column phenylisothiocyanate （PITC） derivatization［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 159-163. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608028. http://www.spkx.net.cn

黃酒是世界上最古老的釀造酒之一，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、酒性溫和、酒度較低、價(jià)格適中成為帶有民族傳統(tǒng)特定的大眾飲料酒。黃酒中氨基酸含量豐富，被稱為“液體蛋糕”，氨基酸不僅是黃酒主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，也是酒的風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的前驅(qū)［1-2］。黃酒中的游離氨基酸可以進(jìn)行脫羧基生成相應(yīng)的生物胺［3］。生物胺是一類具有生物活性的低分子含氮化合物的總稱，當(dāng)人體攝入過(guò)量會(huì)引起頭痛、惡心、呼吸紊亂等反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)危及生命［4-5］。張敬等［6］調(diào)查研究表明黃酒中生物胺含量在18.6～140.0 mg/L，平均含量為78.3 mg/L，遠(yuǎn)高于葡萄酒和啤酒中生物胺的含量，因此，生物胺成為黃酒中的一種潛在的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)。

目前，氨基酸的測(cè)定方法有顯色法、氨基酸自動(dòng)分析儀、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法等［6］；生物胺的分析方法已經(jīng)報(bào)道的有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法等［7］。氨基酸和生物胺的分析方法以高效液相色譜法最為常見(jiàn)，原理是氨基酸和生物胺的衍生物可以通過(guò)在某些檢測(cè)器下的響應(yīng)值來(lái)定性定量。常用的衍生劑有異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、丹磺酰氯（dimethylaminonaphthalene sul-fonyl chloride，Dansyl-Cl）、鄰苯二甲醛（1，2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）、氯甲酸芴甲酯、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞氨基甲酸酯等［8-13］。美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)官方以茚三酮為柱后衍生試劑的高效液相色譜-紫外檢測(cè)法作為分析氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，但靈敏度不高。OPA代替茚三酮做為柱后衍生試劑，采用熒光檢測(cè)，靈敏度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)，但其不能與二級(jí)氨基酸（氨基為仲氨基，如脯氨酸）反應(yīng)。Dansyl-Cl能與氨基酸和生物胺的一級(jí)氨基（伯氨基）和二級(jí)氨基（仲氨基）都能反應(yīng)，但反應(yīng)較慢，且過(guò)多的衍生劑會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果。以PITC為柱前衍生劑的氨基酸分析方法以其反應(yīng)速度快、產(chǎn)物單一穩(wěn)定，與一級(jí)、二級(jí)氨基均可反應(yīng)等特點(diǎn)，在紫外檢測(cè)器下，有較高的靈敏度，且柱前衍生相對(duì)柱后衍生，有省時(shí)、儀器配置簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，因而得到廣泛的應(yīng)用［14］。

國(guó)外已有同時(shí)分析氨基酸和生物胺的方法研究［15-19］，并應(yīng)用于氨基酸和生物胺的發(fā)酵過(guò)程研究中，國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以PITC為柱前衍生劑，采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃酒中17 種游離氨基酸及7 種生物胺含量，以期為黃酒檢測(cè)中多種氨基酸和生物胺的檢測(cè)提供簡(jiǎn)便實(shí)用的方法。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

8 種黃酒 市售。

異硫氰酸苯酯（純度＞98%）、17 種氨基酸（純度＞98%）、7 種生物胺（純度＞99.5%） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；乙酸鈉（分析純） 杭州化學(xué)試劑有限公司；1.2% PITC-乙腈溶液：準(zhǔn)確移取1.2 mL異硫氰酸苯酯溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度；14%三乙胺-乙腈溶液：準(zhǔn)確移取14 mL三乙胺至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度；0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液：準(zhǔn)確稱取三水合乙酸鈉13.61 g，加水溶解后加入5 mL三乙胺，并用水定容至1.0 L，用0.1 mol/L乙酸調(diào)pH值至6.2。

