三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因克隆鑒定及在鹽度脅迫下的表達分析

馬金武　呂建建　劉　萍　高保全　李　健

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島 266071； 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島 266071）

三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因克隆鑒定及在鹽度脅迫下的表達分析

馬金武1，2呂建建1，3劉萍1，3高保全1，3李健1，3

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島 266071； 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島 266071）

為研究Na+/H+-exchanger基因在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）鹽度脅迫過程中的功能作用，克隆了三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因并進行表達分析。結(jié)果顯示，Na+/H+-exchanger基因（GenBank：KU519329）全長4233 bp，5′和3′非編碼區(qū)（UTR）長分別為519和753 bp，開放閱讀框（ORF）長2961 bp。編碼986個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量和等電點分別為110.8 kD和7.42，具有信號肽和典型的Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域，含12個跨膜α螺旋； 三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因與普通濱蟹（Carcinus maenas）同源性最高，達到87.2%，系統(tǒng)進化分析也顯示該序列與普通濱蟹聚為一支； 表達分析顯示，三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在鰓中表達量最高； 在低鹽（鹽度5、10和20）脅迫過程中，Na+/H+-exchanger基因在0—12h上調(diào)表達明顯，在24—168h間表達量呈下降趨勢； 在高鹽（鹽度50）脅迫初期（0—12h），該基因表達量相對穩(wěn)定，之后（24—168h）顯著下調(diào)表達。研究表明低鹽顯著誘導(dǎo)Na+/H+-exchanger基因的高表達，推測三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在低鹽環(huán)境下發(fā)揮重要的滲透調(diào)節(jié)功能。

三疣梭子蟹；Na+/H+-exchanger；基因克隆；鹽度脅迫；表達分析

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）隸屬于甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、梭子蟹科（Portunidae）、梭子蟹屬（Portunus），廣泛分布于我國南北沿海［1］，在日本和朝鮮半島等海域亦有廣泛分布［2，3］，可存活于鹽度為13.7—47.7的水環(huán)境中［4］，屬廣鹽性水生甲殼動物［1］，其生長快、食用價值高和養(yǎng)殖利潤豐厚等特點使其成為我國重要的海水捕撈和養(yǎng)殖品種［5］。

鹽度對水生甲殼動物的生長發(fā)育和新陳代謝等具有極其重要的影響［6］，其主要通過血淋巴滲透壓調(diào)控以適應(yīng)環(huán)境鹽度的變化，且血淋巴滲透壓水平主要取決于對無機離子通透性的調(diào)控，其中以Na+和Cl-的調(diào)控最為重要［7—9］。水生甲殼動物進行滲透壓和離子調(diào)節(jié)的主要器官是鰓［10］，且主要在鰓離子轉(zhuǎn)運型上皮進行［11，12］。其離子轉(zhuǎn)運過程主要由離子泵、離子交換器和通道蛋白等共同作用調(diào)控完成［10，13］，其中離子交換器Na+/H+-exchanger在Na+的跨膜轉(zhuǎn)運過程中具有重要作用。Na+/H+-exchanger通過CA提供的胞質(zhì)內(nèi)高H+梯度，將質(zhì)膜外Na+交換進入胞質(zhì)內(nèi)，再由基底側(cè)質(zhì)膜上的Na+/K+-ATPase轉(zhuǎn)運進入基底側(cè)質(zhì)膜外，從而完成鰓上皮細胞的Na+跨膜轉(zhuǎn)運過程，水生甲殼動物Na+/H+-exchanger向膜內(nèi)和膜外分別轉(zhuǎn)運2 Na+和1 H+［14—17］，對廣鹽性蟹類在低鹽環(huán)境下的Na+攝入具有重要影響。水生甲殼動物的滲透壓調(diào)節(jié)方式呈現(xiàn)多樣性，主要包括高滲調(diào)節(jié)型、滲透調(diào)節(jié)隨變型和高滲-低滲調(diào)節(jié)型［10］。Na+/H+-exchanger主要在滲透調(diào)節(jié)隨變型和高滲-低滲調(diào)節(jié)型蟹類中起重要作用，且在高滲調(diào)節(jié)型蟹類中，Na+/H+-exchanger主要在“弱”高滲調(diào)節(jié)型蟹類中調(diào)節(jié)Na+的轉(zhuǎn)運，“強”高滲調(diào)節(jié)型蟹類中不起作用［10］。本實驗室對5—50不同鹽度下三疣梭子蟹血清滲透壓和離子含量的變化進行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明三疣梭子蟹屬于高滲調(diào)節(jié)型蟹類［18］，由于“強”和“弱”高滲調(diào)節(jié)型蟹類的區(qū)分規(guī)則仍不明確，有關(guān)三疣梭子蟹中Na+/H+-exchanger的功能作用需進一步分析研究。

