雙抗夾心ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆

李小宇，張春雨，郭東全，張淋淋，尤 晴，董英山，王永志,，李啟云,（.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，東北作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 公主嶺 600；.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 5000；.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 08）

雙抗夾心ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆

李小宇1，張春雨1，郭東全1，張淋淋2，尤 晴3，董英山1，王永志1,*，李啟云1,*
（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，東北作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 公主嶺 136100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

為快捷有效地檢測(cè)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆，利用已制備的抗除草劑Bar基因編碼蛋白，膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT）單克隆抗體和多克隆抗體，建立PAT蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆不同組織材料進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，最佳檢測(cè)條件為捕獲抗體質(zhì)量濃度0.125 μg/mL，包被酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h后4 ℃靜置過(guò)夜，檢測(cè)樣品37 ℃孵育1.5 h，檢測(cè)抗體質(zhì)量濃度6.25 μg/mL，37 ℃孵育1.5 h；PAT蛋白的最低檢測(cè)限為0.04 ng/mL，大豆蛋白體系中為8 ng/mL；重復(fù)性變異系數(shù)小于3%。利用上述檢測(cè)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)建立的轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆進(jìn)行PAT蛋白定量檢測(cè)，成功地在根、莖、花、葉、種子不同部位檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)。

Bar；雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附；大豆；檢測(cè)

草丁膦是一種低毒除草劑，其有效成分為膦絲菌素（phosphinothricin，PPT），Bar基因?yàn)榭钩輨┗?，編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT）蛋白能夠使除草劑的有效成分PPT自由基乙?；?，從而失去對(duì)植物的毒性[1-2]。目前，已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)Bar基因的農(nóng)作物，并開(kāi)始大面積應(yīng)用[3-6]。我國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)普遍采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和Southern印記雜交等實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)方法[7-13]，雖然PCR檢測(cè)靈敏性高，但PCR檢測(cè)重復(fù)性差，而Southern雜交耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、難以在基層推廣。以檢測(cè)外源蛋白為目的的試紙條法[14]，適合初篩檢驗(yàn)，但靈敏度相對(duì)較低。而基于免疫學(xué)的雙抗夾心ELISA檢測(cè)法具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)樣品的高通量等特點(diǎn)。

本研究以已制備的PAT蛋白單克隆抗體和多克隆抗體為基礎(chǔ)，建立了一套適用于轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)捕獲抗體工作條件、樣品孵育條件和檢測(cè)抗體工作條件的優(yōu)化，提高了該檢測(cè)方法的靈敏性和準(zhǔn)確性，并適合于基層的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室已制備保存PAT蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體[15]；酶標(biāo)抗體 美國(guó)Sigma公司；轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

BioTek酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雙抗夾心ELISA方法的建立

捕獲抗體包被96 孔酶標(biāo)板，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，3 次重復(fù)，磷酸緩沖液（phosphate buffer solution with Tween-20，PBST）振蕩清洗3 遍；5%脫脂奶封閉液37 ℃封閉1 h，PBST振蕩清洗3 遍；檢測(cè)樣品37 ℃孵育，PBST振蕩清洗3 遍；檢測(cè)抗體37 ℃孵育，PBST振蕩清洗3 遍；酶標(biāo)抗體37 ℃孵育1 h，PBST振蕩清洗6 遍，拍干；室溫避光條件下鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）顯色，2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm值。根據(jù)公式OD490nm樣品（P值）/OD490nm陰性（N值）＞2.1為陽(yáng)性判定檢測(cè)結(jié)果。

1.3.2 雙抗夾心ELISA方法的優(yōu)化

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的4 株P(guān)AT蛋白單克隆抗體，運(yùn)用雙抗夾心ELISA基本程序進(jìn)行檢測(cè)，3 次重復(fù)，選擇P/N最大值對(duì)應(yīng)的PAT蛋白單克隆抗體或組合為捕獲抗體。檢測(cè)抗體為實(shí)驗(yàn)室已制備保存的PAT蛋白兔源多克隆抗體，根據(jù)方陣滴度法確定捕獲抗體和檢測(cè)抗體最佳工作質(zhì)量濃度[16-17]。優(yōu)化捕獲抗體包被時(shí)間、檢測(cè)樣品孵育時(shí)間和檢測(cè)抗體孵育時(shí)間，確定最佳工作條件。

1.3.3 雙抗夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度

按優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法，取連續(xù)稀釋度的PAT蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)不同質(zhì)量濃度孔均取3 個(gè)平行。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出滿(mǎn)足該方法的線性方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出雙抗夾心ELISA檢測(cè)PAT蛋白的最低檢測(cè)限。