LC-20AT液相色譜（配二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)量器） 日本島津公司；QZ-866旋渦振蕩器、GL-3250A磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PSC30U-120分析天平、FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器公司；TDL-40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱取氨基酸12.50 mg、生物胺6.25 mg，用0.1 mol/L鹽酸定容至25 mL的容量瓶中，超聲至完全溶解，得（0.5+0.25） mg/mL的氨基酸-生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存。用0.1 mol/L鹽酸將混合標(biāo)準(zhǔn)稀釋成質(zhì)量濃度為（500+250）、（250+125）、（50+25）、（10+5.0）、（2.0+1.0） mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列梯度溶液，待衍生化操作。

1.2.2量品衍生化

準(zhǔn)確移取1 mL量液于10 mL具塞試管中，分別加入14%三乙胺-乙腈溶液和1.2%異硫氰酸苯酯-乙腈溶液各0.5 mL，混勻，室溫條件下靜置30 min后，加入2 mL正己烷，旋渦混合器振蕩60 s后靜置10 min，萃取反應(yīng)過(guò)剩的PITC，取下層清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后待反相高效液相色譜分析。

1.2.3色譜條件

色譜柱：C18Inertsil ODS-SP色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.1mol/L乙酸鈉緩沖液-乙腈（97∶3，V/V）；流動(dòng)相B：乙腈-水（4∶1，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)量量：10 μL；洗脫程序見(jiàn)表1。

表1　分析梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。每組平行3 次，測(cè)定結(jié)果以平均值表示。

2　結(jié)果與分析

2.1氨基酸、生物胺的定性

采對(duì)0.02 mol/L乙酸鈉-乙腈［15］、磷酸鹽緩沖液［16］、醋酸鈉緩沖溶液（pH 6.5）-乙腈溶液［20～22］、0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈-水［23］等流速相分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈-水分離效果最好，且流動(dòng)相中加入0.5%的三乙胺溶液，pH值調(diào)至6.2時(shí)分離效果更好。在保證分離的條件下，將流動(dòng)性梯度洗脫程序進(jìn)行調(diào)整，得出最佳分離條件，結(jié)果見(jiàn)表1，在此條件下17 種氨基酸和7 種生物胺實(shí)現(xiàn)了基線分離，各氨基酸和生物胺之間無(wú)干擾，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖1所示，17 種氨基酸和7 種生物胺在55 min內(nèi)全部出峰，相比其他研究者報(bào)道［14，24］的方法更節(jié)省時(shí)間；黃酒量品色譜圖如圖2所示，酒中其他物質(zhì)對(duì)氨基酸和生物胺的衍生物檢測(cè)出峰無(wú)干擾，本方法適用于黃酒中氨基酸和生物胺的分析。

圖1　氨基酸和生物胺標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Chromatogram of amino acid and biogenic amine standards

圖2　黃酒樣品中氨基酸和生物胺色譜圖Fig.2 Chromatograms of amino acids and biogenic amines in Chinese rice wine

2.2衍生條件的確定

考察15、25、35 ℃ 3 個(gè)溫度對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示溫度對(duì)衍生結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），因此選擇室溫條件下進(jìn)行；考察0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、 2.0%等不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PITC-乙腈溶液對(duì)衍生化反應(yīng)的影響；當(dāng)PITC質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)1.2%之后，結(jié)果差異不顯著；因此選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的PITC-乙腈溶液作為量品衍生時(shí)的衍生劑?？疾?0、20、30、40、50 min等不同衍生時(shí)間對(duì)衍生反應(yīng)的影響；30 min后結(jié)果差異不顯著，因此選用30 min作為量品的衍生時(shí)間。最終衍生確定在室溫條件下進(jìn)行，衍生劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的PITC-乙腈溶液，反應(yīng)30 min。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限測(cè)定結(jié)果

以標(biāo)準(zhǔn)系列梯度溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性范圍；將加標(biāo)量品逐漸稀釋后衍生后進(jìn)量，以RSN不小于3計(jì)算得該方法的檢出限，以RSN不小于10計(jì)算得該方法定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。檢出限為0.02～0.25 mg/L，定量限為0.25～4.50 mg/L。

表2　氨基酸和生物胺的線性回歸方程Table 2 Linear regression equations of amino acids and biogenic amines

