熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH、SDH和CCO活性的影響

杜小正,王金海,秦曉光,方曉麗,張小江

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熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH、SDH和CCO活性的影響

杜小正1,王金海2,秦曉光1,方曉麗1,張小江1

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州730000;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,蘭州730000)

目的 觀察熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)機(jī)體能量代謝酶的調(diào)節(jié)作用,初步解析熱補(bǔ)針?lè)ā叭帷钡淖饔脵C(jī)制。方法 將40只青紫藍(lán)家兔隨機(jī)分為正常組、模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM。除正常組外,采用卵蛋白誘導(dǎo)法和低溫冷凍法對(duì)其他4組家兔進(jìn)行RA寒證模型復(fù)制。造模成功后第2天,正常組和模型組與其他針刺組相同方法抓取與固定(捆綁)1次/d,30 min/次。平補(bǔ)平瀉組施以平補(bǔ)平瀉法,捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組施以捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法,熱補(bǔ)針?lè)ńM施以熱補(bǔ)法,每次操作1 min,留針30 min/次,1次/d,共7 d。觀察治療前后RA家兔膝關(guān)節(jié)周徑和關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片炎癥積分的變化;干預(yù)結(jié)束后處死家兔,快速分離關(guān)節(jié)滑膜,冰凍切片,借助組織化學(xué)染色技術(shù)觀察膝關(guān)節(jié)滑膜組織乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和細(xì)胞色素氧化酶(CCO)活性改變。結(jié)果 針刺干預(yù)后,平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組、熱補(bǔ)針?lè)ńM都能減少RA家兔膝關(guān)節(jié)周徑,但熱補(bǔ)針?lè)ńM對(duì)減少RA家兔的膝關(guān)節(jié)周徑作用優(yōu)于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(＜0.05);熱補(bǔ)針?lè)ńM對(duì)減少RA家兔的關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片炎癥積分方面,也優(yōu)于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組。模型組滑膜LDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比顯著高于正常組(＜0.05);平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM滑膜LDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比均顯著低于模型組(＜0.05);熱補(bǔ)針?lè)ńMLDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比均顯著低于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(＜0.05)。與正常組比較,模型組家兔關(guān)節(jié)滑膜SDH、CCO活性顯著增高(＜0.05)。平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM家兔滑膜SDH和CCO積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比均顯著高于模型組(＜0.05);熱補(bǔ)針?lè)ńMSDH和CCO積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比顯著高于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(＜0.05)。結(jié)論 熱補(bǔ)針?lè)ㄖ委烺A療效確切,可增強(qiáng)RA模型家兔SDH、CCO活性,從而增強(qiáng)有氧代謝,使機(jī)體局部產(chǎn)生更多的能量,這可能是熱補(bǔ)針?lè)ā叭帷钡目赡軝C(jī)制之一。

針刺補(bǔ)法;關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)濕;乳酸脫氫酶;琥珀酸脫氫酶;細(xì)胞色素氧化酶

《針灸大成·三衢楊氏補(bǔ)瀉》:“燒山火,能除寒,三進(jìn)一退熱涌涌……”“進(jìn)火針,初進(jìn)一分……退三退,進(jìn)三進(jìn)……自然熱矣?！闭f(shuō)明這兩種復(fù)式針刺手法不僅能夠補(bǔ)益正氣,而且可以產(chǎn)生熱感。熱補(bǔ)針?lè)ㄊ青嵷沽?、鄭魁山?jiǎn)化燒山火手法和進(jìn)火補(bǔ)法所形成的一種復(fù)式針刺手法,操作相對(duì)簡(jiǎn)便,具有溫陽(yáng)散寒的作用,臨床證實(shí)能使患者局部產(chǎn)生熱感[1]。課題組前期的研究[2-5]表明熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)模型家兔的鎮(zhèn)痛效應(yīng)優(yōu)于臨床常用的平補(bǔ)平瀉法,證實(shí)了熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA具有治療作用,并且證實(shí)與腦脊液中b-EP、CCK-8和關(guān)節(jié)局部組織中b-EP、PGE2和LEK的變化有關(guān)。但是,這些研究均是從疾病疼痛和鎮(zhèn)痛相關(guān)的某些微觀指標(biāo)這一層面闡釋了其機(jī)理,而未能體現(xiàn)熱補(bǔ)針?lè)ㄗ鳛椤叭帷笔址ǖ淖饔锰攸c(diǎn),尚缺乏其對(duì)機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)的分析研究,所以,還不足以揭示熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA的作用機(jī)制。

