淀粉接枝聚醋酸乙烯酯納米粒的制備及其對(duì)蝦青素穩(wěn)定性影響

劉占軍李曉春 耿旭芳 趙 占 趙琳琳

(1.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 063009；2. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710061)

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淀粉接枝聚醋酸乙烯酯納米粒的制備及其對(duì)蝦青素穩(wěn)定性影響

劉占軍1李曉春2耿旭芳1趙 占1趙琳琳1

(1.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 063009；2. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710061)

以二羥基二過(guò)碘酸合鎳(IV)鉀作為引發(fā)劑，引發(fā)醋酸乙烯酯在淀粉上接枝，生成淀粉接枝共聚物。再用三聚磷酸鈉作交聯(lián)劑制備成具有疏水核心、親水表面的納米粒。然后采用透析法，將蝦青素與納米?；旌现瞥晌r青素納米粒。測(cè)定淀粉及接枝共聚物的紅外光譜、納米粒的平均粒徑、粒徑分布、納米粒形態(tài)，并以蝦青素的丙酮溶液作為比較，對(duì)蝦青素納米粒的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在不同條件下，蝦青素納米粒比原料的穩(wěn)定性均有提高。

蝦青素；納米粒；接枝；穩(wěn)定性；聚醋酸乙烯酯

蝦青素(3,3-二羥基-4,4二酮基-β,β-胡蘿卜素)具有很強(qiáng)的抗氧化性能，比β-胡蘿卜素和葉黃素防止紫外光光氧化更有效。其在營(yíng)養(yǎng)食品、化妝品、食品和飼料工業(yè)廣泛應(yīng)用[1]。然而，蝦青素不能在動(dòng)物體內(nèi)合成，必須從飲食獲得。蝦青素分子高度不飽和，很容易被光和氧分解，導(dǎo)致其抗氧化性能的損失，使其應(yīng)用受到了一定的限制[2]。

納米?？梢蕴岣咚幤?、保健品和食品添加劑等產(chǎn)品的水溶性、生物利用度和穩(wěn)定性，通過(guò)將這些物質(zhì)包載于納米粒子內(nèi)部，能夠提高其穩(wěn)定性，最大地發(fā)揮其活性。微/納米包封技術(shù)，如微膠囊包埋技術(shù)、凝聚技術(shù)、納米沉淀、主客體包結(jié)絡(luò)合技術(shù)、超臨界流體技術(shù)、乳化溶劑揮發(fā)技術(shù)已逐漸應(yīng)用于功能性蝦青素制劑的制備[3]。淀粉因其來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生、可完全生物降解，被廣泛用于食品及食品添加劑中[4]，但制備成淀粉納米粒用于食品添加劑的方法如乳液沉淀法[5]和溶液混合法[6]等，制備出的納米粒內(nèi)為非化學(xué)鍵力，穩(wěn)定性能差，負(fù)載的效率也較低。聚醋酸乙烯酯是一種安全、無(wú)毒、無(wú)刺激性，長(zhǎng)期以來(lái)用作眼用膜劑、皮膚控釋劑和植入給藥控釋系統(tǒng)等的藥用高分子材料[7]，將淀粉與聚醋酸乙烯酯接枝得到納米粒，負(fù)載蝦青素，可以發(fā)揮納米材料的特點(diǎn)，提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保存時(shí)間，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

本研究擬采用二羥基二過(guò)碘酸合鎳(IV)鉀為引發(fā)劑[8-9]，在淀粉上接枝聚醋酸乙烯酯，采用透析法，將蝦青素與納米粒混合制成蝦青素納米粒，測(cè)定接枝物的紅外光譜、納米粒的平均粒徑、粒徑分布、納米粒形態(tài)，并以蝦青素的丙酮溶液作為比較，對(duì)蝦青素納米粒的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蝦青素：含量≥95%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

可溶性淀粉：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

引發(fā)劑二羥基二過(guò)碘酸合鎳(IV)鉀：本課題組實(shí)驗(yàn)室自制；

醋酸乙烯酯：含量≥99%，分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，經(jīng)重蒸后使用；

其它試劑：含量≥99%，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

MD10透析袋(截留相對(duì)分子量14 000)：北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