目前，對于十足目甲殼動物Na+/H+-exchanger已進行諸多研究，但主要側(cè)重于電生理學(xué)方面，分子生物學(xué)方面的研究僅初步開始。1989年第一個人體細胞中Na+/H+-exchanger克隆測序完成，截至目前，Na+/H+-exchanger基因在水生甲殼動物中的分子克隆研究進展緩慢，僅有4個物種完成克隆測序，且僅有普通濱蟹（Carcinus maenas）對序列特性和表達情況進行了分析報道，有關(guān)三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger對滲透調(diào)節(jié)作用的研究至今未見報道。本研究通過實驗室構(gòu)建的三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組文庫［19］篩選出Na+/H+-exchanger基因的EST序列，采用RACE技術(shù)克隆獲得該基因全長cDNA序列并對該基因及其編碼的氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析，通過Blast比對分析該基因氨基酸序列與其他甲殼動物的同源性，采用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)分析該基因在不同組織及不同鹽度脅迫下的表達變化。對廣鹽性甲殼動物Na+/H+-exchanger基因的滲透調(diào)節(jié)機理的研究以及三疣梭子蟹耐低鹽新品系的選育都具有重要意義。

1　材料與方法

1.1實驗材料與取樣

實驗所用三疣梭子蟹為三疣梭子蟹“黃選1號”品種，個體為80日齡蟹［體重為（30±2.25） g］。于山東省昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司進行實驗，實驗前于養(yǎng)殖車間自然海水鹽度下（鹽度30）暫養(yǎng)7d，期間連續(xù)充氣，淘汰活力較差的個體，每天定時投喂藍蛤，換水清污。實驗設(shè)置鹽度5、10、20和50實驗組和自然海水對照組（鹽度30），每個鹽度設(shè)3個平行組，每組90只蟹子，實驗于400 cm×400 cm× 150 cm的水泥池、水深40 cm的水體中進行，鹽度50實驗組水體由自然海水與地下鹵水混勻調(diào)制，鹽度5、10和20實驗組水體由自然海水與自來水混勻調(diào)制，實驗前水體充分曝氣，實驗期間的投喂和飼養(yǎng)管理與暫養(yǎng)期相同。各鹽度組分別在實驗第0、3h、6h、9h、12h、24h、48h和72h時取鰓組織，放于無RNA酶離心管中，標記編號后置于液氮中冷凍保存。

1.2Na+/H+-exchanger基因cDNA全長克隆

采用Trizol法分別提取鰓組織中的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測RNA的完整度和質(zhì)量，使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit按照說明書要求操作，分別合成3′和5′ RACE的cDNA第一鏈。利用三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組文庫中檢索到的Na+/H+-exchanger基因EST序列和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3′和5′ RACE特異性引物（表1），于生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用TaKaRa LA Taq DNA聚合酶與RACE通用引物UPM、NUP和四條3′和5′ RACE特異性引物進行巢式PCR，對目的基因的3′和5′末端序列進行快速擴增。利用瓊脂糖凝膠分別檢測3′ RACE和5′ RACE的擴增產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒回收目的片段，使用pMD18-T載體和DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞進行連接轉(zhuǎn)化，取陽性單克隆進行菌落PCR鑒定，目的單克隆菌液送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.3序列分析

使用DNAStar軟件的SeqMan程序進行序列拼接得到Na+/H+-exchanger基因cDNA全長，采用ORF Finder進行基因開放閱讀框（ORF）預(yù)測，采用Blast程序分析目的基因與其他物種的同源性和一致性，使用DNAMAN軟件進行基因編碼氨基酸序列的多重序列比對。使用ProtParam tool、SMART、TMHMM Server v. 2.0和ProtScale等在線生物信息分析工具對基因編碼蛋白的基本物理性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和親、疏水性進行預(yù)測分析，利用MEGA 4.0軟件采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹。