因此,本實(shí)驗(yàn)選擇RA寒證模型家兔為研究對(duì)象,觀察熱補(bǔ)針?lè)?、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法和平補(bǔ)平瀉法三種針刺手法對(duì)能量代謝相關(guān)酶乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和細(xì)胞色素氧化酶(CCO)的影響,分析比較這三種手法的作用差異,初步解析熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA家兔能量代謝的調(diào)節(jié)作用,揭示熱補(bǔ)針?lè)ā叭帷钡淖饔脵C(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康2.5月齡普通級(jí)雄性青紫藍(lán)家兔40只,購(gòu)于蘭州生物制品研究所,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(甘)2012- 0001,體重(2.5±0.5)kg,動(dòng)物購(gòu)回后在蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SYXK2007-007)飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20±2)℃,相對(duì)濕度(50±10)%,按晝夜節(jié)律自然照明,自由進(jìn)食和飲水(自來(lái)水),每星期稱量1次體重。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為正常組、模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM,每組8只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品、試劑和儀器

弗氏完全佐劑(Sigma公司生產(chǎn),批號(hào)120428)、卵蛋白干粉(上海伯奧生物科技有限公司,批號(hào)120513)、硫化鈉(上?；瘜W(xué)試劑二廠,批號(hào)120511)、華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,規(guī)格為0.25 mm×40 mm),LDH、SDH和CCO染色試劑盒(上海榕柏生物技術(shù)有限公司,批號(hào)20120569)、HANGPINGJAZO03精密天平(上海精密儀器公司)、Tissue-Tek TEC全自動(dòng)組織包埋機(jī)(日本)、CM1900冰凍切片機(jī)(德國(guó))、OLYMPUS 51TR-32FB3-E01光學(xué)顯微鏡(日本)。

1.3 造模方法

以卵蛋白誘導(dǎo)的方法和低溫冷凍法進(jìn)行RA寒證模型復(fù)制[6-7],即在實(shí)驗(yàn)開始前3天,用硫化鈉和蒸餾水配制成的8%硫化鈉作為脫毛劑,脫掉家兔肩背部提前選定的6個(gè)點(diǎn)和雙后腿膝關(guān)節(jié)周圍的毛。將4 mg/mL的卵蛋白溶液和等量的弗氏完全佐劑(CFA)混合液每個(gè)點(diǎn)皮下注射0.2 mL。兩星期后再以同樣的方法、劑量每點(diǎn)重復(fù)皮下注射1次。第2次免疫完成后6 d,將預(yù)先配制好的20 mg/mL卵蛋白生理鹽水溶液向膝關(guān)節(jié)內(nèi)分別注入0.4 mL。在24 h之內(nèi)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫觸痛,表明模型復(fù)制成功。在模型復(fù)制成功后第2天,用70%乙醇消毒兩后腿足,上、下、左、右圍置冰袋(3份冰＋1份結(jié)晶氯化鈣,粉碎混合,溫度降至零下20～25℃)冷凍1.5 h,在45℃溫水中復(fù)溫5 min(室溫12℃),共冷凍1次。冷凍后14 d,家兔表現(xiàn)為精神萎糜不振,兩后肢匍伏跛行,膝關(guān)節(jié)腫脹,周徑明顯大于對(duì)照組,局部青紫,皮溫不高,表示成功建立RA寒證模型。

