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    不同提取溫度對白鰱魚皮明膠理化性質(zhì)的影響

    2016-11-14 02:56:23汲聰玲陸劍鋒姜紹通
    食品科學 2016年9期
    關(guān)鍵詞:魚皮明膠膠原蛋白

    汲聰玲,陸劍鋒,呂 順,姜紹通,林 琳*

    (合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院,安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽 合肥 230009)

    不同提取溫度對白鰱魚皮明膠理化性質(zhì)的影響

    汲聰玲,陸劍鋒,呂 順,姜紹通,林 琳*

    (合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院,安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽 合肥 230009)

    本實驗以白鰱魚皮為原料提取魚皮明膠,考察不同提取溫度(30、50、70、90、100 ℃)對魚皮明膠得率和理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明:不同溫度條件下提取的魚皮明膠的紫外吸收峰均在波長218 nm左右;明膠提取率在提取溫度為90 ℃時最大,為(86.91±0.98)%;50 ℃條件下提取的魚皮明膠的凝膠強度最大,為(896.75±117.03)g;聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜顯示,30、50 ℃條件下提取的魚皮明膠由α1、α2、β 3 條肽鏈組成,70、90、100 ℃條件下提取的魚皮明膠由于明膠分子的熱降解,電泳條帶不明顯;30、50、70、90、100 ℃條件下提取的魚皮明膠的熱變性溫度分別為(97.88±2.65)、(108.66±0.43)、(106.48±3.33)、(100.27±2.37)、(99.56±0.37)℃;提取溫度越高,明膠的G''和G'值越小、流變性能越差。

    提取溫度;明膠;產(chǎn)率;凝膠強度;流變特性

    明膠是由動物結(jié)締組織中的膠原蛋白大分子在一定的條件下引起氫鍵或靜電性鍵斷裂,膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)解體,互相纏繞的鏈松開后得到的產(chǎn)物[1]。膠原蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z的過程包含兩部分:一是熱變性過程,即膠原蛋白受熱導致氫鍵或靜電性鍵斷裂,螺旋結(jié)構(gòu)解鏈形成許多無規(guī)則水溶性線團;二是交聯(lián)的水解過程,即在酸、堿、酶的作用下,膠原蛋白分子中的交聯(lián)鍵部分斷裂,形成明膠分子,此過程受提取溫度、pH值等條件的影響[2]。

    鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)是我國四大淡水魚之一,產(chǎn)量位居淡水養(yǎng)殖魚類的第二位。魚皮中含有豐富的蛋白質(zhì),其中膠原蛋白含量占粗蛋白的 80%左右[3]。利用魚皮作為生產(chǎn)明膠的原材料不僅可以節(jié)約資源、減少環(huán)境污染,還可以避免哺乳動物明膠潛在的安全隱患及宗教限制。魚皮明膠的黏度和分子質(zhì)量很接近哺乳動物明膠;但是魚皮明膠的亞氨酸含量低于哺乳動物明膠,導致魚皮明膠的熱變性溫度低于哺乳動物明膠,這使得魚皮明膠的在市場上應(yīng)用有一定的限制[4-5]。

    明膠生產(chǎn)工藝有酸法(A型)、堿法(B型)、酸堿法,還有極少數(shù)采用酶法[6]。由于魚類明膠的等電點與哺乳動物明膠不同,魚類明膠適合用酸法生產(chǎn)。明膠提取過程中,溫度是一個重要的參數(shù),溫度過低,提取效率低,而溫度過高又會影響明膠的特性。Kaewruang等[7]研究表明65 ℃或75 ℃對單角革鲀(Aluterus monoceros)皮明膠的提取效果較好。本實驗以白鰱魚皮為原料,研究提取溫度對明膠的紫外吸收、得率(gelatin recovery,GR)、凝膠強度(gel strength,GS)、分子質(zhì)量、熱變性溫度、流變特性等性質(zhì)的影響,為鰱魚皮明膠的生產(chǎn)提供依據(jù)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮮活鰱魚購于合肥周谷堆農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場,平均質(zhì)量(1.0±0.5) kg。鮮活鰱魚宰殺后,將魚皮與魚肉剝離,魚皮去鱗、去黏連碎肉后,沖洗干凈,用濾紙吸干水分,將瀝干的魚皮剪成小片(5 mm×5 mm),放入保鮮袋中于-20 ℃凍藏備用。