1.4反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

采用Trizol法提取各鹽度組三疣梭子蟹鰓組織的總RNA，使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)已獲得的三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因cDNA全長序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物，內(nèi)參選擇RPL8［20］（表1），于生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用ABI 7500 Real Time PCR儀和TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑對三疣梭子蟹各組織及鹽度脅迫下基因的表達情況進行分析。反應(yīng)體系采用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書中20 μL體系標準，PCR反應(yīng)程序為：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40 個循環(huán)； 95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。Na+/H+-exchanger基因的相對表達分析采用2-ΔΔCt法，數(shù)據(jù)處理使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan檢驗，利用Origin Pro 9.0對統(tǒng)計結(jié)果進行作圖，P＜0.05表示具有顯著差異性。

表1　實驗用PCR引物序列Tab. 1　Primer used in the study

2　結(jié)果

2.1Na+/H+-exchanger基因cDNA全長克隆及序列分析

三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因cDNA全長4233 bp，GenBank登錄號為KU519329，其5′和3′端非編碼區(qū)分別為：519和753 bp，開放閱讀框（ORF）長2961 bp。ORF編碼氨基酸986個，預(yù)測蛋白的分子式和分子量分別為C4987H7829N1349O1432S40和110.8 kD，理論等電點為7.42。Blast對比分析表明，Na+/H+-exchanger基因編碼氨基酸序列與普通濱蟹、麥龍螯蝦（Cherax cainii）、天空藍魔蝦（Cherax destructor）和紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）的同源性分別為87.2%、58.5%、58.2%和57.8%。通過氨基酸序列多重比對分析表明，Na+/H+-exchanger氨基酸序列在60—650氨基酸區(qū)段內(nèi)保守性較高。SMART分析預(yù)測表明該基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域包括：Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域（84—486aa）、信號肽（0—19aa）和3個低復(fù)雜結(jié)構(gòu)（26—37aa、890—903aa和926—937aa）。TMHMM和ProtScale在線工具分析表明，Na+/H+-exchanger基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，主要分布于0—500氨基酸區(qū)段，該區(qū)段內(nèi)親、疏水性氨基酸均有分布，500—986氨基酸編碼蛋白無跨膜區(qū)段，位于膜內(nèi)，呈親水性。

利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析表明，脊椎動物和無脊椎動物Na+/H+-exchanger遺傳進化距離較遠，埃及伊蚊等昆蟲類聚為一支，三疣梭子蟹同普通濱蟹親緣關(guān)系最近并同麥龍螯蝦等聚為一支（圖1）。

圖1　Na+/H+-exchanger氨基酸序列NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 1　The Neighbor-Joining Phylogenetic tree for amino acid sequences of Na+/H+-exchanger

2.2Na+/H+-exchanger基因的組織表達分布和不同鹽度脅迫下的表達分析

利用RT-qPCR分析了三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在不同組織中的表達分布情況，結(jié)果顯示，三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在鰓中表達量最高并顯著高于其他組織（P＜0.05），腸表達量次之，其他組織表達量極低且肌肉組織中幾乎不表達（圖2）。

圖2　三疣梭子蟹不同組織中Na+/H+-exchanger基因的表達Fig. 2　Expression of Na+/H+-exchanger gene in different tissues of P. trituberculatus

經(jīng)過鹽度脅迫后，對三疣梭子蟹鰓組織中Na+/H+-exchanger基因表達情況進行分析表明，對照組在0—168h內(nèi)表達量無顯著變化。低鹽（鹽度5、10和20）組中Na+/H+-exchanger基因在0—12h上調(diào)表達明顯，其中鹽度5實驗組表達量顯著高于其他組（P＜0.05），在24—168h表達量整體呈下降趨勢，鹽度5實驗組在120h表達量出現(xiàn)小幅上調(diào)，鹽度10實驗組在72h表達量有較大增長，其他時間表達量與對照組持平或低于對照組，鹽度20實驗組除48h表達量與對照組持平外，其他時間表達量均低于對照組。高鹽（鹽度50）組Na+/H+-exchanger基因表達量在0—12h同對照組相對持平，在24—168h內(nèi)表達量降低并顯著低于對照組（P＜0.05）（圖3）。

圖3　鹽度脅迫下三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在鰓中的表達情況Fig. 3　Expression of Na+/H+-exchanger gene in P. trituberculatus gill tissue under salinity stress

3　討論

Na+/H+-exchanger在脊椎動物中的研究起步較早，主要側(cè)重于體內(nèi)離子平衡、酸堿平衡和細胞體積調(diào)節(jié)等方面［21］。Towle等［17］克隆了第一個甲殼動物Na+/H+-exchanger基因，其研究表明普通濱蟹Na+/H+-exchanger基因編碼673個氨基酸，序列多重比對分析表明普通濱蟹Na+/H+-exchanger基因同脊椎動物的幾個亞型均不相關(guān)。麥龍螯蝦、天空藍魔蝦和紅螯螯蝦的Na+/H+-exchanger基因cDNA全長已獲得，且研究發(fā)現(xiàn)其Na+/H+-exchanger基因與鹽度調(diào)節(jié)相關(guān)，但并未對序列特性等進行相關(guān)報道［22，23］。