1.4 處理方法

正常組(=8):不予任何處理,僅每日與針刺組同時(shí)給予捆綁和抓取刺激1次。

模型組(=8):造模成功后不予任何處理,僅每日與針刺組同時(shí)給予捆綁和抓取刺激1次。

平補(bǔ)平瀉組(=8):造模成功后用兔臺(tái)固定,以2%碘酒、75%乙醇消毒后,將華佗牌針灸針(0.25 mm× 40 mm)90°直刺刺入足三里穴內(nèi)8 mm,施以平補(bǔ)平瀉法1 min,留針30 min/次,1次/d,共7 d。平補(bǔ)平瀉法操作方法參照《刺法灸法學(xué)》[8],針刺得氣后,施以前后均勻捻轉(zhuǎn),指力均勻,角度180°～360°,頻率60～90轉(zhuǎn)/min,反復(fù)操作1 min。

捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(=8):造模成功后用兔臺(tái)固定,以2%碘酒、75%乙醇消毒后,將華佗牌針灸針(0.25 mm× 40 mm)90°直刺刺入足三里穴內(nèi)8 mm,施以捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法1 min,留針30 min/次,1次/d,共7 d。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法操作方法參照《刺法灸法學(xué)》[8],針刺得氣后,在針下得氣處小幅度前后捻轉(zhuǎn)針體(角度180°～360°,頻率60～90轉(zhuǎn)/min),拇指向前左轉(zhuǎn)時(shí)用力重,指力沉重向下;拇指向后右轉(zhuǎn)還原時(shí)用力輕,反復(fù)操作1 min。

熱補(bǔ)針?lè)ńM(=8):造模成功后用兔臺(tái)固定,以2%碘酒、75%乙醇消毒后,將華佗牌針灸針(0.25 mm× 40 mm)90°直刺刺入足三里穴內(nèi)8 mm,施以熱補(bǔ)法1 min,留針30 min/次,1次/d,共7 d。熱補(bǔ)針?lè)ú僮鲄⒄铡多嵤厢樉娜穂1],操作者左手拇指緊按穴位,右手持針刺入穴內(nèi)8～12 mm,針刺得氣后,左手加重壓力,右手拇指向前連續(xù)捻按5次;待針下沉緊后針尖拉著有感應(yīng)的部位,連續(xù)重插輕提5次;拇指再向前連續(xù)捻按5次,反復(fù)操作1 min,最后使針下沉緊,留針30 min。

家兔足三里穴取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]家兔常用針灸穴位定位標(biāo)準(zhǔn)并以比較解剖學(xué)為依據(jù)定位。

1.5 膝關(guān)節(jié)周徑

造模成功后第2天和干預(yù)7 d后,在已褪毛的家兔后肢膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)外髁用記號(hào)筆標(biāo)記好固定的兩點(diǎn),用千分卡尺和皮尺在固定點(diǎn)測(cè)量膝關(guān)節(jié)周徑,觀察實(shí)驗(yàn)前后關(guān)節(jié)周徑之間的變化。

1.6 滑膜組織病理切片炎癥積分

滑膜病理切片炎性反應(yīng)程度為4個(gè)級(jí)別,0分為正?；?1分為少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);2分為大量粒細(xì)胞浸潤(rùn)、少量血管增生;3分為滑膜血管擴(kuò)張、增生,滑膜絨毛增生變厚。干預(yù)7 d后比較各組間滑膜組織病理切片炎癥積分。

1.7 標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測(cè)

組織切片制備:采用組織化學(xué)染色法觀察組織LDH、SDH和CCO。將家兔處死,迅速采取關(guān)節(jié)滑膜組織。恒凍箱切片機(jī)切片,厚6mm,貼于蓋玻片上風(fēng)干。LDH、SDH和CCO染色嚴(yán)格按照染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行制備。

組織切片定量分析:組織切片經(jīng)Image pro圖像分析系統(tǒng)對(duì)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的LDH、SDH和CCO陽(yáng)性沉淀的圖像分析。計(jì)算機(jī)軟件分析[Pixel2]表示像素平方,主要用于計(jì)算酶染色陽(yáng)性圖像面積,Areasum[Pixel2]表示陽(yáng)性總面積;面積百分比是關(guān)鍵性指標(biāo),表示陽(yáng)性面積占整個(gè)圖片百分?jǐn)?shù),反映酶相對(duì)活性強(qiáng)度;積分光度則是通過(guò)酶染色的深淺程度來(lái)體現(xiàn)酶活性的大小。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)均用SPSS for windows 18.0軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間均數(shù)比較用單因素方差分析,兩兩比較采用法,＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)周徑

