無斑鷂鲼蛋白質(zhì)對大鼠膽固醇代謝的影響

丁 琳，王 丹，薛 勇，薛長湖，王玉明*

無斑鷂鲼蛋白質(zhì)對大鼠膽固醇代謝的影響

丁 琳，王 丹，薛 勇，薛長湖，王玉明*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

目的：探討無斑鷂鲼蛋白（Aetobatus fl agelum protein，AFP）對高膽固醇模型大鼠膽固醇代謝的影響，并對其可能的作用機(jī)制加以研究。方法：5 周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為酪蛋白對照組、5% AFP組、10% AFP組，分別給予高膽固醇飼料及分別添加5%和10% AFP的高膽固醇飼料。28 d后測定大鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，肝臟TC、游離膽固醇水平，糞便中膽汁酸和中性固醇含量以及肝臟3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶2（acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase 2，ACAT2）、膽固醇7α-羥化酶1（cholesterol 7α-hydroxylase 1，CYP7A1）的mRNA表達(dá)量。結(jié)果：與酪蛋白對照組相比，無斑鷂鲼蛋白可顯著降低大鼠血清和肝臟中的TC含量（P＜0.05），明顯增加血清HDL-C含量（P＜0.05），極顯著降低大鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（P＜0.01）。此外，無斑鷂鲼蛋白可明顯增加大鼠糞便中膽汁酸和中性固醇的排出量（P＜0.05），并可降低大鼠肝臟中ACAT2 mRNA的表達(dá)量（P＜0.05），增加CYP7A1 mRNA的表達(dá)量（P＜0.05），而對HMG-CoA mRNA的作用不顯著。結(jié)論：無斑鷂鲼蛋白可明顯降低大鼠血清和肝臟中的TC含量，降低大鼠血清動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，其作用機(jī)制主要與增加肝臟內(nèi)膽固醇的分解代謝以及促進(jìn)糞便中性固醇和膽汁酸的排出有關(guān)。

無斑鷂鲼蛋白；膽固醇代謝；作用機(jī)制

越來越多的研究證明，心血管疾病與高膽固醇飲食密切相關(guān)，并且其發(fā)病機(jī)理主要與非高密度脂蛋白膽固醇以及膽固醇分解合成相關(guān)酶的表達(dá)量有關(guān)[1-2]。目前已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明硬骨魚類具有調(diào)節(jié)膽固醇代謝的作用[3-4]，但關(guān)于軟骨魚類的類似作用鮮少報(bào)道。

無斑鷂鲼（Aetobatus fl agelum）屬軟骨魚亞綱，鲼形目，鷂鲼科暖水性底層魚類。無斑鷂鲼主要攝食貝類和甲殼動(dòng)物，一般體長為90～160 cm、體質(zhì)量較大者可達(dá)25～30 kg。無斑鷂鲼主要分布于印度洋和太平洋西部，我國東海和南海均可以捕獲[5]。無斑鷂鲼一般被加工成干品或用于生產(chǎn)魚粉，利用價(jià)值較低。為了充分有效地利用天然水產(chǎn)資源，開發(fā)調(diào)節(jié)脂肪代謝的新產(chǎn)品，提高低值水產(chǎn)品的利用價(jià)值，本課題組對無斑鷂鲼蛋白的血脂調(diào)節(jié)功能進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明無斑鷂鲼蛋白可降低大鼠血液和肝臟中甘油三酯（triglyceride，TG）水平，對高TG血癥具有預(yù)防作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，喂食大鼠不含膽固醇飼料時(shí)，無斑鷂鲼蛋白可降低大鼠肝臟膽固醇水平，但是卻不影響血清總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平[6]。本實(shí)驗(yàn)在大鼠飼料中添加外源性膽固醇，形成膳食致高膽固醇血癥大鼠模型，在此條件下探討無斑鷂鲼蛋白對大鼠膽固醇代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

無斑鷂鲼購自石島港，－20 ℃保存。

SPF級5 周齡雄性Spague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量190～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2007-0001。

總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒 北京中生生物工程高技術(shù)公司；游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）測定試劑盒、總膽汁酸測定試劑盒日本和光純藥株式會(huì)社；Trizol試劑、各種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)品（Assayson-Demand Gene Expression Products和Taq Man MGB Gene Expression Kits） 美國Invitrogen公司；Taq Man RT reagent試劑盒、Taq Man Universal PCR Master Mix試劑盒 美國Applied Biosystems公司；其他生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550分光光度計(jì)、GC-14AH氣相色譜儀 日本島津公司；TC-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）日本GL Science公司；ABI Prism 7000實(shí)時(shí)熒光PCR序列檢測系統(tǒng) 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 無斑鷂鲼肌肉的制備

