快速提取-超高效液相色譜法測定唇膏中11種酞酸酯

周江，季倩祎，余妙琴，楊浩，吳重彬

［義烏市產(chǎn)品（商品）質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，浙江義烏 322000］

快速提取-超高效液相色譜法測定唇膏中11種酞酸酯

周江，季倩祎，余妙琴，楊浩，吳重彬

［義烏市產(chǎn)品（商品）質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，浙江義烏 322000］

建立快速提取-超高效液相色譜法測定唇膏中11種酞酸酯的檢測方法。將唇膏樣品涂覆在定量濾紙上，用甲醇渦旋超聲提取，色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-水，梯度洗脫，流量為0.5 mL/min，用PDA檢測器檢測，檢測波長225 nm。以3倍空白噪音計，鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）的檢出限分別為1，2 mg/kg；鄰苯二甲酸二丙酯（DPRP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）的檢出限為3 mg/kg；鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）的檢出限為30 mg/kg。方法的加標(biāo)回收率為86.6%～98.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～6.0%（n=6）。該方法樣品處理簡單，提取效率高，分離效果好且靈敏度高，結(jié)合色譜圖和紫外光譜圖，能快速準(zhǔn)確測定唇膏中11種酞酸酯。

唇膏；酞酸酯；超高效液相色譜法；定量濾紙

酞酸酯（PAEs，又稱鄰苯二甲酸酯）是鄰苯二甲酸及酐與醇類酯化反應(yīng)生成的化合物。鄰苯二甲酸酯類已被世界衛(wèi)生組織（WTO）公告為環(huán)境荷爾蒙物質(zhì)，具有雌性荷爾蒙的作用，在體內(nèi)會干擾人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是生殖系統(tǒng)［1］。酞酸酯在化妝品中主要用作溶劑、塑化劑、香精香料的定香劑。我國的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2007版［2］和歐盟化妝品法規(guī)（EC）NO1223/2009［3］中將鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）等7種PAEs列為化妝品中的禁用組分。

化妝品中的酞酸酯檢測方法主要有氣相色譜法［4-5］、氣相色譜法-質(zhì)譜法［6-7］、液相色譜法［8-14］、液相色譜-質(zhì)譜法［15］，但針對化妝品中鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）測定的方法研究相對較少，用超高效液相色譜法進(jìn)行測定就更少，目前文獻(xiàn)中涉及超高效液相色譜法主要是測定除DINP，DIDP以外的幾種PAEs。如鄭和輝［8］等采用超高效液相色譜法檢測化妝品中4種鄰苯二甲酸酯，以及柳玉紅［9］等采用超高效液相色譜法同時測定化妝品中9種鄰苯二甲酸酯和雙酚A，都未涉及DINP和DIDP?，F(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于液相色譜法測定唇膏中PAEs，通常采用甲醇或乙腈作為提取劑［8-12］，且樣品稱取后直接加入提取劑，未考慮唇膏在甲醇或乙腈中不宜溶解分散，進(jìn)而導(dǎo)致提取不充分的情況。

筆者將唇膏涂覆在濾紙上，用甲醇浸泡超聲提取，從而避免由于樣品粘連不宜分散導(dǎo)致提取不充分的問題。采用超高效液相色譜法相比普通高效液相色譜法，在分析速度、分離度和靈敏度上有更好的表現(xiàn)，整個檢測過程在13 min內(nèi)完成，普通高效液相色譜法需要45 min以上［16-17］。

1　實驗部分

1.1主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀（UPLC）：Waters Acquity型，帶PDA檢測器、Empower 色譜工作站，美國Waters公司；

渦旋混勻器：MS 3digital型，德國IKA集團(tuán)；

高速離心機(jī)：H1650型，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

超聲波清洗器：AS3210型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）：純度分別為99%，98%，98%，98%，上海安譜實驗科技股份有限公司；

鄰苯二甲酸二丙酯（DPRP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2乙基）己酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）：純度分別為98%，99%，99.5，99.6%，99%，德國Dr.Ehrensorfer公司；

鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）：純度均為99%，北京曼哈格生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司；

濾紙：定量濾紙，杭州新華紙業(yè)有限公司；

實驗用水為Mili-Q Water system制備的超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

鄰苯二甲酸酯各單標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取除DINP和DIDP外其它鄰苯二甲酸酯物質(zhì)各20 mg，移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，各單標(biāo)濃度均為2 000 mg/L；準(zhǔn)確稱取DINP和DIDP各100 mg，移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，DINP和DIDP質(zhì)量濃度均為10.0 g/L。

鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取鄰苯二甲酸酯各單標(biāo)溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，獲得DINP和DIDP質(zhì)量濃度為500 mg/L，其它物質(zhì)的質(zhì)量濃度為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取0.05，0.1，0.2，0.5，2.0，4.0 mL鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至10 mL，配制成DINP和DIDP質(zhì)量濃度分別為2.5，5.0，10.0，25.0，100.0，200.0，500.0 mg/L，其它鄰苯二甲酸酯質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，20.0，40.0，100.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；保護(hù)?。篤anGuard保護(hù)??；檢測器：PDA檢測器；檢測波長：225 nm；流動相：乙腈-水；梯度洗脫程序：初始乙腈-水體積比為55∶45，乙腈比例在2 min內(nèi)線性增長到70%，從2 min至3 min保持70%等度，3 min至4 min線性增長至85%，4 min至10 min保持95%等度，10 min后恢復(fù)初始流動相，保持3 min；流量：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：40℃。

1.4樣品處理

將唇膏樣品涂覆在已稱重的濾紙（20 mm×10 mm）上，單面涂覆，涂覆量在0.1 g左右，一般需要濾紙（20 mm×10 mm）5張左右。將涂覆有樣品的濾紙按照非涂覆面與涂覆面疊放的原則，依次疊放濾紙，轉(zhuǎn)移至具塞比色管中，加入10 mL甲醇。渦旋2 min后，常溫超聲提取20 min，然后將提取液轉(zhuǎn)移到離心管中，在5 000 r/min速度下離心10 min，過0.22 μm濾膜，備用。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品處理條件的選擇

唇膏屬于蠟基類膏狀物質(zhì)，稱樣后直接用甲醇或乙腈提取，樣品不易分散，不利于目標(biāo)物質(zhì)提取。為使樣品與提取液充分接觸，提高提取效率，國標(biāo)［18］方法將稱好的唇膏樣品置于研缽中，加入海砂5 g，研磨均勻，再轉(zhuǎn)移至具塞三角瓶中，用甲醇超聲提取。依照此方法測試發(fā)現(xiàn)用海砂研磨唇膏能將樣品附著在海砂表面，增加了唇膏與提取劑的接觸面積，有利于提取，但是在研磨過程中一部分樣品附著在研缽的表面，造成樣品損失，影響測定結(jié)果。通過反復(fù)測試發(fā)現(xiàn)，將樣品直接涂覆在濾紙上既能增加樣品與提取劑的接觸面積，同時又不會造成樣品的損失。操作如下，將樣品涂覆在事先稱量好的濾紙（20 mm×10 mm）單面上，涂覆量在0.1 g左右，再將濾紙置于具塞比色管中稱量，扣除濾紙的質(zhì)量，能夠準(zhǔn)確計算出樣品的質(zhì)量，因此該方法能有效避免樣品的損失。稱取0.1 g樣品，一般需要5張左右濾紙，把涂覆有樣品的濾紙疊好置于比色管中時，應(yīng)按照非涂覆面與涂覆面疊放的原則，依次疊放濾紙，不要將兩張濾紙的涂覆面疊放在一起，避免造成粘連而不利于樣品的提取。

該方法采用渦旋超聲提取方式對樣品進(jìn)行提取。樣品在加入提取劑后，先渦旋2 min，利于溶劑充分滲透，再進(jìn)行超聲提取。通過比較超聲提取10，15，20 min陽性樣品的提取率發(fā)現(xiàn)，超聲20 min提取效果更好，因此選擇超聲提取20 min。

同時考察甲醇、乙腈的提取效果發(fā)現(xiàn)，唇膏在甲醇相比乙腈更易溶解，且通過對陽性樣品的提取實驗，得出甲醇的提取效果更好，且甲醇成本和毒性都比較低，因此采用甲醇作為提取劑。

2.2色譜條件的選擇

2.2.1洗脫條件的選擇

分別對乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水等流動相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)3種流動相都能有效分離出各物質(zhì)，但是在乙腈-水流動體系下峰形更好，且流速可達(dá)0.5 mL/min；而在甲醇-水流動體系下流速為0.30 mL/min，甲醇-乙腈-水流動體系下流速為0.4 mL/min，過高的流速易產(chǎn)生壓力過載。同時考察了等度洗脫和梯度洗脫對物質(zhì)分離的情況，等度洗脫不能有效分離各物質(zhì)，需要進(jìn)行梯度洗脫。因此采用乙腈-水梯度洗脫的方法，并對梯度條件進(jìn)行優(yōu)化，13 min內(nèi)完成分離檢測。

2.2.2檢測波長的選擇

通過PDA檢測器掃描，分析11種PAEs的光譜圖發(fā)現(xiàn)，各物質(zhì)在波長225 nm附近有較大的紫外吸收，因此選取225 nm作為檢測波長。