表1顯示,針刺干預(yù)后,平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組、熱補(bǔ)針?lè)ńM都能減少RA家兔膝關(guān)節(jié)周徑(＜0.05),但熱補(bǔ)針?lè)ńM減少RA家兔的膝關(guān)節(jié)周徑作用優(yōu)于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(＜0.05)。

表1 各組家兔實(shí)驗(yàn)前后膝關(guān)節(jié)周徑變化比較 (±s,cm)

表1 各組家兔實(shí)驗(yàn)前后膝關(guān)節(jié)周徑變化比較 (±s,cm)

組別n造模后干預(yù)后 正常組812.66±0.2312.65±0.19 模型組813.28±0.3113.27±0.25 平補(bǔ)平瀉組813.05±0.5412.90±0.411)3) 捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組813.17±0.4612.92±0.381)2)3) 熱補(bǔ)針?lè)ńM813.24±0.3612.75±0.571)2)

注:與造模后比較1)＜0.05;與平補(bǔ)平瀉組比較2)＜0.05;與熱補(bǔ)針?lè)ńM比較3)＜0.05

2.2 滑膜組織病理切片炎癥積分

表2示,熱補(bǔ)針?lè)ńM對(duì)減少RA家兔的關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片炎癥積分優(yōu)于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組。

表2 各組家兔干預(yù)后關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片炎癥積分比較 (±s,分)

表2 各組家兔干預(yù)后關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片炎癥積分比較 (±s,分)

組別n3分2分1分0分 正常組80008 模型組87100 平補(bǔ)平瀉組86200 捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組85300 熱補(bǔ)針?lè)ńM82141

2.3 熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH活性的影響

表3、圖1顯示,模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM家兔滑膜LDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比均顯著高于正常組(＜0.05);與模型組比較,平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM滑膜LDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比均顯著降低(＜0.05),但仍高于正常組(＜0.05);熱補(bǔ)針?lè)ńMLDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比均顯著低于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(＜0.05)。

表3 各組家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH活性變化比較 (±s)

表3 各組家兔關(guān)節(jié)滑膜LDH活性變化比較 (±s)

組別n積分光度(OD值)陽(yáng)性總面積(μm2)面積百分比(%) 正常組847.91±4.903119.88±316.5214.33±3.42 模型組870.35±4.991)4564.75±352.161)29.84±5.761) 平補(bǔ)平瀉組864.38±4.862)4176.25±264.532)25.55±3.682) 捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組859.11±4.352)3792.75±319.612)3)21.49±2.792)3) 熱補(bǔ)針?lè)ńM853.07±4.682)3)4)3451.38±333.392)3)4)17.49±2.562)3)4)

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與平補(bǔ)平瀉組比較3)＜0.05;與捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組比較4)＜0.05

注:A正常組,B模型組,C平補(bǔ)平瀉組,D捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組,E熱補(bǔ)針?lè)ńM

2.4 熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA家兔關(guān)節(jié)滑膜SDH活性的影響

表4、圖2顯示,模型組家兔滑膜SDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比顯著高于正常組(＜0.05),說(shuō)明RA自身可提高機(jī)體SDH活性;平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM家兔滑膜SDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比均顯著高于模型組(＜0.05);熱補(bǔ)針?lè)ńMSDH積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比顯著高于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(＜0.05)。

表4 各組家兔關(guān)節(jié)滑膜SDH變化 (±s)

表4 各組家兔關(guān)節(jié)滑膜SDH變化 (±s)

組別n積分光度(OD值)陽(yáng)性總面積(μm2)面積百分比(%) 正常組810.50±2.433627.88±388.6410.70±2.16 模型組818.64±4.611)4202.13±460.741)17.24±4.491) 平補(bǔ)平瀉組825.96±4.642)4856.50±474.782)22.73±5.202) 捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組831.81±5.362)3)5564.75±620.762)28.39±4.992)3) 熱補(bǔ)針?lè)ńM837.22±6.002)3)4)6645.00±765.142)3)4)34.25±5.572)3)4)