2.4回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)黃酒量品進(jìn)行3 水平（半量、等量、倍量）的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6 次，結(jié)果見(jiàn)表3。得平均加標(biāo)回收率在86.44%～99.75%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.31%～3.53%（n=6）之間，可以滿足黃酒中氨基酸含量測(cè)定的要求。

表3　黃酒中氨基酸和生物胺的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of amino acids and biogenic amines in Chinese rice wine （n= 6）

2.5量品測(cè)定結(jié)果

表4　黃酒中氨基酸和生物胺含量Table 4 Contents of 17 amino acids and 7 biogenic amines of Chinese rice wine mg/L

本實(shí)驗(yàn)選用8 種不同品種的黃酒進(jìn)行分析，包括甜型（量1、量2、量3）、半干（量4、量5）和干型（量6、量7、量8）3 種含糖量不同的黃酒，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定8 種黃酒中，氨基酸含量與生物胺含量因黃酒品種的不同而各有差異［9，14-15］，氨基酸含量在1 433.49～2 730.69 mg/L之間，平均值為2 156.00 mg/L；生物胺含量在39.49～67.48 mg/L之間；其中生物胺以色胺、腐胺和酪胺較多，但在安全范圍內(nèi)，對(duì)黃酒安全無(wú)影響，與張鳳杰等［25］結(jié)果一致。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功采用反相高效液相色譜法建立了一種有效地同時(shí)測(cè)定黃酒種17 種氨基酸及7 種生物胺含量的方法，實(shí)現(xiàn)了17 種氨基酸和7 種生物胺的基線分離，方法專屬性好，各氨基酸和生物胺之間無(wú)干擾。對(duì)市售8 種不同種類的黃酒中游離氨基酸和生物胺進(jìn)行了實(shí)際量品檢測(cè)，測(cè)試的3 種類型黃酒均適用本方法，酒中其他物質(zhì)對(duì)氨基酸和生物胺的衍生物出峰無(wú)干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為黃酒中多種氨基酸和生物胺的同時(shí)測(cè)定提供了簡(jiǎn)便、實(shí)用的方法。

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Simultaneous Determination of Free Amino Acids and Biogenic Amines in Chinese Rice Wine by RP-HPLC with Pre-Column Phenylisothiocyanate （PITC） Derivatization

RUI Hongfei， ZHANG Xiaoyu， LIU Xingquan*， WU Fenghua， WANG Zhuoran， LI Kaili
（School of Agriculture and Food Science， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China）

A reversed-phase high performance liquid chromatographic （RP-HPLC） method has been presented for the simultaneous determination of 17 free amino acids and 7 biogenic amines in Chinese rice wine. Wine samples were precolumn derivatized with phenylisothiocyanate （PITC）， separated using Inertsil ODS-SP C18chromatography column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）， eluted with a mobile phase composed of sodium acetate， acetonitrile and ultra-pure water， and detected at 254 nm. The calibration curves of 17 amino acids and 7 biogenic amines all exhibited good linearity over the range from 2.0 to 500 mg/L and 0.5 to 125 mg/L， respectively. Mean recoveries for amino acids and biogenic amines were between 86.44% and 99.75%， and the relative standard deviations （RSDs） were in the range of 0.31%-3.53%. The limits of detection （LODs）for 17 free amino acids and 7 biogenic amines were in the range of 0.02-0.25 mg/L， and the limits of quantification （LOQs）were 0.25-4.50 mg/L. The method is stable， accurate， and suitable for the simultaneous determination of amino acids and biogenic amines in Chinese rice wine， having a wide linear range.

Chinese wice wine； amino acids； biogenic amines； reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）

10.7506/spkx1002-6630-201608028

TS262.4

A

1002-6630（2016）08-0159-05

2015-06-12

紹興市重點(diǎn)科研項(xiàng)目（2014A22002）

芮鴻飛（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称贩治雠c檢測(cè)。E-mail：782546847@qq.com

劉興泉（1973—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)辄S酒質(zhì)量控制與食品安全。E-mail：liuxq@zafu.edu.cn

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