黃鱔魚骨多肽制備及其抗氧化活性

賈韶千，李艷霞

黃鱔魚骨多肽制備及其抗氧化活性

賈韶千，李艷霞

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

以黃鱔魚骨為原料，選用不同蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，得到了具有較高抗氧化活性的黃鱔魚骨多肽。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化得到酶解黃鱔魚骨制備多肽的最佳工藝條件為：選用木瓜蛋白酶，底物質(zhì)量濃度40 mg/mL、酶添加量8 000 U/g、酶解溫度59.2 ℃、pH 5.8、酶解時(shí)間4.1 h，在此條件下得到的黃鱔魚骨多肽DPPH自由基清除率為90.85%。通過(guò)不同的體外抗氧化指標(biāo)對(duì)黃鱔魚骨多肽的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃鱔魚骨多肽具有良好的抗氧化活性，隨著多肽質(zhì)量濃度的升高，其抗氧化活性不斷增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

黃鱔魚骨；多肽；抗氧化活性

黃鱔（Monopterus albus），隸屬硬骨魚綱輻鰭亞綱、合鰓目合鰓科黃鱔屬溫?zé)釒У~類，俗稱鱔魚、田鱔或田鰻，亦名長(zhǎng)魚、血魚、羅魚、無(wú)鱗公子等[1-2]。黃鱔肉嫩味鮮，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。黃鱔作為眾多菜品的主要原料，其肉、血、皮、骨也有一定的藥用價(jià)值，是典型的藥食同源食品。

膠原多肽是膠原蛋白經(jīng)過(guò)蛋白酶水解得到的具有特殊生理活性的生物活性肽，分子質(zhì)量約3～20 ku[3]。近年來(lái)，已有學(xué)者對(duì)不同魚種進(jìn)行研究，通過(guò)不同的方法提取得到魚骨膠原蛋白，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工處理，開發(fā)制備出多種具有生理功能的活性多肽，主要有抗氧化活性肽、降壓肽、抗菌肽、抗腫瘤活性肽以及免疫調(diào)節(jié)肽等[4-7]。Nagai等[8]利用0.5 mol/L的醋酸從金槍魚、海鱸魚的魚骨及魚翅中提取得到了膠原蛋白，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了分析。Duan等[9]以鯉魚魚骨和鱗為原料，采用酸法提取得到了膠原蛋白，并進(jìn)一步對(duì)其變性溫度、氨基酸組成等進(jìn)行了分析研究。楊露等[10]采用現(xiàn)代生物酶解技術(shù)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，優(yōu)化馬面魚骨膠原多肽的制取工藝，并分析其理化特性及抗氧化功能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原多肽酶解液的抗氧化效果在質(zhì)量濃度為60 mg/mL時(shí)和同質(zhì)量濃度谷胱甘肽的抗氧化活性相當(dāng)，在25 mg/mL質(zhì)量濃度下的馬面魚骨膠原多肽液的羥自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率分別高達(dá)95.98%和97.36%，具有良好的抗氧化性。趙玲等[11]以鱈魚骨為原料，采用熱水提取法提取膠原蛋白，并采用中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶分別進(jìn)行酶解制備鱈魚骨膠原蛋白肽。研究結(jié)果表明4 種蛋白酶制備的鱈魚骨膠原蛋白肽對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基（O2－·）和·OH 3 種自由基均具有較好的清除能力，其中對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)且有較好的量效關(guān)系。由于蛋白肽螯合鈣穩(wěn)定性好、吸收率高。許多學(xué)者以魚骨為原料水解制取多肽，再與鈣鹽反應(yīng)制得多肽螯合鈣[12-14]。

黃鱔是我國(guó)重要的烹飪食材，淮揚(yáng)名菜“軟兜長(zhǎng)魚”就是以黃鱔為主要制作原料，作為江蘇省淡水養(yǎng)殖的主要品種之一，黃鱔每年的消費(fèi)量巨大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，江蘇省每年黃鱔的消費(fèi)量超過(guò)萬(wàn)噸，所產(chǎn)生的黃鱔魚骨就有上千噸。這些黃鱔魚骨通常作為廢棄物直接扔掉，或以非常低廉的價(jià)格處理給養(yǎng)殖場(chǎng)或飼料廠，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。因此，通過(guò)對(duì)黃鱔魚骨進(jìn)行系統(tǒng)的開發(fā)研究，生產(chǎn)出具有廣闊市場(chǎng)前景的產(chǎn)品，可以有效減少黃鱔資源的浪費(fèi)，顯著增加黃鱔的附加值。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)黃鱔魚骨進(jìn)行酶解，得到具有較高抗氧化活性的黃鱔魚骨多肽，為進(jìn)一步開發(fā)黃鱔魚骨功能產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃鱔魚骨，購(gòu)于江蘇省淮安市城南農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