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與平補(bǔ)平瀉組比較3)＜0.05;與捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組比較4)＜0.05

注:A正常組,B模型組,C平補(bǔ)平瀉組,D捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組,E熱補(bǔ)針?lè)ńM

2.5 熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA家兔關(guān)節(jié)滑膜CCO活性的影響

表5、圖3顯示,模型組CCO積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比顯著高于正常組(＜0.05);平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńMCCO積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比顯著高于模型組(＜0.05);熱補(bǔ)針?lè)ńMCCO積分光度、陽(yáng)性總面積、面積百分比顯著高于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(＜0.05)。

表5 各組家兔滑膜CCO活性變化 (±s)

表5 各組家兔滑膜CCO活性變化 (±s)

組別n積分光度(OD值)陽(yáng)性總面積(μm2)面積百分比(%) 正常組858.55±5.863294.75±344.5814.26±3.01 模型組868.98±7.461)3863.25±283.781)18.22±3.011) 平補(bǔ)平瀉組876.79±4.472)4368.75±450.012)22.35±4.112) 捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組884.63±4.902)3)5071.75±489.382)3)26.40±4.522)3) 熱補(bǔ)針?lè)ńM896.42±9.822)3)4)6307.75±677.822)3)4)31.13±3.822)3)4)

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與平補(bǔ)平瀉組比較3)＜0.05;與捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組比較4)＜0.05

3 討論

熱補(bǔ)針?lè)ㄊ呛?jiǎn)化燒山火和進(jìn)火補(bǔ)而來(lái)的,臨床證實(shí)熱補(bǔ)針?lè)軌蚴箼C(jī)體局部產(chǎn)生熱感[10-12],具有“取熱”效應(yīng),說(shuō)明機(jī)體局部的能量代謝發(fā)生了變化。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇與能量代謝相關(guān)的酶SDH和CCO作為指標(biāo),觀察熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA模型家兔能量代謝的影響。

卵蛋白誘導(dǎo)的RA模型有滑膜組織大量增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程,能很好地模擬人RA病理過(guò)程,而且病理過(guò)程至少持續(xù)8星期,在家兔等較大型動(dòng)物上能夠復(fù)制,是研究RA理想的模型[13]。但是,卵蛋白誘導(dǎo)的RA模型關(guān)節(jié)局部始終紅腫熱痛,能量代謝異常活躍,類似于人RA發(fā)病早期的“熱痹”。冷凍一次后,關(guān)節(jié)局部皮溫逐漸降低,血沉加快,紅細(xì)胞壓積下降,纖維蛋白原增加,肢體血流緩慢,流量減少,與人RA后期的“寒痹”和“風(fēng)寒濕阻證”相似[7]。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),凍后第14天,皮溫降至正常或者稍低,說(shuō)明低溫應(yīng)激能使機(jī)體能量代謝下降。中醫(yī)所謂“寒”就是低溫環(huán)境刺激,這種單純疾病動(dòng)物模型過(guò)程中融入中醫(yī)病因因素,既符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)RA病理特點(diǎn),又體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的特色。