    異丙醇 天津市富宇精細化工有限公司;對甲氨基苯甲醛 上海埃彼化學試劑有限公司;高氯酸天津市鑫源化工有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白質(zhì)標準品 美國Bio-Rad公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV22102 PC型紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;CT15RT 臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;DISICOVERY HR-3 流變儀美國TA公司;DYY-11 型電泳儀 北京市六一儀器廠;90-3型雙向定時恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠有限公司;FD-1A型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;VP-DSC微量差示掃描量熱儀 上海和晟儀器科技有限公司;Texture Analyzer物性測試儀美國FTC公司。

    1.3 方法

    1.3.1 魚皮預處理

    脫脂:將魚皮樣品解凍,水洗干凈后,用體積分數(shù)20%異丙醇4 ℃萃取24 h,去除脂肪類物質(zhì)。

    去雜蛋白:將脫脂后的魚皮加入質(zhì)量分數(shù)5% NaCl溶液(1∶20,m/V),于4 ℃條件下連續(xù)攪拌24 h,用尼龍紗過濾,用蒸餾水(1∶20,m/V)水洗樣品并過濾,重復3 次,去除魚皮中的非膠原蛋白。

    1.3.2 魚皮明膠的提取工藝流程

    預處理的鰱魚皮→鹽酸(0.2 mol/L)溶液浸泡45 min→水洗至pH 4~5→ 50 ℃水浴抽提5 h→紗布過濾→離心(10 000 r/min,5 min)→冷凍干燥→成品明膠(水分含量<14%)

    1.3.3 魚皮明膠理化性質(zhì)的測定

    1.3.3.1 明膠得率的計算

    以魚皮及明膠中羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量計算明膠得率。采用Woessner法[8]測定HYP含量:稱取2 mg左右待測樣品于安瓿管中,加入1 mL 6 mol/L的HCl,真空封管,在 130 ℃條件下水解3 h。消化后將消化液稀釋定容至100 mL。取2 mL稀釋液,加入1 mL氯胺T反應(yīng)20 min,加入1 mL 37%的高氯酸反應(yīng)5 min,加入1 mL 20%對甲氨基苯甲醛60 ℃反應(yīng)20 min,冷卻5 min。1 h內(nèi)在557 nm波長處測吸光度。根據(jù)羥脯氨酸標準曲線計算樣品中HYP的含量。按下式計算明膠得率(gelatin recovery,GR)。

    1.3.3.2 紫外吸收光譜掃描

    魚皮明膠的紫外吸收光譜掃描參考陳小雷[9]的方法并作適當修改。取適量冷凍干燥的明膠樣品,配制成質(zhì)量濃度為0.1~0.5 mg/mL的明膠溶液,以蒸餾水作參比。在190~400 nm波長范圍內(nèi)用雙光束紫外分光光度計對明膠溶液進行紫外掃描,分辨率為0.5 nm。

    1.3.3.3 凝膠強度(gel strength,GS)的測定

    配制質(zhì)量分數(shù)6.67%的明膠溶液,60 ℃水浴使明膠溶解,取出在7 ℃條件下放置成熟16~18 h,用物性測定儀進行測定,測定條件參數(shù)為:NO-P/0.5探頭,下壓高度為4 mm,下壓速率1 mm/s。探頭下壓到4 mm時,凝膠對探頭的反作用力(g)達到最大值,這個最大反作用力即為測定的凝膠強度(g)。每組樣品測4 個平行。

    1.3.3.4 SDS-PAGE分析方法

    參考陳小雷[9]的方法,采用8%分離膠和5%濃縮膠,溴酚藍標記,上樣量為10 μL。樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL,與SDS緩沖液按照1∶4(m/V)混合,使明膠最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。采用直流恒流電源,電壓100 V,電流50 mA,電泳時間約1.5 h,至樣品中的染料遷移至離下端3~5 cm時停止電泳。電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍R-250染色20 min,脫色液浸泡過夜,使用凝膠成像系統(tǒng)對脫色的凝膠進行紫外透射拍照。

    1.3.3.5 熱變性溫度的測定

    魚皮明膠熱變性溫度的測定參考陳小雷[9]的方法并作適當改變。取冷凍干燥的明膠樣品5~8 mg,用坩堝密封后放入微量差示掃描量熱儀中,加熱溫度20~130 ℃,升溫速率為10 ℃/min。每個樣品測定3 次。

    1.3.3.6 魚皮明膠的流變學特性分析

    頻率掃描參考Dileep等[10]的方法,配制質(zhì)量分數(shù)為6.67%的明膠溶液,在20 ℃條件下,剪切頻率從0.01~10 Hz,觀察黏性模量(G″)、彈性模量(G')和損耗角正切(tanδ)隨剪切頻率變化的流變學曲線。