2.3酞酸酯的色譜分析

11種PAEs標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1，檢測波長為225 nm，前9種PAEs呈現(xiàn)尖銳且對稱的峰形，后兩種由于DINP和DIDP是同分異構(gòu)體的混合物，因而在譜圖上呈現(xiàn)“五指峰”的峰形，11種PAEs能夠完全分離，各物質(zhì)的保留時間見表1。陽性唇膏樣品色譜圖如圖2，從圖2中可以看出，DEP和DPRP能完全分離，且在其余9種PAEs保留時間處，基質(zhì)對PAEs干擾較少。即便有些物質(zhì)對PAEs有干擾，也可以通過紫外光譜圖進(jìn)行鑒別。

圖1　種酞酸酯標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液色譜圖

圖2　陽性樣品溶液色譜圖

2.4線性方程及檢出限

在1.3色譜條件下對1.2配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測定，以各組分的色譜峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表1。

以空白樣品的3倍信噪比（S/N）為檢出限。11種PAEs的檢出限（稱樣量為0.1 g）見表1。由于DINP和DIDP為同分異構(gòu)體混合物，色譜峰比較寬，靈敏度比較低，檢出限為30 mg/kg，其它9種PAEs檢出限不超過3 mg/kg。

表1　線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5回收試驗和精密度

在0.1 g唇膏中，按兩個水平添加11種PAEs的標(biāo)樣，添加量分別為50，10 μg，每組分別重復(fù)添加6次，回收試驗和精密度試驗結(jié)果見表2。

表2　添加回收率和精密度（n=6）

從表2可知，添加量為10 μg時，加標(biāo)回收率為86.6%～97.0%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～6.0%；添加量為50 μg時，加標(biāo)回收率為93.6%～98.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～2.4%，回收率和精密度能滿足檢驗要求。

3　結(jié)語

創(chuàng)新性的采用濾紙分散唇膏樣品，提高了甲醇提取酞酸酯的效率，有效解決了國標(biāo)GB/T 28599-2012中唇膏類樣品在樣品處理過程中待測物損失的問題，同時該前處理方法也為提取唇膏中其它物質(zhì)提供參考。研究發(fā)現(xiàn)超高效液相色譜法能快速有效檢測和分離DMP，DEP，DPRP，DBP，DPP，DHXP，BBP，DEHP，DNOP，DINP，DIDP 11種酞酸酯物質(zhì)，檢測時間僅為13 min。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速提取并準(zhǔn)確測定唇膏中11種酞酸酯。

［1］ 浙江省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，義烏出入境檢驗檢疫局.化妝品出口技術(shù)性貿(mào)易措施應(yīng)對指南［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

［2］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范［M］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2007.

［3］ THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL. REGULATION （EC）No 1223/2009 ［J］. Official Journal of the European Union，2009，342∶ 103，119-120.

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Determination of 11 kind of Phthalate Esters in Lipstick by Rapid Extraction and Ultra-Performance Liquid Chromatography

Zhou Jiang， Ji Qianyi， Yu Miaoqin， Yang Hao， Wu Chongbin
［Yiwu Product （Commodity） Quality Supervision and Test Institute， Yiwu 322000， China］

A rapid extraction and ultra-performance liquid chromatography method was established for determining 11 kind of phthalate esters（PAEs） in lipstick. The lipstick sample was directly coated on the quantitative filter paper，and extracted by methanol using shaker and ultrasonic bath. PAEs were separated on Waters ACQUITY UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） by gradient elution using acetonitrile-water as the mobile phase at a flow rate of 0.5 mL/min，and detected by PDA detector on detecting wavelength of 225 nm. The detection limits（S/N=3） of dimethyl phthalate and diethyl phthalate were 1 mg/kg and 2 mg/kg， respectively； the detection limits of dipropyl phthalate，dibutyl phthalate，dipentyl phthalate，dihexyl phthalate，benzyl butyl phthalate，bis（2-ethylhexyl） phthalate and di-n-octyl phthalate were 3 mg/kg； the detection limits of di-iso-nonyl phthalate and di-iso-decyl phthalate were 30 mg/kg. The average recoveries for PAEs in lipstick were 86.6%-98.6%. The relative standard deviations of determination results were 0.6%-6.0%（n=6）. The pretreatment is simple，the extraction efficiency is high，and the separation is quick and effective. The method can satisfactory for determination of the 11 phthalate esters in lipstick.

lipstick； phthalate esters； ultra-performance liquid chromatography； quantitative filter paper

O657.7

A

1008-6145（2016）03-0081-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.021

聯(lián)系人：周江；E-mail∶ 8849409@qq.com

2016-02-01