取新鮮無斑鷂鲼背部兩側(cè)肌肉，去除軟骨并切碎勻漿，經(jīng)冷凍干燥后粉碎作為樣品無斑鷂鲼蛋白（Aetobatus flagelum protein，AFP）。經(jīng)凱氏定氮法測得AFP的粗蛋白含量為98.1%，氨基酸組成同文獻(xiàn)[6]測定結(jié)果一致。索氏提取法測得AFP的總脂質(zhì)含量為0.6%，采用氣相色譜法[7]測得AFP總脂質(zhì)的脂肪酸組成，結(jié)果如表1所示。

表1 AFP總脂質(zhì)的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of AFP fat

1.3.2 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

5 周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量190～200 g，動(dòng)物飼育室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按體質(zhì)量隨機(jī)分為兩組，每組7 只。大鼠配合飼料脂肪含量為5%玉米油和5%豬油，并添加1%膽固醇和0.25%膽酸鈉，其他成分按AIN-76配方配制。酪蛋白對照組大鼠喂食基本配合飼料，兩個(gè)受試組大鼠飼料中分別添加5%和10%的AFP（5% AFP組、10% AFP組），蛋白質(zhì)不足部分加入酪蛋白使之與酪蛋白對照組大鼠的蛋白攝取量相同。將每只大鼠放入鋼絲籠內(nèi)飼養(yǎng)，室溫（23±2） ℃，7：00—19：00照明，飼料和水自由攝食。喂食4 周后，10 h斷食不斷水，在08：00—10：00乙醚麻醉下取動(dòng)脈全血處死大鼠，取出肝臟于－80 ℃存放待用。

1.3.3 大鼠血清和肝臟內(nèi)膽固醇含量測定

血液室溫放置30 min后3 000 r/min離心獲得血清，按照試劑盒說明書方法測定TC、HDL-C水平，動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）測定按下式進(jìn)行。肝臟脂質(zhì)按Folch等[8]的方法抽提后濃縮，TC、FC含量采用試劑盒測定，操作嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。

1.3.4 大鼠糞便中膽汁酸和中性固醇含量的測定[9]

連續(xù)2 d取大鼠糞便（大鼠處死前2 d），凍干后稱質(zhì)量。磨碎后取100 mg加入適量內(nèi)標(biāo)物5α-膽甾醇，再加乙醇反復(fù)抽提3 次，減壓蒸干。加適量NaOH，于120 ℃加熱6 h使結(jié)合型膽汁酸游離。冷卻至室溫后加入乙醚抽提3 次獲得總固醇類樣品，剩余溶液加適量鹽酸調(diào)至酸性，再用乙醚抽提3 次作為總膽汁酸樣品?？偰懼岷坎捎迷噭┖袦y定?？偣檀碱惡坑脷庀嗌V法測定，進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測口溫度300 ℃，色譜柱溫度280 ℃，進(jìn)行恒溫分析。

1.3.5 大鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的測定

肝臟膽固醇代謝相關(guān)酶mRNA定量采用實(shí)時(shí)熒光PCR法。肝臟總RNA提取使用Trizol試劑盒，操作按照說明書方法進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用Taq Man RT reagent試劑盒、PCR反應(yīng)使用Taq Man Universal PCR Master Mix試劑盒，按照說明書步驟操作。各種PCR引物見表2。大鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)酶mRNA表達(dá)量以其與18S rRNA量的比值表示，并規(guī)定對照組為100%[10]。

表2 所需引物序列Table 2 Primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)以±s表示，3 組間采用Duncan’s多重比較分析，以P＜0.05為差異顯著，兩組之間采用t檢驗(yàn)法處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFP對大鼠生長指標(biāo)的影響

如表3所示，不同處理組大鼠在28 d實(shí)驗(yàn)期內(nèi)的初體質(zhì)量、終體質(zhì)量及每天的攝食量基本相同，無顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與酪蛋白對照組大鼠相比，5% AFP組、10% AFP組大鼠的肝臟質(zhì)量明顯降低。

表3 AFP對大鼠生長指標(biāo)的影響 (x± s, n= 7)Table 3 Effect of Aetobatus flfl agelum protein on the growth parameters in rats (x± s, n= 7)

2.2 AFP對大鼠血脂水平的影響

表4 AFP對大鼠血清脂質(zhì)水平的影響 (x± s, n= 7)Table 4 Effect of Aetobatus flfl agelum protein on concentrations of serum lipids in SD rats (x± s, n= 7)

由表4可知，攝食AFP后，大鼠血清中TC水平明顯低于酪蛋白對照組，而HDL-C水平高于酪蛋白對照組，與酪蛋白對照組相比，5% AFP組、10% AFP組大鼠血清中TC水平分別降低了35.4%和42.5%，HDL-C水平分別升高了21.0%和36.9%，攝食AFP的大鼠AI明顯低于酪蛋白對照組。