透射電鏡：H600型，日本Hitachi公司；

激光粒度分析儀：Brookhaven 90Plus型，美國(guó)Brookhaven公司；

低溫高速離心機(jī)：BK30型，德國(guó)Sigma公司；

高效液相色譜儀：1100型，美國(guó)Angilent公司；

紅外光譜儀：FTIR-8400型，日本Shimadzu公司；

電子天平：AE240型，瑞士Mettler公司；

光照實(shí)驗(yàn)儀：LS-3000型，北京天星科儀科技公司；

超聲波清洗機(jī)：KQ - 100型，昆山超聲儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉接枝共聚物的制備 制備方法按參考文獻(xiàn)[10]略改進(jìn)，一個(gè)2 000 mL的三頸燒瓶，配備溫度計(jì)、磁力攪拌器通和氮?dú)庋b置，在水浴中進(jìn)行溫度控制。先加入淀粉30 g，蒸餾水870 mL，在攪拌下加熱到90 ℃保持30 min，然后冷卻到35 ℃，并用N2吹泡30 min，以去除體系中的氧氣。加入醋酸乙烯酯30 g后滴加5 mL引發(fā)劑，反應(yīng)在35 ℃條件下持續(xù)5 h，確保反應(yīng)完全。得到的產(chǎn)物反復(fù)用去離子水洗3次除去未反應(yīng)的淀粉，將干燥后的接枝物在索氏提取器中用丙酮提取72 h，除去其中的聚醋酸乙烯酯均聚物。真空冷凍干燥后的產(chǎn)物備用。

1.2.2 空白納米粒的制備 用透析法制備淀粉納米粒[11]。精密稱取接枝聚合物23 mg溶解在16.5 mL DMSO中，持續(xù)攪拌，使之溶解，加入透析膜，用去離子水進(jìn)行透析。透析介質(zhì)在開(kāi)始后3 h，每1 h換一次，之后每5 h更換一次，共透析24 h。得到的納米粒溶液，滴加0.1%三聚磷酸鈉溶液2.5 mL，保持15 min，以使納米粒穩(wěn)定，真空冷凍干燥，備用。

1.2.3 蝦青素納米粒的制備 精密稱淀粉納米粒23 mg溶解在16.5 mL DMSO中，持續(xù)攪拌，使之溶解。取0.17 mg蝦青素溶于4 mL丙酮中，混合后加入透析膜，用去離子水進(jìn)行透析。透析介質(zhì)前3 h，每1 h換一次，之后每5 h更換一次，共透析24 h，得到的蝦青素納米粒溶液。

1.2.4 納米粒的紅外測(cè)定 溴化鉀壓片法制備樣品，掃描范圍400～4 000 cm-1，室溫條件下掃描測(cè)定。

1.2.5 納米粒的粒徑分布 將空白納米粒和蝦青素納米粒的混懸液，分別用去離子水稀釋10倍，室溫散射角為90°條件下，在激光粒度分析儀中測(cè)定納米粒的粒徑。

1.2.6 透射電子顯微鏡(Transmission electron micrographs，TEM)檢測(cè) 在鋪有碳膜的銅網(wǎng)上滴加少量納米粒混懸液，靜置5 min，然后滴加2%磷鎢酸染色，晾干后，在透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)。

1.2.7 蝦青素的測(cè)定 蝦青素的含量測(cè)定改進(jìn)參考文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行：0.5 mL的樣品加入到2 mL二氯甲烷—甲醇(體積比1∶1)的混合液。密閉條件下攪拌15 min，之后在室溫下離心5 min(800×g)。此提取程序重復(fù)2次，混合提取液，之后用濾膜過(guò)濾(4 mm，0.45 μm)，取上清液進(jìn)樣測(cè)定。

色譜條件：色譜柱 Extend-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶二氯甲烷∶乙腈∶水(85∶5∶5∶5)；檢測(cè)波長(zhǎng) 480 nm；流速 1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量 20 μL，以蝦青素濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.2.8 光照條件下蝦青素納米粒的穩(wěn)定性 取10 mL蝦青素納米粒溶液及蝦青素丙酮溶液，濃度均為20 μg/mL，分別置于具塞比色管中，置于LS-3000光照實(shí)驗(yàn)儀，在室溫條件下測(cè)定，調(diào)節(jié)照度為4 000 LX，分別在20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，240 min，進(jìn)行取樣，按1.2.7方法測(cè)定，每個(gè)樣品平行3次。