堿性蛋白酶（酶活力為98.62 U/mg） 北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（酶活力為243.67 U/mg）、胃蛋白酶（酶活力為2 863.75 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活力為57.26 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（酶活力為2 462.13 U/mg）北京索萊寶科技有限公司。

石油醚、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯高鐵、鐵氰化鉀、硫氰酸銨、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、30%過(guò)氧化氫溶液 南京化學(xué)試劑有限公司；DPPH 日本W(wǎng)AKO公司；亞油酸德國(guó)Sigma公司；還原型谷胱甘肽、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、水楊酸、氯化亞鐵、菲洛嗪 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-25冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；BS-210S電子天平、PP-20-P11型pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；DK2-2型、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TU-1800PC型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TGL-IGC高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；2-16K型冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京盈鑫實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GRP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃鱔魚骨粉的制備

將黃鱔魚骨剪成3 cm左右的小段，去除油脂，置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥；然后通過(guò)萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)黃鱔魚骨進(jìn)行粉碎，過(guò)40 目篩，制備得到黃鱔魚骨粉。

1.3.2 蛋白酶的篩選

配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的黃鱔魚骨粉懸浮液，分別加入堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，酶添加量為6 000 U/g，混勻后分別在每種蛋白酶的最適宜溫度和pH值條件下振蕩酶解5 h，95 ℃滅酶10 min，3 000 r/ min離心15 min，取上清液測(cè)定酶解液的DPPH自由基清除率，選擇出最合適的蛋白酶。

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化

通過(guò)上述單酶實(shí)驗(yàn)，篩選出最適蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)，選擇酶添加量、pH值、酶解溫度和酶解時(shí)間4 個(gè)因素，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

在酶種類確定的情況下，影響蛋白質(zhì)水解的因素有底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間等[15]。其他試驗(yàn)條件固定，分別考察底物質(zhì)量濃度（10、20、30、40、50、60 mg/mL）、蛋白酶添加量（4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 U/g）、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶解溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）和酶解時(shí)間（1、2、3、4、5、6 h）對(duì)酶解效果的影響，做3 次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶添加量、pH值、酶解溫度和酶解時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.4 抗氧化活性研究

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

配制0.1 mmol/L的DPPH溶液（以95%的乙醇溶解DPPH）。稱取一定量的黃鱔魚骨酶解產(chǎn)物（干粉），用去離子水配成不同濃度的樣品溶液。取黃鱔魚骨酶解產(chǎn)物樣品溶液2.0 mL，加入DPPH溶液2.0 mL，混合均勻后，在常溫下避光反應(yīng)30 min，高速離心機(jī)10 000 r/min離心10 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A1），空白組為2.0 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液加入2.0 mL去離子水，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A2），對(duì)照組為2.0 mL DPPH溶液加上2.0 mL去離子水代替樣品，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A3），并以等體積去離子水和95%乙醇混合液空白調(diào)零[16-17]。按以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 金屬離子螯合能力的測(cè)定

分別稱取適量黃鱔魚骨酶解物溶解于蒸餾水中，配成一定濃度的樣品溶液。取0.5 mL的黃鱔魚骨酶解液，加入1 mL 20 μmol/L FeCl2，混合均勻，然后加入1 mL 0.5 mmol/L菲洛嗪溶液，振蕩均勻，在室溫下靜置10 min，在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A樣品），以等體積去離子水代替樣品溶液作為參照測(cè)定吸光度（A參照）[18-19]。金屬離子螯合率按下式計(jì)算。

1.3.4.3 還原能力的測(cè)定

吸取黃鱔魚骨酶解液2 mL，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6），然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3FeCN6溶液2 mL，混合均勻后置于50 ℃水浴下保持20 min，然后加入10%的TCA溶液2 mL，混合均勻，置于離心機(jī)中3 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液，振蕩混勻后置于50 ℃水浴下保持10 min，體系溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以去離子水作為空白，吸光度越大，說(shuō)明抗氧化能力越強(qiáng)[20]。

1.3.5 酶活力的測(cè)定

采用Folin-酚法對(duì)蛋白酶的活力進(jìn)行測(cè)定[21]。

1.3.6 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法進(jìn)行水解度的測(cè)定[22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 8.0對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由于蛋白酶具有底物特異性、作用位點(diǎn)專一性的特點(diǎn)[23]，因此不同蛋白酶對(duì)黃鱔魚骨的水解程度不同，且酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)也有所不同。本實(shí)驗(yàn)選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶5 種蛋白酶進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，在各種酶的推薦溫度和pH值下進(jìn)行酶解，記錄每種蛋白酶酶解的進(jìn)程曲線，并以酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖1 不同蛋白酶酶解效果Fig.1 Hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone by different proteases