提取非轉(zhuǎn)基因大豆籽粒蛋白，將PAT蛋白梯度稀釋?zhuān)謩e與大豆蛋白混合，按優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)PAT蛋白，檢驗(yàn)該方法在大豆籽粒蛋白環(huán)境下的靈敏度。

為驗(yàn)證所提模型的實(shí)用性，選取某市物流企業(yè)擬選ELV充電站址作為研究對(duì)象，對(duì)備選方案的實(shí)際指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)?；A(chǔ)數(shù)據(jù)如表2所示。

1.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

板內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法分別檢測(cè)8 份轉(zhuǎn)Bar基因大豆陽(yáng)性葉片和種子，每份檢測(cè)材料3 孔平行，根據(jù)每份檢測(cè)材料P/N值計(jì)算出板內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

換板重復(fù)該實(shí)驗(yàn)：根據(jù)測(cè)得的P/N值計(jì)算出板間每份檢測(cè)材料的板間標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.3.5 檢測(cè)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆

采集轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆不同組織，3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的小區(qū)內(nèi)采集不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子，每個(gè)部分取0.1～0.2 g，液氮研磨，PBS緩沖液1∶10倍稀釋?zhuān)?00 mg‘100 μL），12 000 r/min離心20 min，上清液為待測(cè)樣品液，優(yōu)化后，采用雙抗夾心ELISA方法定量檢測(cè)PAT蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAT蛋白雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

根據(jù)OD490nm測(cè)定結(jié)果，以P/N最大值確定各個(gè)工作參數(shù)。如表1所示，單克隆抗體10C8 P/N值最大，定為捕獲抗體；采用矩陣滴定法確定捕獲抗體和檢測(cè)抗體工作質(zhì)量濃度，表2表明，當(dāng)捕獲抗體工作質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL，檢測(cè)抗體工作質(zhì)量濃度為6.25 μg/mL時(shí)，OD490nm值大于1.0，并且稀釋度高，本底低。對(duì)捕獲抗體包被時(shí)間、檢測(cè)樣品孵育時(shí)間和檢測(cè)抗體孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，如表2、圖1和圖2所示，捕獲抗體孵育時(shí)間37 ℃、1 h后4 ℃靜置過(guò)夜，檢測(cè)樣品孵育時(shí)間1.5 h，檢測(cè)抗體孵育時(shí)間1.5 h時(shí)，P/N值最大。說(shuō)明采用優(yōu)化后的工作參數(shù)，PAT蛋白雙抗夾心ELISA檢測(cè)反應(yīng)最佳。

表1 捕獲抗體的確定（OD490 nm值）Table 1 Determination of optimal working concentration of capture antibody (OD490 nm)

表2 矩陣滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果（OD490 nm值）Table 2 The results of matrix titration experiments (OD490 nm)

圖1 捕獲抗體孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.1 Effect of capture antibody incubation time on the results of detection

圖2 抗原孵育時(shí)間和檢測(cè)抗體孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.2 Effect of antigen incubation time on the results of detection

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

圖3 靈敏度檢測(cè)Fig.3 Sensitivity of the detection method

如圖4所示，在大豆蛋白環(huán)境中，PAT蛋白質(zhì)量濃度從8 μg/mL開(kāi)始做10 倍稀釋梯度，當(dāng)PAT質(zhì)量濃度為8 ng/mL，P/N值＞2.1，說(shuō)明在大豆蛋白環(huán)境中，各種蛋白酶的作用下，PAT蛋白的最低檢測(cè)限高于PAT蛋白體外最低檢測(cè)限。

2.3 重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)8 份檢測(cè)材料進(jìn)行板內(nèi)和板間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，表3表明，板內(nèi)變異系數(shù)為0.5%～2.2%，板間變異系數(shù)為0.3%～2.0%，變異系數(shù)均小于3%，表明建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

表3 板內(nèi)和板間重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of repetitive experiments

2.4 檢測(cè)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆

表4 不同組織中PAT蛋白表達(dá)量Fig.4 The expression levels of PAT protein in different tissues μg/g

對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆材料進(jìn)行檢測(cè)，表4表明，PAT蛋白在大豆全株都有表達(dá)，可以很好地控制除草劑的危害。不同生長(zhǎng)期PAT蛋白表達(dá)量有較大的差異，除7111號(hào)植株外，其他檢測(cè)植株花葉含量最高，根、莖、葉及種子中的PAT蛋白含量均極顯著低于花葉，且各個(gè)組織中PAT蛋白表達(dá)量差異也極顯著（P＜0.01）。