LDH是糖無(wú)氧酵解的關(guān)鍵酶,廣泛存在于組織細(xì)胞內(nèi),主要作用是催化乳酸與丙酮酸之間的反應(yīng),葡萄糖通過(guò)無(wú)氧酵解最后被LDH催化生成乳酸。機(jī)體在病理?xiàng)l件下,LDH活性增強(qiáng),催化乳酸氧化,這是機(jī)體自動(dòng)調(diào)節(jié)的保護(hù)性代償機(jī)制。當(dāng)滑膜組織缺氧時(shí),滑膜細(xì)胞生理功能被破壞,發(fā)生一系列病理生化變化,滑膜細(xì)胞變性釋放出LDH,細(xì)胞被破壞越多,LDH活性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM家兔滑膜LDH活性均顯著高于正常組。這是由于RA造模成功后,抗原刺激滑膜細(xì)胞活化增殖,促使滑膜處于炎癥狀態(tài),釋放LDH增多,丙酮酸被LDH催化產(chǎn)生大量乳酸,乳酸在體內(nèi)的大量堆積又會(huì)導(dǎo)致機(jī)體疲乏無(wú)力。這一現(xiàn)象與本實(shí)驗(yàn)造模成功后,家兔精神萎靡、活動(dòng)量減少相符合。說(shuō)明RA模型家兔疲勞,活動(dòng)減少,精神欠佳等表現(xiàn)不僅與產(chǎn)生的白介素、花生四烯酸等炎性介質(zhì)相關(guān),也可能與炎癥刺激后LDH活性增強(qiáng),產(chǎn)生大量乳酸有關(guān)。針刺治療1星期后,平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM滑膜LDH活性均向正常水平恢復(fù),說(shuō)明各種針刺方法均可使LDH活性降低,這可能是因?yàn)獒槾炭梢栽鰪?qiáng)局部血液循環(huán),從而增強(qiáng)了供氧能力,使機(jī)體局部組織缺氧狀態(tài)得到改善,細(xì)胞有氧呼吸增強(qiáng),相應(yīng)的無(wú)氧呼吸開始減弱,LDH活性也逐漸降低。但是熱補(bǔ)針?lè)ń档蚅DH活性要優(yōu)于平補(bǔ)平瀉法和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法。研究發(fā)現(xiàn)[14]疲勞大鼠骨骼肌中LDH含量明顯增高,通過(guò)服用抗疲勞中藥能明顯降低血清LDH[15],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

SDH存在于所有有氧呼吸細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜上,為有氧代謝-三羧酸循環(huán)的限速酶和線粒體的標(biāo)志酶,其活性可直接影響琥珀酸氧化呼吸鏈反應(yīng),與細(xì)胞能量供應(yīng)密切相關(guān)[16],可作為反映和評(píng)價(jià)三羧酸循環(huán)的強(qiáng)弱標(biāo)準(zhǔn)。CCO是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的關(guān)鍵酶,可催化還原型細(xì)胞色素C氧化,并將電子轉(zhuǎn)移到氧分子形成水。這一反應(yīng)伴隨著氧化磷酸化過(guò)程并產(chǎn)生ATP[17],其活性的改變直接影響著細(xì)胞能量代謝的過(guò)程,進(jìn)而影響整個(gè)滑膜細(xì)胞功能,線粒體中CCO表達(dá)的提高有助于維持和改善線粒體呼吸及能量代謝功能。

本實(shí)驗(yàn)中SDH和CCO活性改變高度相似。模型組家兔滑膜SDH和CCO活性顯著高于正常組,說(shuō)明RA自身可升高機(jī)體SDH和CCO活性,這可能是RA模型家兔早期關(guān)節(jié)溫度增高的原因之一。經(jīng)過(guò)針刺治療1星期后,與模型組相比較,平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針?lè)ńM家兔SDH和CCO活性均顯著升高,提示這3種針刺方法均能引起SDH和CCO活性增強(qiáng);熱補(bǔ)針?lè)ńMSDH和CCO活性顯著高于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組,說(shuō)明熱補(bǔ)針?lè)ㄔ谏逽DH和CCO活性方面要強(qiáng)于平補(bǔ)平瀉法和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法,這是因?yàn)獒槾淘鰪?qiáng)了機(jī)體有氧代謝能力,生成更多的能量滿足機(jī)體的需要。這種針刺現(xiàn)象僅是存在于RA機(jī)體,還是一個(gè)普遍的規(guī)律,有待于進(jìn)一步深入研究。關(guān)衛(wèi)等[18]研究表明石氏針刺補(bǔ)法能夠明顯增強(qiáng)健康小鼠胃及骨骼肌SDH活性,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相似之處。