1.2.9 溫度對(duì)蝦青素納米粒穩(wěn)定性的影響 將蝦青素的丙酮溶液及蝦青素納米粒溶液10 mL，濃度均為20 μg/mL，分裝于具塞比色管中，分別置于30 ℃和50 ℃溫度下避光水浴，分別在1，2，3，4，5，6，7，8 d取樣，按1.2.7方法測(cè)吸光值。每個(gè)樣品平行3次。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 用Orogin 9.0及SPSS 20數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜

由圖1可知，在兩個(gè)譜圖上都有淀粉的特征吸收峰575，765，861 cm-1，淀粉接枝共聚物的譜圖上，在1 250和1 740 cm-1具有醋酸乙烯酯的特征吸收峰，在淀粉的譜圖上沒(méi)有。1 740 cm-1為酯基的C═O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 250 cm-1為O—C伸縮振動(dòng)吸收峰。利用二羥基二過(guò)碘酸合鎳(IV)鉀作為引發(fā)劑，醋酸乙烯酯接枝到淀粉上，使醋酸乙烯酯的C═C雙鍵打開(kāi)，接枝到淀粉分子中大量存在的活潑反應(yīng)基團(tuán)—OH上，生成接枝共聚物[8]。生成接枝共聚物的同時(shí)，在淀粉大分子的骨架上并沒(méi)有引起更大的結(jié)構(gòu)變化。在淀粉接枝共聚物的譜圖上出現(xiàn)的吸收峰說(shuō)明聚醋酸乙烯已經(jīng)接枝到淀粉鏈上。

2.2 納米粒形態(tài)

由圖2可知，制得的空白納米粒，呈現(xiàn)球形或類球形，大小基本均一，粒徑比較均勻規(guī)整，平均粒徑為(80.6±2.1) nm；蝦青素納米粒(圖3)的形態(tài)基本規(guī)整，呈球形或類球形，表面的規(guī)整程度比空白納米粒要差，粒度不均勻，形體大小差別較大，平均粒徑為(163.5±3.4) nm，主要因?yàn)樵谪?fù)載蝦青素的過(guò)程中，每個(gè)空白納米粒與蝦青素的接觸機(jī)會(huì)不同，導(dǎo)致負(fù)載量不同，出現(xiàn)粒徑上的差異[13]。

圖1 紅外光譜

圖2 空白納米粒的透射電鏡照片

2.3 納米粒的粒徑分布

激光粒度分析儀測(cè)得納米粒的粒徑分布圖，空白納米粒(圖4)，平均粒徑為(116.8±2.1) nm，分散系數(shù)為0.118±0.013，可見(jiàn)大多集中分布在平均粒徑附近，極少部分粒徑比較小的納米粒使分散程度變大；蝦青素納米粒的平均粒徑為(201.8±3.3) nm，分散系數(shù)為0.284±0.035，圖5微分分布圖上236 nm附近出現(xiàn)的側(cè)峰，可能是納米粒低程度聚集或不均勻形成的，導(dǎo)致分散程度加大，這和透射電鏡照片看到的情況相符合。另外，粒徑分布圖比電鏡照片得到的尺寸更大，是由于在不同的測(cè)定條件下導(dǎo)致的[14]。

圖3 蝦青素納米粒的透射電鏡照片

圖4 空白納米粒的粒徑分布圖

圖5 蝦青素納米粒的粒徑分布圖

2.4 光照條件下蝦青素納米粒的穩(wěn)定性

由圖6可知，在光射條件下，無(wú)論哪種形式蝦青素都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度逐漸下降。其中，蝦青素丙酮溶液很快發(fā)生質(zhì)變，在4 h后樣品中的成分低至16.66%，主要原因是蝦青素在光直射條件下，分子很容易被激發(fā)，發(fā)生脫氫反應(yīng)，生成類胡蘿卜自由基陽(yáng)離子，而自由基生成后很容易誘發(fā)其他的蝦青素分子發(fā)生質(zhì)變[15]。蝦青素納米粒隨時(shí)間的延長(zhǎng)，所含蝦青素濃度也逐漸降低，但降低的速度小，4 h后成分為39.46%，這主要由于納米粒具有表面與界面效應(yīng)，具有吸收光子能量及吸收部分自由基的特性，減弱了光化學(xué)反應(yīng)[16]。可見(jiàn)，蝦青素負(fù)載于納米粒中，納米粒所具有的吸收光子，減少自由基作用可有效保持蝦青素的穩(wěn)定。

