白細(xì)胞介素-17在活動期炎癥性腸病患者血漿和腸黏膜中的表達(dá)及其意義

裴中美 趙振亞 肖靜波 陳達(dá)凡 宛新建*

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科1(200080) 上海市青浦區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科2

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白細(xì)胞介素-17在活動期炎癥性腸病患者血漿和腸黏膜中的表達(dá)及其意義

裴中美1,2趙振亞1肖靜波1陳達(dá)凡1宛新建1*

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科1(200080) 上海市青浦區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科2

背景：白細(xì)胞介素-17(IL-17)是一種強(qiáng)促炎細(xì)胞因子，可能參與炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機(jī)制和病理過程。目的：探討IL-17在活動期IBD患者血漿和腸黏膜中的表達(dá)及其意義。方法：納入2014年9月—2015年7月上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院收治的活動期IBD患者25例，其中潰瘍性結(jié)腸炎(UC)17例，克羅恩病(CD)8例。選取同期行結(jié)腸鏡檢查的結(jié)腸息肉患者10例作為對照組。采集入選者血漿和腸黏膜組織，采用ELISA法檢測血漿IL-17表達(dá)，采用免疫組化和免疫熒光法檢測腸黏膜組織IL-17表達(dá)。結(jié)果：UC組和CD組血漿IL-17表達(dá)水平顯著高于對照組[(18.92±3.72) ng/L、(19.10±3.83) ng/L對(15.78±2.98) ng/L，P<0.05]。UC組和CD組腸黏膜組織IL-17表達(dá)均為陽性，對照組腸黏膜組織未見IL-17表達(dá)。結(jié)論：活動期IBD患者血漿和腸黏膜組織中IL-17表達(dá)升高，提示IL-17可能參與IBD的發(fā)病過程。

炎癥性腸病； 結(jié)腸炎，潰瘍性； Crohn??； 白細(xì)胞介素17； 血漿

炎癥性腸病(IBD)是一種病因未明確的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。IBD患者發(fā)病高峰年齡為20～40歲，病程遷延，反復(fù)發(fā)作，病情輕重不一[1]。IBD在西方國家常見，歐洲和北美的UC發(fā)病率為(10～24.3)/10萬，CD發(fā)病率為(12.7～20.2)/10萬[2]。亞洲地區(qū)IBD發(fā)病率和患病率較西方國家低，但呈逐年增加趨勢[3]。近年我國IBD患者和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多[4-5]。以往研究認(rèn)為IBD發(fā)病與遺傳、感染、免疫、環(huán)境、微生物等多種因素有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。白細(xì)胞介素-17(IL-17)是由輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)分泌的一種強(qiáng)促炎細(xì)胞因子，近年研究發(fā)現(xiàn)IL-17在多種免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，其在IBD發(fā)病機(jī)制中的角色備受關(guān)注[6]。諸多國外研究[7-9]表明IL-17可能參與IBD發(fā)病，但其在中國IBD患者體內(nèi)的表達(dá)及其意義尚待證實(shí)。本研究通過檢測上海地區(qū)活動期IBD患者血漿和腸黏膜組織中IL-17的表達(dá)情況，旨在探討IL-17在IBD 發(fā)病過程中的作用。

材料與方法

一、研究對象

納入2014年9月—2015年7月上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科收治的IBD患者25例，其中UC 17例，CD 8例。IBD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[10]。分別采用Mayo評分系統(tǒng)[11]和簡化CD活動指數(shù)(CDAI)[10]對UC和CD疾病活動性進(jìn)行評估。排除標(biāo)準(zhǔn)：①緩解期IBD；②診斷不明確的腸炎；③嚴(yán)重心、肝、肺、腎疾??；④不能耐受結(jié)腸鏡檢查；⑤拒絕行活組織檢查或采集靜脈血。選取同期行結(jié)腸鏡檢查的結(jié)腸息肉患者10例作為對照組。研究方案經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 主要試劑：人IL-17 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，IL-17抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，免疫組化試劑盒購自上海志立生物科技有限公司，DAPI染液購自上海翊圣生物科技有限公司。

2. ELISA法檢測血漿IL-17表達(dá)：UC組(17例)、CD組(8例)和對照組(10例)患者于入院第2 d 清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，取血漿，-80 ℃液氮凍存待測。ELISA操作步驟參照人IL-17 ELISA試劑盒說明書，于酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取吸光度(A)值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿標(biāo)本IL-17濃度。

3. 免疫組化法檢測腸黏膜組織IL-17表達(dá)：UC組(12例)、CD組(4例)患者于結(jié)腸鏡下取病變明顯處腸黏膜組織，對照組(5例)于結(jié)腸鏡下取非病變腸黏膜組織(距腸息肉5 cm處)，組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片，切片脫蠟至水，采用 0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉，依次加入IL-17抗體(滴度1∶100)和酶標(biāo)二抗，4 ℃濕盒孵育48 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片。以PBS 代替一抗作為空白對照。結(jié)果判定：光學(xué)顯微鏡下單核巨噬細(xì)胞膜和(或)胞質(zhì)黃色、棕黃色染色為陽性。