本研究通過RACE技術(shù)首次克隆得到三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因cDNA全長，預(yù)測編碼蛋白986個，氨基酸序列多重比對和Blast分析表明三疣梭子蟹同普通濱蟹同源性最高，達到87.2%，這一結(jié)論印證了三疣梭子蟹同普通濱蟹同屬梭子蟹科且具有相似生存環(huán)境和生活習(xí)性的特點，與Péqueux［7］提出的地域分布對生物滲透調(diào)節(jié)能力具有重要影響的結(jié)論一致。與NCBI數(shù)據(jù)庫中氨基酸序列的比對分析表明甲殼動物Na+/H+-exchanger基因還未進行基因分型，因此三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因的分型工作有待進一步研究。SMART在線結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域（84—486aa），充分證明該基因為三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因。TMHMM和ProtScale在線工具預(yù)測表明0—500氨基酸區(qū)段具有12個跨膜α螺旋，與三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域重疊，且該區(qū)段內(nèi)親疏水性氨基酸均有分布，推測該區(qū)段可能與離子的跨膜轉(zhuǎn)運功能相關(guān)［17，21］。系統(tǒng)進化分析表明，三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger符合遺傳進化規(guī)律。

利用RT-qPCR分析表明三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因的表達具有組織特異性，與普通濱蟹Na+/H+-exchanger基因的研究結(jié)果一致［17］，推測梭子蟹科甲殼動物Na+/H+-exchanger基因在鹽度適應(yīng)過程中主要在鰓組織中特異性表達。根據(jù)鹽度脅迫過程中各實驗組和對照組三疣梭子蟹鰓組織中Na+/H+-exchanger基因的表達規(guī)律及特點，推測三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在鹽度適應(yīng)過程中主要在低鹽環(huán)境下起作用，在高鹽環(huán)境中作用不明顯。鹽度5實驗組在0—24h內(nèi)表達量顯著高于鹽度10和20實驗組，推測低鹽環(huán)境對Na+/H+-exchanger基因的表達具有促進作用，Na+/H+-exchanger基因在極低鹽度環(huán)境下的作用更加明顯。鹽度5、10和20實驗組在24—168h表達量出現(xiàn)再次上調(diào)，推測是由于滲透壓調(diào)控后期需要Na+/H+-exchanger基因的再表達以補充前期損失Na+/H+-exchanger，與滲透壓水平的維持有關(guān)，鹽度5、10和20實驗組在24—168h的部分時間表達量低于對照組，推測是因為前期Na+/H+-exchanger基因的高表達已滿足滲透調(diào)節(jié)作用，高表達的Na+/H+-exchanger可能對Na+/ H+-exchanger基因的轉(zhuǎn)錄水平具有負反饋作用。鹽度50實驗組基因表達量在24—168h內(nèi)表達量顯著低于對照組，推測是因為高鹽度對基因表達產(chǎn)生抑制。

通過對三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因的克隆、鑒定以及表達分析，初步明確了該基因的序列特征及其在鹽度適應(yīng)過程中的生理作用，為水生甲殼動物Na+/H+-exchanger基因分子方面的研究和三疣梭子蟹耐低鹽新品系的選育提供了一定理論參考。

［1］Sun Y M，Song Z L，Yan R S，et al. Preliminary study on the growth of Portunus trituberculatus ［J］. Acta Ecologica Sinica，1984，4（1）：57—64 ［孫穎民，宋志樂，嚴瑞深，等. 三疣梭子蟹生長的初步研究. 生態(tài)學(xué)報，1984，4（1）：57—64］

［2］Li J，Liu P，Gao B Q，et al. The new variety of Portunus trituberculatus “Huangxuan No.1” ［J］. Progress in Fishery Sciences，2013，34（5）：51—57 ［李健，劉萍，高保全，等. 三疣梭子蟹新品種“黃選1號”的選育. 漁業(yè)科學(xué)進展，2013，34（5）：51—57］

［3］Yu J H，Pan L Q. Prokaryotic expression of C-type lectin like-domain protein gene of Portunus tritubrculatus and activity analysis of recombinant protein ［J］. Progress in Fishery Sciences，2013，34（5）：58—63 ［于金紅，潘魯青.三疣梭子蟹C-型凝集素的原核表達和活性檢測. 漁業(yè)科學(xué)進展，2013，34（5）：58—63］