    溫度掃描參考Chandra等[11]的方法并作適當修改,配制質(zhì)量分數(shù)為6.67%的明膠溶液,剪切頻率為1 Hz,掃描溫度5 ℃→45 ℃→5 ℃,觀察黏性模量、彈性模量隨溫度變化的流變學曲線。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 提取溫度對魚皮明膠得率的影響

    明膠得率是明膠制備過程中的一個重要指標,選擇合適的提取溫度對明膠提取非常重要。不同提取溫度對白鰱魚皮明膠提取得率的影響如圖1所示。提取溫度對GR有顯著影響(P<0.05),GR隨提取溫度的升高先增大后減小,在30~90 ℃范圍內(nèi),提取溫度升高GR增大,在90 ℃時達到最大值(86.91±0.98)%,當提取溫度高于90 ℃時,繼續(xù)升高溫度,GR減小。

    膠原蛋白溶液受熱轉(zhuǎn)變成一種膠狀溶液,在合適濃度和溫度等條件下可以發(fā)生膠凝反應(yīng),這就是明膠的生產(chǎn)過程[12]。膠原蛋白溶液受熱轉(zhuǎn)變成明膠的過程伴隨著分子內(nèi)及分子間交聯(lián)鍵的斷裂[13]。隨著溫度升高,作用力增大,膠原分子內(nèi)及分子間的化學鍵斷裂的更多、更徹底,使得明膠分子更容易從皮膚組織中游離出來,溶解到水溶液中,但當溫度過高時,熱力作用會導致明膠分子進一步斷裂為更小的分子[13],因而使GR降低。

    2.2 不同提取溫度對魚皮明膠的紫外吸收光譜的影響

    不同提取溫度對白鰱魚皮明膠溶液的紫外吸收光譜的影響如圖2所示。不同提取溫度下提取的明膠溶液的紫外吸收光譜與陳小雷[9]、Chandra[11]等的結(jié)果類似。明膠溶液的紫外吸收峰都在218 nm左右,證明明膠肽鏈分子中存在酰胺鍵[11]。大多數(shù)蛋白質(zhì)中存在一些芳香族氨基酸殘基,如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,所以這些蛋白質(zhì)溶液在波長270~280 nm處存在紫外吸收峰。但是明膠分子中一般不包含這些芳香族氨基酸殘基,所以在波長270~280 nm處沒有紫外吸收峰[14],如圖2所示。提取溫度對明膠溶液的紫外吸收光譜影響很小,幾種明膠的紫外吸收峰的波長位置非常接近,只是峰值大小有微小差別。

    2.3 提取溫度對魚皮明膠凝膠強度的影響

    GS是代表明膠品質(zhì)的重要指標之一,GS的大小不僅與原料種類[4]、提取工藝條件有關(guān)[15],還與明膠的亞氨基酸、羥脯氨酸含量有關(guān)[13]。研究表明,魚明膠的GS一般在0~426 g,牛、豬明膠的GS在200~300 g,而溫水提取的魚明膠的GS會更高一些[16]。

    不同提取溫度對白鰱魚皮明膠GS的影響如圖3所示。方差分析結(jié)果表明,提取溫度對明膠的GS有顯著影響(P<0.05)。由圖3可知,GS隨提取溫度升高先增大后減小,在50 ℃時GS達到最大值(896.75±117.03) g。當提取溫度大于50 ℃時,魚皮明膠的GS呈下降趨勢。明膠分子與水分子在60 ℃水浴中發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián),溫度降低后,明膠溶液形成具有一定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠凝體。明膠分子鏈越長,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越堅固,相應(yīng)的膠凝體的凝膠強度更大[7]。提取溫度在50 ℃以下時,明膠分子鏈較長,明膠溶液形成的膠凝體內(nèi)部分子之間的連接力較大,GS較高;提取溫度高于50 ℃時,明膠分子隨提取溫度升高發(fā)生降解,分子鏈較短,明膠溶液形成的凝膠體內(nèi)部作用力變小,導致凝膠強度降低。