4. 免疫熒光法檢測腸黏膜組織IL-17表達(dá)：腸黏膜組織切片脫蠟后，免疫熒光封閉液室溫封閉，加入免疫熒光IL-17抗體(滴度1∶100)，4 ℃濕盒孵育過夜，洗滌后避光加入免疫熒光二抗孵育1 h，DAPI 染色，免疫熒光洗滌液洗滌，加入抗熒光淬滅封片液封片，于激光共聚焦顯微鏡下成像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

UC組男10例，女7例，年齡21～82歲，平均(44.8±17.5)歲；CD組男4例，女4例，年齡19～74歲，平均(36.3±17.6)歲；對照組男7例，女3例，年齡21～70歲，平均(40.9±16.4)歲。三組間性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。UC組疾病活動度分別為輕度2例、中度10例、重度5例；CD組分別為中度4例、重度4例。

二、血漿IL-17表達(dá)

UC組、CD組和對照組血漿IL-17表達(dá)水平分別為(18.92±3.72) ng/L、(19.10±3.83) ng/L和(15.78±2.98) ng/L，UC組和CD組顯著高于對照組(P<0.05)，UC與CD組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

三、腸黏膜組織IL-17表達(dá)

免疫組化檢測顯示，UC和CD組病變腸黏膜上皮均出現(xiàn)IL-17染色陽性細(xì)胞，為黃色或棕黃色胞質(zhì)染色，黏膜固有層和淋巴小結(jié)內(nèi)亦可見散在陽性細(xì)胞，多呈體積小、核圓形或類圓形的淋巴細(xì)胞樣特征；少部分染色陽性細(xì)胞體積較大、胞體形狀不規(guī)則、胞質(zhì)豐富，呈巨噬細(xì)胞樣特征。UC組陽性細(xì)胞主要位于上皮固有層，分布于腺體周圍，黏膜固有層內(nèi)散在陽性單核細(xì)胞；CD組腸黏膜全層均可見陽性細(xì)胞，各層中分布未見明顯差異；對照組腸黏膜全層均未見陽性染色細(xì)胞(圖1)。

免疫熒光檢測顯示，細(xì)胞核為 DAPI 染色，呈藍(lán)色熒光，邊緣清晰；IL-17呈綠色熒光，包繞于細(xì)胞核周圍，分布較彌散。UC、CD組病變腸黏膜均可見IL-17免疫熒光陽性細(xì)胞，對照組腸黏膜全層均未見IL-17陽性細(xì)胞(圖2)。

討 論

IBD的發(fā)病機(jī)制目前仍未明確。以往研究顯示，

A、B：UC組(×200，×400)；C、D：CD組(×200，×400)；E、F：對照組(×200，×400)；藍(lán)色、黃色箭頭所示分別為巨噬細(xì)胞樣、淋巴細(xì)胞樣 IL-17染色陽性細(xì)胞。

圖1 腸黏膜組織IL-17表達(dá)(免疫組化染色)

A-C：UC組；D-F：CD組；G-I：對照組

Th1/Th2細(xì)胞比例失衡是IBD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[12]。Th細(xì)胞是機(jī)體介導(dǎo)免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞類型，CD腸黏膜炎癥主要由Th1型CD4+淋巴細(xì)胞介導(dǎo)[13]，UC則主要由Th2型CD4+淋巴細(xì)胞介導(dǎo)[14]。盡管CD與UC的發(fā)生機(jī)制不完全相同，但兩者腸道炎癥和黏膜損傷的關(guān)鍵均為促炎與抗炎細(xì)胞因子失衡[15]。近年研究顯示，Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病和特應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其具有完全獨(dú)立于Th1、Th2細(xì)胞的分化途徑和功能特征，可通過分泌促炎細(xì)胞因子IL-17，激活并募集大量中性粒細(xì)胞至炎癥部位，從而誘導(dǎo)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。哮喘、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病患者的血清和組織中IL-17呈高表達(dá)[16-18]。

研究認(rèn)為IBD發(fā)病機(jī)制與腸黏膜免疫屏障對腸道抗原的反應(yīng)失調(diào)有關(guān)，IL-23/IL-17軸介導(dǎo)的Th17型反應(yīng)在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6，19]。Th17細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能為病原體侵入腸道黏膜引起轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、IL-6、IL-23等表達(dá)，TGF-β和IL-6誘導(dǎo)Th17細(xì)胞表達(dá)IL-23受體(IL-23R)，從而激發(fā)Th17細(xì)胞對IL-23應(yīng)答，并釋放IL-17等細(xì)胞因子反作用于腸上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，發(fā)揮促炎效應(yīng)，即IL-23/IL-17軸[20-22]。Th17細(xì)胞激活后主要分泌IL-17A，亦可分泌IL-17F、IL-21、IL-22、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6等細(xì)胞因子。IL-17通過誘導(dǎo)趨化因子、集落刺激因子以及黏附因子表達(dá)和釋放，招募、激活炎性細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