［4］Sui Y N，Gao B Q，Liu P，et al. The tolerance to and optimal salinity for growth in swimming crab Portunus trituberculatus “Huangxuan No. 1” ［J］. Journal of Dalian Ocean University，2012，27（5）：398—401 ［隋延鳴，高保全，劉萍，等. 三疣梭子蟹“黃選1號”鹽度耐受性及適宜生長鹽度分析. 大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27（5）：398—401］

［5］Wang C，Jiang L X，Wang R J，et al. Effect of abrupt and gradual changes in salinity on development and feeding in juvenile swimming crab（Portunus trituberculatus） ［J］. Fisheries Science，2010，29（9）：510—514 ［王沖，姜令緒，王仁杰，等. 鹽度驟變和漸變對三疣梭子蟹幼蟹發(fā)育和攝食的影響. 水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（9）：510—514］

［6］Zhou S L，Jiang N C，Lu J P，et al. Progress of the study on osmotic regulation in crustacean Ⅰ. The gill's structure and function and its' concerned factors ［J］. Donghai Marine Science，2001，19（1）：44—51 ［周雙林，姜乃澄，盧建平，等. 甲殼動物滲透壓調(diào)節(jié)的研究進展Ⅰ. 鰓的結(jié)構(gòu)與功能及其影響因子. 東海海洋，2001，19（1）：44—51］

［7］Péqueux A. Osmotic regulation in crustaceans ［J］. Journal of Crustacean Biology，1995，15（1）：51—60

［8］Zhao L，Long X W，Wu X G，et al. Effects of water salinity on osmoregulation and physiological metabolism of adult male Chinese mitten crab Eriocheir sinensis ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica，2016，40（1）：27—34 ［趙磊，龍曉文，吳旭干，等. 水體鹽度對中華絨螯蟹成體雄蟹滲透壓調(diào)節(jié)和生理代謝的影響. 水生生物學(xué)報，2016，40（1）：27—34］

［9］Morris S. Neuroendocrine regulation of osmoregulation and the evolution of air-breathing in decapod crustaceans［J］. The Journal of Experimental Biology，2001，204（Pt5）：979—989

［10］Mcnamara J C，F(xiàn)aria S C. Evolution of osmoregulatory patterns and gill ion transport mechanisms in the decapod Crustacea：A review ［J］. Journal of Comparative Physiology B，2012，182（8）：997—1014

［11］Freire C A，Onken H，McNamara J C. A structure-function analysis of ion transport in crustacean gills and excretory organs ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology，A：Comparative Physiology，2008，151（3）：272—304

［12］Onken H，Riestenpatt S. NaCl absorption across split gill lamellae of hyperregulating crabs：Transport mechanisms and their regulation ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part A Molecular and Integrative Physiology，1998，119（119）：883—893

［13］Kirschner L B. The mechanism of sodium chloride uptake in hyperregulating aquatic animals ［J］. Journal of Experimental Biology，2004，207（9）：1439—1452

［14］Shetlar R E，Towle D W. Electrogenic sodium-proton exchange in membrane vesicles from crab（Carcinus maenas） gill ［J］. American Journal of Physiology，1989，257（4Pt2）：R924—R931

［15］Burnett L E，Towle D W. Sodium ion uptake by perfusedgills of the blue crab Callinectes sapidus：effects of ouabain and amiloride ［J］. Journal of Experimental Biology，1990，149（1）：293—305

［16］Lucu ?edomil. Ion transport in gill epithelium of aquatic Crustacea ［J］. Journal of Experimental Zoology，1993，265（4）：378—386

［17］Towle D W，Rushton M E，Heidysch D，et al. Sodium/proton antiporter in the euryhaline crab Carcinus maenas：molecular cloning，expression and tissue distribution ［J］. Journal of Experimental Biology，1997，200（Pt6）：1003—1014

［18］Ma J W，Lü J J，Liu P，et al. Effects of abrupt salinity stress on serum osmolarity and ion concentration of“Huangxuan No.1” Portunus trituberculatus ［J］. Progress in Fishery Sciences，2016，37（1）：58—62 ［馬金武，呂建建，劉萍，等. 急性鹽度脅迫對三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）“黃選1號”血清滲透壓及離子含量的影響. 漁業(yè)科學(xué)進展，2016，37（1）：58—62］