3 討 論

ELISA檢測(cè)技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，其反應(yīng)條件是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素。對(duì)微孔封閉是雙抗夾心ELISA檢測(cè)法中非常重要的一步，它可以減少抗原蛋白非特異性吸附，從而使檢測(cè)結(jié)果更加精確。在檢測(cè)中，由于材料中目的蛋白量較少，為了增加檢出幾率，可以選擇不進(jìn)行封閉[18-19]，雖然可以增加抗原結(jié)合量，但也會(huì)使檢測(cè)抗體發(fā)生非特性吸附，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性。本研究采用了5%脫脂奶封閉液對(duì)微孔進(jìn)行了徹底的封閉，從而增加了檢測(cè)法的準(zhǔn)確性。

ELISA實(shí)驗(yàn)中酶標(biāo)抗體標(biāo)記酶的選擇至關(guān)重要，使用辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作為中間催化酶的酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定放大系統(tǒng)的建立，很大程度上提高了酶免疫實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)敏感性[20]。另外，常用的作用底物OPD在靈敏度方面優(yōu)于5-氨基水楊酸和鄰聯(lián)苯甲胺。所以，本實(shí)驗(yàn)中使用了OPD作為HRP的底物。

國(guó)內(nèi)有研究以多克隆抗體作為捕獲抗體，單克隆抗體作為檢測(cè)抗體[21-23]，由于單克隆抗體識(shí)別的抗原表位有可能與多克隆抗體識(shí)別的抗原表位重疊，形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這樣影響檢測(cè)抗體與檢測(cè)樣品的結(jié)合，降低檢測(cè)靈敏度；多克隆抗體對(duì)抗原表位的親和力不同，容易造成后期洗滌中結(jié)合物的脫落；而以單抗作為捕獲抗體，多抗作為檢測(cè)抗體，可以在保證檢測(cè)方法特異性的前提下，最大程度提高檢測(cè)靈敏度。另外，本研究建立雙抗夾心ELISA方法與間接ELISA方法[24]比較，具有富集作用，特異性更強(qiáng)，能夠高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)待測(cè)樣品。

我國(guó)是大豆的原產(chǎn)地，也是最大的進(jìn)口國(guó)，由于國(guó)內(nèi)大豆需求量逐漸升高，我國(guó)每年都需要從美國(guó)、巴西和阿根廷等地進(jìn)口大量轉(zhuǎn)基因大豆[25]，同時(shí)我國(guó)研究學(xué)者也在積極推進(jìn)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的研究與推廣。本研究建立PAT蛋白雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，可以快速有效地定量檢測(cè)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆，為轉(zhuǎn)基因大豆及其相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)提供參考。

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Double-Antibody Sandwich ELISA for the Detection of Transgenic Bar Gene Herbicide-Tolerant Soybeans

LI Xiaoyu1, ZHANG Chunyu1, GUO Dongquan1, ZHANG Linlin2, YOU Qing3, DONG Yingshan1, WANG Yongzhi1,*, LI Qiyun1,*
(1. Jilin Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northeast, Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling 136100, China; 2. College of Plant Protection, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 3. College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

To rapidly and efficiently detect transgenic Bar herbicide-tolerant soybeans, we produced a monoclonal antibody and a polyclonal antibody against phosphinothricin acetyltransferase (PAT) protein encoded by the Bar gene and then utilized them to established a double-antibody sandwich ELISA system for the detection of PAT protein, which could quantify PAT in different tissues and materials from transgenic Bar herbicide-tolerant soybeans. Reaction conditions were optimized as follows: 0.125 μg/mL capture antibody was coated onto the microtiter plates at 4 ℃ overnight after incubation at 37 ℃ for 1 h, the antigen was incubated at 37 ℃ for 1.5 h, and the detection antibody at 6.25 μg/mL was incubated at 37 ℃ for 1.5 h. The detection sensitivity was 0.04 ng/mL for purified PAT and 8 ng/mL for crude soybean protein. The coefficient of variation of reproducibility was less than 3%. This method has been successfully applied to detect the expression of PAT in the root, stem, leaf, flower and seed of transgenic soybean.

Bar; double-antibody sandwich ELISA; soybeans; detection

10.7506/spkx1002-6630-201604040

Q788

A

1002-6630（2016）04-0222-04

李小宇, 張春雨, 郭東全, 等. 雙抗夾心ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑大豆[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 222-225.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604040. http://www.spkx.net.cn

LI Xiaoyu, ZHANG Chunyu, GUO Dongquan, et al. Double-antibody sandwich ELISA for the detection of transgenic Bar gene herbicide-tolerant soybeans[J]. Food Science, 2016, 37(4): 222-225. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604040. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20130101089JC）；吉林省中青年科技領(lǐng)軍人才及優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（20121812）；

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)（2014ZX08004）

李小宇（1981—），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)橹参锊《九c生物反應(yīng)器。E-mail：lxyzsx@163.com

*通信作者：王永志（1978—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)橹参锊《九c生物反應(yīng)器。E-mail：yzwang@126.com

李啟云（1974—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)。E-mail：qyli1225@126.com