Fujino等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常人或缺血性結(jié)腸炎患者，CD、UC患者腸黏膜IL-17水平顯著升高。Kobayashi 等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者體內(nèi)Th17細(xì)胞相關(guān)因子合成和分泌增加。Seiderer等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，活動性IBD患者結(jié)腸黏膜和血清Th17/IL-17F含量顯著高于正常對照者和非活動性IBD患者，推測Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17與IBD嚴(yán)重程度密切相關(guān)。目前國內(nèi)僅有少量研究[24-25]關(guān)注于IL-17在中國IBD患者病程中的作用，相關(guān)結(jié)論尚待驗(yàn)證。本研究納入上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院收治的25例活動期IBD患者，通過檢測其血漿和腸黏膜組織IL-17 的表達(dá)情況，旨在探討IL-17在IBD 發(fā)病過程中的作用。本研究以結(jié)腸息肉患者作為對照組，比較UC、CD患者與對照組的血漿和腸黏膜組織IL-17表達(dá)，結(jié)果顯示IL-17在UC和CD組血漿和腸黏膜組織中的表達(dá)水平均顯著高于對照組，提示IL-17參與IBD發(fā)病，血液中的Th17細(xì)胞可能趨化至腸黏膜，從而在IBD的腸道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究探討。

有關(guān)IL-23/IL-17軸與Th17細(xì)胞的研究不但有助于對IBD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，亦為IBD的治療提供了新靶點(diǎn)和線索。糖皮質(zhì)激素等傳統(tǒng)IBD治療方案可導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此研究作用于IBD炎性通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的新型非激素類藥物具有重要意義。二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑vidofludimus(4SC-101)具有抑制淋巴細(xì)胞增殖和IL-17分泌的作用，可在核因子-κB(NF-κB)通路中抑制DHODH，從而降低IL-17A和IL-17F表達(dá)水平[26]。Fitzpatrick等[27]的研究 顯示，應(yīng)用vidofludimus治療三硝基苯磺酸(TNBS)和葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎可顯著減輕腸道炎癥反應(yīng)。Herrlinger等[28]應(yīng)用vidofludimus治療34例IBD患者，結(jié)果顯示治療結(jié)束時(shí)57.1%的CD患者和50.0%的UC患者達(dá)到無激素緩解(完全應(yīng)答)，證實(shí)了vidofludimus治療IBD的有效性，亦提示抑制IL-17表達(dá)可作為治療IBD的新途徑。本研究尚未涉及IL-17及其抑制劑在IBD治療中的作用，有待后期進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，Th17細(xì)胞是近年來自身免疫性疾病的研究熱點(diǎn)，諸多研究聚焦于Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17等細(xì)胞因子在IBD發(fā)病機(jī)制中的作用。本研究對中國活動期IBD患者血漿和腸黏膜組織的IL-17表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示IL-17表達(dá)升高，提示其可能參與IBD 的發(fā)病過程。然而，本研究為單中心研究，樣本量較小，未來需進(jìn)一步行多中心研究對該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期為IBD的臨床治療提供新靶點(diǎn)和新方向。

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(2015-12-20收稿；2016-01-28修回)

Expression and Significance of Interleukin-17 in Plasma and Intestinal Mucosa of Patients with Active Inflammatory Bowel Disease

PEIZhongmei1,2,ZHAOZhenya1,XIAOJingbo1,CHENDafan1,WANXinjian1.

1DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai(200080);2DepartmentofInternalMedicine,QingpuChineseMedicineHospital,Shanghai

WAN Xinjian, Email: wanxj99@163.com

Inflammatory Bowel Disease; Colitis, Ulcerative; Crohn Disease; Interleukin-17; Plasma

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.09.009

*本文通信作者，Email: wanxj99@163.com

Background: Interleukin-17 (IL-17) is a potent proinflammatory cytokine and may be involved in the pathogenesis and pathophysiology of inflammatory bowel disease (IBD). Aims: To investigate the expression and significance of IL-17 in plasma and intestinal mucosa of patients with active IBD. Methods: A total of 25 patients with active IBD at Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University from September 2014 to July 2015 were enrolled, in which 17 cases were ulcerative colitis (UC), 8 cases were Crohn’s disease (CD). Ten patients with colonic polyp undergoing colonoscopy were served as controls. Plasma and intestinal mucosal tissue were collected. Expression of IL-17 in plasma was determined by ELISA, and expression of IL-17 in intestinal mucosal tissue was detected by immunohistochemistry and immuno-fluorescence. Results: Plasma expression of IL-17 was significantly higher in UC and CD groups than that in control group [(18.92±3.72) ng/L and (19.10±3.83) ng/Lvs. (15.78±2.98) ng/L,P<0.05]. Intestinal mucosal tissue was positive for IL-17 in all the cases in UC and CD groups, however, IL-17 was not detected in control group. Conclusions: Expression of IL-17 is increased in both plasma and intestinal mucosal tissue in patients with active IBD, which indicates that IL-17 may be involved in the pathogenesis of IBD.