2.3 AFP對大鼠肝臟膽固醇水平的影響

表5 AFP對大鼠肝臟脂質(zhì)含量的影響（x±s，n ＝7）Table 5 Effect of Aetobatus flfl agelum protein on concentrations of hepatic cholesterol in SD rats (x±s，n = 7)

由表5可知，攝食5%、10% AFP后，大鼠肝臟TC含量顯著降低，較酪蛋白對照組分別降低了20.7%和34.8%，其中10% AFP組的效果最佳。進(jìn)一步測定大鼠肝臟組織中FC和膽固醇酯發(fā)現(xiàn)，攝食AFP后大鼠肝臟組織中FC含量雖然降低，但與酪蛋白對照組相比差異不顯著，而膽固醇酯含量顯著下降。以上結(jié)果表明，食用AFP可以減少膽固醇在大鼠肝臟內(nèi)的蓄積。

2.4 AFP對大鼠糞便中膽汁酸和中性固醇排泄量的影響

表6 AFP對大鼠糞便中膽汁酸和中性固醇排泄量的影響（x± s, n=7）Table 6 Effect of Aetobatus flfl agelum protein on fecal bile acid and neutral steroid in SD rats (x± s, n= 7)

由表6可知，實(shí)驗(yàn)期間在相同時(shí)間內(nèi)所采集5%、10% AFP組和酪蛋白對照組大鼠的糞便質(zhì)量相等，而在此基礎(chǔ)上，5%、10% AFP組大鼠糞便的中性固醇、膽汁酸含量顯著高于酪蛋白對照組（P＜0.05），尤其以10% AFP組明顯。以上結(jié)果表明，攝食AFP可明顯促進(jìn)大鼠排泄膽固醇和膽汁酸。

2.5 AFP對大鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)酶mRNA表達(dá)量的影響

圖1 AFP對大鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)酶mRNA表達(dá)量的影響Fig.1 Effect of Aetobatus fl agelum ptotein on mRNA expression of hepatic enzymes involved in cholesterol metabolism in SD rats

如圖1所示，與酪蛋白對照組相比，10% AFP組大鼠肝臟膽固醇合成限速酶HMG-CoA mRNA的表達(dá)量降低，但沒有顯著差異；ACAT2是肝臟內(nèi)催化游離膽固醇與長鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯的關(guān)鍵酶，攝食AFP后，大鼠肝臟的ACAT2 mRNA表達(dá)量顯著降低，表明AFP能夠抑制膽固醇酯的合成；同時(shí)，攝食AFP能夠增加大鼠肝臟的CYP7A1 mRNA表達(dá)量，從而增強(qiáng)大鼠肝臟膽固醇的異化代謝。

3 討 論

研究表明，不同來源蛋白質(zhì)對動(dòng)物膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用不同，例如與酪蛋白相比，大豆蛋白可上調(diào)CYP7A1 mRNA的表達(dá)量，提高CYP7A1的活性，促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸，從而降低血清膽固醇水平[11]。不同水產(chǎn)魚肉蛋白對于膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用也有所不同，Wergedahl等[12]發(fā)現(xiàn)，大馬哈魚蛋白水解物能明顯降低大鼠血清TC、TG及肝臟總脂水平，Zhang Xizhong等[13]研究表明，歐蝶魚蛋白比鱈魚蛋白有更為明顯的降膽固醇效果。Shukla等[14]發(fā)現(xiàn)阿拉斯加鱈魚蛋白可顯著降低Wistar大鼠血清TC、TG濃度，但肝臟TC含量卻明顯增多，而Hosomi等[4]研究發(fā)現(xiàn)阿拉斯加狹鱈能夠降低大鼠血清膽固醇含量，并且能夠抑制膽固醇和膽汁酸的吸收。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攝食AFP可顯著改善大鼠膽固醇代謝狀況。