［19］Lü J J，Liu P，Wang Y，et al. Transcriptome analysis of Portunus trituberculatus in response to salinity stress provides insights into the molecular basis of osmoregulation ［J］. PloS One，2013，8（12）：1—15

［20］Xu Q H，Liu Y. Gene expression profiles of the swimming crab Portunus trituberculatus exposed to salinity stress ［J］. Marine Biology，2011，158（10）：2161—2172

［21］Bianchini L Pousségur J. Molecular structure and regulation of vertebrate Na+/H+exchangers ［J］. Journal of Experimental Biology，1994，196（6）：337—345

［22］Ali M Y，Pavasovic A，Amin S，et al. Comparative analysis of gill transcriptomes of two freshwater crayfish，Cherax cainii and C. destructor ［J］. Marine Genomics，2015，22：11—13

［23］Ali M Y，Pavasovic A，Mather P B，et al. Analysis，characterisation and expression of gill-expressed carbonic anhydrase genes in the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus ［J］. Gene，2015，564（2）：176—187

NA+/H+-EXCHANGER IN SWIMMING CRAB（PORTUNUS TRITUBERCULATUS）：CLONING，CHARACTERIZATION AND MRNA EXPRESSION UNDER SALINITY STRESS

MA Jin-Wu1，2，Lü Jian-Jian1，3，LIU Ping1，3，GAO Bao-Quan1，3and LI Jian1，3
（1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China； 2. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China； 3. Laboratory for Marine Fisheries and Aquaculture，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266071，China）

Na+/H+-exchanger is a membrane-associated enzyme responsible for the active transport of Na+and H+ions across cell membranes and generating chemical and electrical gradients. It plays an important role in salinity adaptation process of aquatic crustacean. The swimming crab（Portunus trituberculatus） distributes widely in the coastal waters of Japan，Korean and China，which is a commercially important marine crab in China. Growth，development and immunity of the crab are significantly affected by salinity variation. In order to investigate the function of Na+/H+-exchanger in P. trituberculatus under salinity stress，Na+/H+-exchanger cDNA（GenBank：KU519329） was cloned from gill tissue of P. trituberculatus by RACE（rapid-amplification of cDNA ends）. The full-length of Na+/H+-exchanger cDNA was 4 233 bp（base pairs） including a 519 bp 5′-untranslated region（UTR），a 2961 bp ORF（open reading frame）and a 753 bp 3′-UTR. The ORF encoded 986 amino acids with calculated molecular weight 110.8 kD and theoretical isoelectric point 7.42. Comparison with homologous proteins showed that the deduced Na+/H+-exchanger sequence has the highest sequence identity to Carcinus maenas（87.2%），and the two sequences were clustered into one group by phylogenetic analysis. Typical domains including one signal peptide，one Na+/H+-exchanger domain and twelve transmembrane alpha helixes were found in amino acid sequence of Na+/H+-exchanger. Results of RT-qPCR showed that P. trituberculatus Na+/H+-exchanger was the highest expressed in gill. During salinity stress，the expression of Na+/H+-exchanger of gill in low salinity groups（5，10 and 20） increased significantly during 0—12h. Subsequently，the expression was down-regulated during 24—168h. The expression of Na+/H+-exchanger in gill in high salinity group（50） was almost no change compared to control group during 0—12h，and the expression level significantly decreased compared with the control group during 24—168h. Low salinity significantly induced the expression of Na+/H+-exchanger gene，suggesting that Na+/H+-exchanger of P. trituberculatus plays a vital role mainly in low salt conditions in the process of salinity adaptation.

Portunus trituberculatus； Na+/H+-exchanger； Gene cloning； Salinity stress； Expression analysis

S965.1

A

1000-3207（2016）05-0902-06

10.7541/2016.116

2016-01-29；

2016-04-21

國家自然科學(xué)基金面上項目（41576147，41306177）； 2015年泰山領(lǐng)軍人才工程高效生態(tài)農(nóng)業(yè)創(chuàng)新類計劃（LJNY2015002）； 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室鰲山科技創(chuàng)新計劃項目（2015ASKJ02）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China（Grant No. 41576147 and 41306177）； the Project of Taishan Scholars Leading Talent（LJNY2015002）； The Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology（No. 2015ASKJ02）］

馬金武（1990—），男，山東臨沂人； 碩士研究生； 主要從事三疣梭子蟹遺傳育種工作。E-mail：1007431629@qq.com

劉萍，研究員； E-mail：liuping@ysfri.ac.cn