機(jī)體的溫度是由糖、脂肪、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解釋放出熱量來(lái)維持的,有無(wú)氧代謝和有氧代謝兩條途徑,釋放能量的過(guò)程中有許多能量代謝相關(guān)酶參與。LDH是無(wú)氧代謝酶,而SDH和CCO是有氧代謝酶,以上的結(jié)果提示針刺能夠增強(qiáng)有氧代謝酶的活性從而增強(qiáng)有氧代謝,熱補(bǔ)針?lè)ǖ淖饔脧?qiáng)于平補(bǔ)平瀉法和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法。增強(qiáng)機(jī)體有氧代謝,使機(jī)體產(chǎn)生更多的能量,部分轉(zhuǎn)化為熱能散出體外,這可能就是熱補(bǔ)針?lè)ā叭帷钡臋C(jī)制。但是機(jī)體能量代謝是一個(gè)涉及多個(gè)環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程,僅從兩個(gè)能量代謝相關(guān)酶的變化要得出上述結(jié)論為時(shí)尚早,還需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述,熱補(bǔ)針?lè)ㄖ委烺A療效確切,能夠增強(qiáng)SDH、CCO活性,這可能就是熱補(bǔ)針?lè)ā叭帷钡臋C(jī)制之一。

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Effect of Heat Reinforcing Acupuncture Manipulation on Articular Synovium LDH, SDH and CCO in Rheumatoid Arthritis Rabbits

DU Xiao-zheng1, WANG Jin-hai2, QIN Xiao-guang1, FANG Xiao-li1, ZHANG Xiao-jiang1.

1.Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000,China; 2.Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000,China

Objective To investigate the regulating effect of heat reinforcing acupuncture manipulation on body energy metabolism enzymes in rheumatoid arthritis (RA) and preliminarily explain the mechanism of heat-producing action of heat reinforcing acupuncture manipulation. Method Forty chinchilla rabbits were randomized into normal, model, equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups. A model of cold syndrome-type RA was made by ovalbumin induction and exposure to low temperature in the other four groups not including the normal group. From two days after successful model making, the normal and model groups were grabbed and fastened (bound) by the same way as for the acupuncture groups, 30 min once daily. The equal reinforcement and reduction group received even reinforcing-reducing method; the twirling reinforcement group, twirling reinforcement method; the heat reinforcing group, heat reinforcing acupuncture manipulation. The needle was manipulated for 1 min and retained for 30 min once daily, for a total of seven days. The RA rabbit knee joint circumference was measured and the inflammation score was recorded according to synovial histopathological sections before and after treatment. After the completion of intervention, the rabbits were sacrificed and the articular synovium was rapidly separated for frozen sections. Articular synovium lactate dehydrogenase (LDH), succinate dehydrogenase (SDH) and cytochrome oxidase (CCO) activities were measured by histochemical staining. Result After acupuncture intervention, the RA rabbit knee joint circumference was shortened in all the equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups, but the shortening effect on the RA rabbit knee joint circumference was better in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05); the inflammation score recorded according to the RA rabbit synovial histopathological sections was also decreased more in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05). Synovial LDH integral optical density, total positive area and area percentage were significantly higher in the model group than in the normal group (＜0.05), and significantly lower in the equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups than in the model group(＜0.05) and also in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05). Rabbit synovial SDH and CCO activities were significantly higher in the model group than in the normal group (＜0.05). Rabbit synovial SDH and CCO integral optical density, total positive area and area percentage were significantly higher in the equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups than in the model group (＜0.05) and also in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05). Conclusion Heat reinforcing acupuncture manipulation has a definite therapeutic effect on RA and can increase SDH and CCO activities to enhance aerobic metabolism and produce more local energy in a rabbit model of RA. That may be the mechanism by which heat reinforcing acupuncture manipulation produces heat.

Acupuncture reinforcing method; Arthritis, rheumatoid; Lactate dehydrogenase; Succinate dehydrogenase; Cytochrome oxidase

1005-0957(2016)10-1256-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.10.1256

2015-12-20

甘肅省教育廳第二批科研項(xiàng)目(1106B-08);甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年科研基金項(xiàng)目(gszyxy2010-4)

杜小正(1973 - ),男,副教授,博士,研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)針刺手法治療免疫系統(tǒng)疾病,Email:lz-duxiaozheng@163.com