    2.4 提取溫度對魚皮明膠分子質(zhì)量和肽鏈組成的影響

    由圖4可知,明膠分子包含α1、α2、β這3 條鏈,分子質(zhì)量在130~250 kD之間;當提取溫度為30、50 ℃時,明膠分子的結(jié)構(gòu)保持比較完整,特別是50 ℃條件下提取的魚皮明膠,與明膠標準品肽鏈組成非常相似。隨著提取溫度的升高,明膠分子斷裂為更小的片段,分子質(zhì)量降低[13]。從圖中可以看出,在70、90、100 ℃條件下提取的明膠的α1、α2、β這3 條鏈受熱降解,分子質(zhì)量變小,沒有明顯的電泳條帶。因此,提取溫度對明膠的分子質(zhì)量和肽鏈組成有較大影響。

    2.5 提取溫度對魚皮明膠的熱變性溫度的影響

    不同提取溫度條件下所提取的魚皮明膠的微量差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC)掃描曲線如圖5所示。30、50、70、90、100 ℃條件下所提取的明膠的熱變性溫度分別為(97.88±2.65)、(108.66±0.43)、(106.48±3.33)、(100.27±2.37)、(99.56±0.37) ℃。明膠的熱變性溫度就是明膠的玻璃轉(zhuǎn)化溫度[9]。在加熱過程的DSC曲線中的吸熱峰所在的溫度點即為明膠的熱變性溫度,它表示明膠分子的結(jié)構(gòu)由螺旋向卷曲轉(zhuǎn)變[17]。明膠分子的交聯(lián)作用越少,其變性溫度越低[18]。明膠的熱變性溫度由明膠的亞氨基酸的含量來決定,亞氨基酸的含量越高,明膠的三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性就越強,主要是因為脯氨酸和羥脯氨酸的吡咯環(huán)對它們的三級結(jié)構(gòu)的限制和羥脯氨酸的羧基所形成的氫鍵來穩(wěn)定它們的三級結(jié)構(gòu)[19]。從圖中可以看出,50 ℃條件下所提取的魚皮明膠的熱變性溫度最高,提取溫度高于50 ℃時,隨著提取溫度的提高,魚皮明膠的熱變性溫度逐漸降低。這可能是因為溫度高于50 ℃時,隨著提取溫度提高,明膠分子發(fā)生了熱降解作用,從而使明膠溶液內(nèi)部分子交聯(lián)作用小,導致熱變性溫度降低。30 ℃條件下所提取的明膠的熱變性溫度最低,這可能是由于提取溫度較低,魚皮中的明膠沒有被充分提取,最終產(chǎn)品的純度較低,導致其熱變性溫度較低。從SDS-PAGE圖譜上也可以看出30 ℃條件下所提取的明膠純度較低,α鏈和β鏈均不明顯。

    2.6 提取溫度對魚皮明膠的流變學性能的影響

    2.6.1 魚皮明膠的頻率掃描曲線

    不同提取溫度下得到的魚皮明膠的彈性模量(G')、黏性模量(G″)和損耗角正切(tanδ)與剪切頻率的關(guān)系如圖6所示。隨著剪切頻率的增大,不同提取溫度下所提取的魚皮明膠的G'增大,G'的斜率減小。G'斜率變化越小,說明凝膠網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部交聯(lián)越強,凝膠穩(wěn)定性越好[10]。G″和tanδ均隨著剪切頻率增大呈現(xiàn)先降后升的趨勢。tanδ值都在1附近,說明幾種明膠均呈現(xiàn)部分黏性和彈性的流變學性質(zhì)[20]。從圖6還可以看出,不同提取溫度下提取的魚皮明膠的G'、G″及tanδ隨剪切頻率的變化趨勢是相同的。30、50、70 ℃條件下提取的魚皮明膠的G'、G″和tanδ的數(shù)值大小非常接近,90 ℃和100 ℃條件下提取的魚皮明膠的G'和G″的數(shù)值比之前3 組明膠的小很多,而tanδ的數(shù)值大很多。提取溫度升高使明膠分子質(zhì)量減小,導致凝膠網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部交聯(lián)變少,明膠溶液內(nèi)部貯藏的能量變小。

    2.6.2 魚皮明膠的溫度掃描曲線

    不同提取溫度條件下魚皮明膠的黏性模量和彈性模量在加熱和冷卻過程中的變化如圖7所示。G'是指在明膠溶液的彈性結(jié)構(gòu)中儲存的能量,G″表示明膠溶液黏性部分的能量[21]。從圖中可以看出,不同提取溫度對魚皮明膠的G'、G″隨溫度的變化趨勢是相同的。G'和G″在加熱過程中均是降低的,在冷卻過程中均是升高的。溶液溫度在10 ℃以下時G'的值大于G″,此時明膠溶液以彈性為主;溶液溫度較高時明膠溶液以黏性為主,此結(jié)果與陳小雷[9]、Norziah[17]等的研究結(jié)果相似。