圖6 光照對(duì)穩(wěn)定性的影響

2.5 溫度對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各種形式的蝦青素在一定的溫度條件下，都隨時(shí)間的延長(zhǎng)，含量逐漸降低。蝦青素丙酮溶液中含量下降較快，30 ℃和50 ℃恒溫避光下，貯存8 d時(shí)含量分別為87.55%和75.35%；溫度越高，含量越低，表明溫度對(duì)蝦青素的穩(wěn)定性影響較大，增加的溫度促進(jìn)蝦青素的分解[17]。在相同的條件下納米粒中的蝦青素貯存8 d時(shí)含量分別為92.06%和83.94%，其穩(wěn)定程度得到顯著改善(P<0.05)，主要是納米粒所具有的納米效應(yīng)，使納米粒得到了有效的保護(hù)[17]。蝦青素受熱分解是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，但有兩個(gè)主要的反應(yīng)：異構(gòu)化和氧化[18]，溫度升高使其異構(gòu)化和氧化加劇。納米粒具有較大的比表面積，具有量子尺寸效應(yīng)，吸收相應(yīng)的熱能易于釋放給溶劑或介質(zhì)，減小了負(fù)載其中的蝦青素的熱效應(yīng)。另外，納米粒的包埋作用，使蝦青素減少與氧氣的相互作用，阻礙了氧化反應(yīng)，這也是提高其穩(wěn)定性的原因[19]。

圖7 溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用二羥基二過(guò)碘酸合鎳(IV)鉀作為引發(fā)劑，在淀粉上接枝聚醋酸乙烯酯，制備納米粒，反應(yīng)條件溫和，可以得到形態(tài)均勻的納米粒，負(fù)載蝦青素后，納米粒形態(tài)基本規(guī)則，平均粒徑為(163.5±3.4) nm，分散系數(shù)為0.284±0.035。制備的蝦青素納米粒，因納米效應(yīng)和包埋因素影響，在光照和升高溫度條件下，都比蝦青素丙酮溶液穩(wěn)定。在光照條件下，4 h后成分仍能達(dá)到39.46%；30 ℃和50 ℃恒溫避光下，貯存8 d時(shí)含量分別為92.06%和83.94%，其穩(wěn)定性程度比原料得到顯著改善。因淀粉資源豐富，成本低，有利于開(kāi)發(fā)制備蝦青素相關(guān)產(chǎn)品，延長(zhǎng)其存貯時(shí)間及提高產(chǎn)品的質(zhì)量。采用本試驗(yàn)制備方法，納米粒內(nèi)為化學(xué)鍵力，比乳液沉淀法和溶液混合法方法制備的納米粒穩(wěn)定。將該蝦青素納米粒應(yīng)用于食品或食品添加劑，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性能的研究還在進(jìn)一步探討中。另外，將淀粉接枝聚酸酸乙烯酯納米粒應(yīng)用于其他食品和食品添加劑，也是繼續(xù)研究的一個(gè)內(nèi)容。

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Preparation of starch-graft-poly (vinyl acetate) nanoparticles and effect on the stability of astaxanthin

LIU Zhan-jun1LIXiao-chun2GENGXu-fang1ZHAOZan1ZHAOLin-lin1

(1.CollegeofPharmaceuticalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China; 2.ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Xi’an,Shaanxi710061,China)

The starch-graft-poly (vinyl acetate) was prepared using potassium diperiodatonickelate (IV) as an initiator. Afterwards, it was produced into nanoparticles containing hydrophobic core and hydrophilic surface in water, using sodium tripolyphosphate as crosslinking agent. Then the nanoparticles loaded with astaxanthin were made by the dialysis method. IR spectra of the starch and the graft copolymer, the average particle size, particle size distribution, and morphology of the nanoparticles loaded with astaxanthin were measured. The stability of nanoparticles loaded with astaxanthin was determined with an acetone solution of astaxanthin as control. The results showed that the stability of the nanoparticles loaded with astaxanthin was improved under several different conditions.

astaxanthin; nanoparticle; graft; stability; poly(vinyl acetate)

河北省自然科學(xué)基金——石藥集團(tuán)醫(yī)藥聯(lián)合研究基金優(yōu)先資助項(xiàng)目(編號(hào)：H2013209192)

劉占軍(1967—)，男，華北理工大學(xué)副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。E-mail：liuzhanjun815@163.com

2016—04—04