肝臟是膽固醇合成代謝的主要器官，直接影響血清TC含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在攝入蛋白質(zhì)含量一致的條件下，AFP可明顯降低大鼠血清TC含量，并且肝臟內(nèi)膽固醇水平明顯降低，提示肝臟膽固醇水平降低可能是血清TC含量降低的原因之一。肝臟主要通過調(diào)節(jié)膽固醇的合成、 吸收、酯化及向消化道內(nèi)排泄和重吸收（肝腸循環(huán)）等途徑以維持正常的膽固醇代謝水平。在膽固醇代謝過程中存在許多調(diào)控代謝的關(guān)鍵酶類、載脂蛋白、蛋白受體等膽固醇代謝的重要調(diào)控位點(diǎn)，對這些調(diào)控因子的研究可以準(zhǔn)確把握機(jī)體膽固醇代謝的調(diào)控路徑[15-17]。HMG-CoA是膽固醇合成的限速酶[18-19]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，攝食AFP對大鼠肝臟HMG-CoA mRNA表達(dá)量無顯著影響，說明其對肝臟內(nèi)TC含量的降低作用與膽固醇合成抑制無關(guān)。ACAT2可催化FC與長鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯，進(jìn)而組裝成脂蛋白，以脂蛋白的形式由肝臟向血液中分泌，為外周組織所利用，從而維持膽固醇在肝臟內(nèi)的代謝平衡[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無斑鷂鲼蛋白可顯著減少ACAT2 mRNA的表達(dá)量，表明無斑鷂鲼蛋白的攝入可能降低了肝臟內(nèi)膽固醇的酯化過程，影響了其向血液中的分泌，從而降低了血液中膽固醇的水平。CYP7A1是膽固醇降解為膽汁酸的關(guān)鍵酶[21]，肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇在CYP7A1的催化下脫氫生成7α-羥化膽固醇，經(jīng)多個(gè)酶促反應(yīng)步驟生成膽汁酸排出體外，已經(jīng)有研究證明，膽汁酸對CYP7A1具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，AFP的攝入顯著提高了肝臟CYP7A1基因的表達(dá)量，該結(jié)果提示AFP的攝入可能促進(jìn)了肝內(nèi)膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，降低肝內(nèi)膽固醇含量。

為了進(jìn)一步明確肝臟內(nèi)膽固醇代謝變化的原因，本實(shí)驗(yàn)對大鼠糞便中膽汁酸和中性固醇的排出量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示AFP攝入組大鼠糞便的中性固醇以及膽汁酸含量均顯著高于酪蛋白對照組，表明AFP可以明顯增加大鼠中性固醇和膽汁酸的排泄。大鼠肝腸循環(huán)受阻，膽汁酸排泄量增加[25-26]，這可能也是導(dǎo)致大鼠肝臟內(nèi)CYP7A1 mRNA表達(dá)量升高的原因。

綜上所述，AFP可明顯降低大鼠血清和肝臟中TC水平，降低大鼠血清AI，其 作用機(jī)制主要與增加肝臟內(nèi)膽固醇的分解代謝以及促進(jìn)糞便中性固醇和膽汁酸排出有關(guān)。

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Effect of Dietary Protein from Aetobatus fl agelum on Cholesterol Metabolism in Rats

DING Lin, WANG Dan, XUE Yong, XUE Changhu, WANG Yuming*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To investigate the effect of dietary Aetobatus fl agelum protein (AFP) on cholesterol metabolism in high cholesterol diet-fed rats and to explore the possible mechanism involved. Methods: Twenty-one male SD rats were randomly divided into 3 groups, including normal control group (casein), 5% AFP-treated group (containing 5% AFP), 10% AFP-treated group (containing 10% AFP). After 28 days of consecutive administration, serum total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), hepatic cholesterol concentrations (TC and free cholesterol), and fecal bile acid and neutral steroid were determined. The mRNA expression of key enzymes related to cholesterol metabolism, such as HMG-CoA reductase, acyl-CoA-cholesterol acyltrasferase 2 (ACAT2), and cholesterol 7α-hydroxylase 1 (CYP7A1), was also determined. Results: The levels of serum and hepatic TC were significantly decreased in rats fed AFP compared with the control group (P ＜ 0.05), while the concentration of serum HDL-C was increased and consequently the atherogenic index was very significantly decreased in the AFP groups compared with in control group (P ＜ 0.01). Moreover, dietary Aetobatus fl agelum protein significantly aggrandized the concentrations of fecal bile acid and neutral steroid (P ＜ 0.05). The activity of ACAT2 in liver was inhibited by dietary AFP, whereas the activity of hepatic HMG-CoA was not affected. On the other hand, the mRNA expression of the CYP7A1 gene was significantly decreased (P ＜ 0.05). Conclusion: Aetobatus fl agelum protein could significantly decrease serum and hepatic cholesterol accumulation, and lead to a decrease in serum atherogenic index, mainly through promoting the metabolism of cholesterol and the excretion of fecal bile acid and neutral steroid.

Aetobatus fl agelum protein; cholesterol metabolism; mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201601033

TS218

A

1002-6630（2016）01-0189-05

丁琳, 王丹, 薛勇, 等. 無斑鷂鲼蛋白質(zhì)對大鼠膽固醇代謝的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 189-193. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601033. http://www.spkx.net.cn

DING Lin, WANG Dan, XUE Yong, et al. Effect of dietary protein from Aetobatus fl agelum on cholesterol metabolism in rats[J]. Food Science, 2016, 37(1): 189-193. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601033. http://www.spkx.net.cn

2015-03-04

教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目（NCET-13-0534）；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)

丁琳（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)化學(xué)與分子營養(yǎng)學(xué)。E-mail：dinglin_ouc@163.com

*通信作者：王玉明（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)學(xué)。E-mail：wangyuming@ouc.edu.cn