    從圖7還可以看出,提取溫度為90、100 ℃時,溫度掃描曲線中G'和G″的斜率比提取溫度為30、50、70 ℃時小。這是因為在膠原蛋白受熱轉(zhuǎn)化成明膠的過程中,連接膠原蛋白肽鏈的化學鍵和部分肽鍵發(fā)生斷裂[22],提取溫度提高,會導致明膠分子的水解,而明膠的水解程度越高,明膠的肽鏈越短[18]。提取溫度升高導致明膠分子的降解,分子內(nèi)部儲能減少,溶液在加熱或冷卻過程中內(nèi)部儲存的能量差減小,G'和G″變化緩慢,因此斜率較小。

    3 結(jié) 論

    本研究比較了不同提取溫度對鰱魚魚皮明膠的得率和理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明,提取溫度對魚皮明膠溶液的紫外吸收影響很小,但是對GR和GS影響顯著(P<0.05)。提取溫度為90 ℃時GR取得最大值為(86.91±0.98)%,而GS在50 ℃時取得最大值(896.75±117.03) g。SDS-PAGE圖譜顯示當提取溫度在30、50 ℃時,所提取的魚皮明膠的結(jié)構(gòu)較完整,由α1、α2、β 3 條肽鏈組成,分子質(zhì)量在130~250 kD之間;當提取溫度高于50 ℃時,明膠分子開始降解成小分子組分,電泳條帶較模糊。不同提取溫度(30、50、70、90、100 ℃)下所提取的魚皮明膠的熱變性溫度分別為(97.88±2.65)、(108.66±0.43)、(106.48±3.33)、(100.27±2.37)、(99.56±0.37)℃。提取溫度通過影響明膠的分子質(zhì)量大小和肽鏈組成從而影響明膠溶液內(nèi)部儲藏能量的大小,繼而對明膠溶液流變性能產(chǎn)生一定的影響。本研究結(jié)果可為鰱魚皮的高值化利用和魚皮明膠的生產(chǎn)提供參考。

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    Effect of Extraction Temperature on Physical and Chemical Properties of Gelatin from Silver Carp Skin

    JI Congling, LU Jianfeng, Lü Shun, JIANG Shaotong, LIN Lin*
    (Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province, College of Food Science and Engineering,Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

    Gelatin was extracted from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) skin, and the physical and chemical characteristics of gelatin extracted at different temperatures (30, 50, 70, 90 and 100 ℃) were compared. The maximum ultraviolet absorption peaks of all gelatin appeared near 218 nm. The maximum gelatin recovery ((86.91 ± 0.98) %) was obtained when extraction was performed at 90 ℃, while the maximum gel strength ((896.75 ± 117.03) g) was obtained when the extraction temperature was 50 ℃. The SDS-PAGE pattern indicated that gelatin extracted at 30 and 50 ℃ contained α1, α2and β chains, while that extracted at 70, 90 and 100 ℃ did not have obvious bands, which was presumably ascribed to heat degradation of gelatin. The thermal denaturation temperatures of the gelatin extracted at 30, 50, 70, 90 and 100 ℃were (97.88 ± 2.65), (108.66 ± 0.43), (106.48 ± 3.33), (100.27 ± 2.37) and (99.56 ± 0.37) ℃, respectively. The higher the extraction temperature was, the smaller the values of G' and G'' were, and the worse rheological properties of gelatin were.

    extraction temperature; gelatin; recovery; gel strength; rheological properties

    10.7506/spkx1002-6630-201609022

    TS254.9

    A

    1002-6630(2016)09-0117-06

    汲聰玲, 陸劍鋒, 呂順, 等. 不同提取溫度對白鰱魚皮明膠理化性質(zhì)的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(9): 117-122. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609022. http://www.spkx.net.cn

    JI Congling, LU Jianfeng, Lü Shun, et al. Effect of extraction temperature on physical and chemical properties of gelatin from silver carp skin[J]. Food Science, 2016, 37(9): 117-122. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609022. http://www.spkx.net.cn

    2015-05-22

    安徽省“115”產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(2012d5t146)

    汲聰玲(1988—),女,碩士研究生,研究方向為食品資源綜合利用。E-mail:2865611490@qq.com

    *通信作者:林琳(1978—),女,副教授,博士,研究方向為水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物綜合利用。E-mail:linlin@hfut.edu.cn

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