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間在4 h左右時(shí)，DPPH自由基清除率最高。由酶解進(jìn)程曲線可以看出，木瓜蛋白酶的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，在酶解4 h左右達(dá)到最高。風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶次之，胰蛋白酶最差。因此選擇木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解效果的影響

圖2 底物質(zhì)量濃度對(duì)黃鱔魚骨多肽酶解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone by papain

如圖2所示，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，黃鱔魚骨酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)到最大值，底物質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榈孜镔|(zhì)量濃度較低時(shí)，只有一部分酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物，隨著底物質(zhì)量濃度增加，中間產(chǎn)物增多。而底物質(zhì)量濃度較大時(shí)，酶分子都已與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物，底物質(zhì)量濃度雖然再增加，但已無(wú)有利的酶與之結(jié)合。因此，最適底物質(zhì)量濃度為40 mg/mL左右。

2.2.2 酶添加量對(duì)酶解效果的影響

如圖3所示，隨著酶添加量的增加，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)，這是因?yàn)槊柑砑恿吭黾?，底物反?yīng)越徹底，在酶添加量達(dá)到7 000 U/g時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)。當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，底物已經(jīng)充分酶解，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力不再隨著酶添加量的增多而增強(qiáng)，反而下降，這可能是因?yàn)樯傻亩嚯谋辉俅蚊附鈱?dǎo)致的。因而選擇酶添加量在7 000 U/g左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 酶添加量對(duì)黃鱔魚骨多肽酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone by papain

2.2.3 pH值對(duì)酶解效果的影響

圖4 pH值對(duì)黃鱔魚骨多肽酶解效果的影響Fig.4 Effect of initial pH on hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone by papain

如圖4所示，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)到最大。在pH 5.0～6.0的范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸升高；pH值超過(guò)6.0后，隨著pH值的升高，酶的活性逐漸降低，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力也逐漸降低。因此，最佳pH值為6.0。

2.2.4 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

圖5 酶解溫度對(duì)黃鱔魚骨多肽酶解效果的影響Fig.5 Effect of temperature on hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone by papain

如圖5所示，隨著溫度的升高，酶解效果越好，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力越高。當(dāng)酶解溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力下降，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)使酶失活、產(chǎn)物形成方向發(fā)生改變[24]，從而導(dǎo)致酶解效果降低。因此，最佳酶解溫度為60 ℃。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)黃鱔魚骨多肽酶解效果的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone by papain

如圖6所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力越來(lái)越高，酶解效果越好。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)到最大，隨后緩慢降低。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間延長(zhǎng)，酶解反應(yīng)中一些肽段被再次酶解，導(dǎo)致酶解效果降低。綜合考慮，選擇酶解時(shí)間為4 h左右。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用木瓜蛋白酶，以酶添加量、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間4 個(gè)因素，分別篩選3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以黃鱔魚骨多肽對(duì)DPPH自由基的清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析黃鱔魚骨酶解最優(yōu)工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。通過(guò)Design Expert 8.0軟件分析，得出二次多項(xiàng)回歸方程為：Y＝82.329+ 5.457X1－2.869X2－4.353X3+2.133X4－7.245X1X2+ 1.656X1X3－0.397X1X4+4.313X2X3+0.017X2X4+3.364X3X4+ 0.460－11.667－13.323－4.125。

通過(guò)F檢驗(yàn)來(lái)判定回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，當(dāng)P值越小時(shí)，相應(yīng)變量的顯著性越高。由表3可知，通過(guò)對(duì)回歸方程的顯著性分析得出，X1、X2、X3、X4、X1X2、X2X3、X3X4、、和項(xiàng)的F檢驗(yàn)呈顯著性，模型的P值小于0.000 1，說(shuō)明模型顯著，且失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.161 2）。試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)與響應(yīng)值都有很大的關(guān)系，說(shuō)明方程的擬合是充分的，回歸方程也是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)R2＝0.968 0，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較高的相關(guān)性；＝0.930 8，說(shuō)明該模型能解釋93.08%的響應(yīng)值的變化，僅有總變異的6.92%不能用此模型來(lái)解釋，所以此模型能夠描述木瓜蛋白酶對(duì)黃鱔魚骨粉的酶解變化規(guī)律，用該模型能較好地優(yōu)化試驗(yàn)方案。

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test for each term in the fitted regression model

圖7 pH值與酶解溫度對(duì)黃鱔魚骨多肽酶解效果的交互影響Fig.7 Response surface plot showing the interactive effects of initial pH and temperature on hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone

由圖7可知，pH值與酶解溫度的交互作用顯著。pH值在5.5～6.5范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的增加，黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5.9左右，酶解溫度為58 ℃左右時(shí)，黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率達(dá)到最高水平。

圖8 pH值與酶解時(shí)間對(duì)黃鱔魚骨多肽酶解效果的交互影響Fig.8 Response surface plot showing the interactive effects of initial pH and hydrolysis duration on hydrolysis efficiency of Monopterus albus bone

由圖8可知，pH值與酶解時(shí)間的交互作用也較為顯著。當(dāng)pH值固定不變時(shí)，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率先上升后下降，但變化不夠顯著；當(dāng)酶解時(shí)間固定不變時(shí)，隨著pH值的升高，黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且變化十分顯著。在pH值在5.9左右，酶解時(shí)間在4 h左右時(shí)，黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率達(dá)到最高。由此可以看出，pH值對(duì)黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率的影響大于酶解時(shí)間。

采用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到木瓜蛋白酶酶解黃鱔魚骨的最佳工藝參數(shù)為：酶添加量為8 000 U/g、酶解溫度為59.2 ℃、pH值為5.8、酶解時(shí)間為4.1 h，此時(shí)黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率理論值可達(dá)到91%。按照此條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次并計(jì)算平均值，DPPH自由基清除率為90.85%，說(shuō)明該模型可以較好地模擬和預(yù)測(cè)黃鱔魚骨多肽的DPPH自由基清除率。

2.4 黃鱔魚骨多肽抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除能力

圖9 黃鱔魚骨多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH radical clearance rate of Monopterus albus bone peptides

由圖9可知，黃鱔魚骨多肽和谷胱甘肽對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨其質(zhì)量濃度上升呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除率升高明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率增幅減慢。當(dāng)黃鱔魚骨多肽質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率可以達(dá)到90.5%，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃鱔魚骨多肽質(zhì)量濃度和DPPH自由基的清除能力具有一定的量效關(guān)系，并且有良好的清除作用。

2.4.2 金屬離子螯合能力

圖10 黃鱔魚骨多肽螯合FFee22＋的能力Fig.10 Fe2+-chelating capacity of Monopterus albus bone peptides

由圖10可知，黃鱔魚骨多肽和還原型谷胱甘肽對(duì)Fe2+的螯合率隨著其質(zhì)量濃度的升高而增大，在實(shí)驗(yàn)考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)黃鱔魚骨多肽質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL時(shí)，螯合Fe2+的能力增幅減慢。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)Fe2+的螯合率接近62.9%左右，顯示出較強(qiáng)的螯合Fe2+的能力。

2.4.3 還原能力

圖11 黃鱔魚骨多肽的還原能力Fig.11 Reducing power of Monopterus albus bone peptides

由圖11可知，黃鱔魚骨多肽和還原型谷胱甘肽的還原能力隨著質(zhì)量濃度的升高而增大，且增幅明顯。黃鱔魚骨多肽的質(zhì)量濃度從3.0 mg/mL增加到6.0 mg/mL時(shí)，A700nm值由0.799增加到1.164。超過(guò)了質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL的谷胱甘肽的吸光度，顯示出較強(qiáng)的還原能力。

3 3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定木瓜蛋白酶為酶解黃鱔魚骨的最適蛋白酶，確定最佳底物質(zhì)量濃度為40 mg/mL，選取酶添加量、酶解溫度、pH值和酶解時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終得到酶解黃鱔魚骨制備多肽的最佳工藝條件為：酶添加量8 000 U/g、酶解溫度59.2 ℃、pH 5.8、酶解時(shí)間4.1 h；在此條件下得到的黃鱔魚骨多肽DPPH自由基清除率為90.85%。通過(guò)DPPH自由基清除率、螯合金屬離子能力和還原能力等體外抗氧化指標(biāo)對(duì)黃鱔魚骨多肽的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，黃鱔魚骨多肽表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，隨著多肽質(zhì)量濃度的升高，其抗氧化活性不斷增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步開發(fā)黃鱔魚骨多肽鈣粉等功能性產(chǎn)品，為增加黃鱔產(chǎn)品附加值，提高黃鱔資源的利用率提供了理論依據(jù)。

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Preparation and Antioxidant Activity of Monopterus albus Bone Peptides

JIA Shaoqian, LI Yanxia
(Institute of Food and Nutritional Engineering, Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College, Huai’an 223003, China)

In the present study, the preparation of DPPH radical scavenging peptides derived from enzymatic hydrolysates of Monopterus albus bone by different proteases was optimized using combination of single factor method and response surface methodology. The optimal hydrolysis conditions for Monopterus albus bone peptides were determined as follows: papain was the most suitable enzyme for the hydrolysis of Monopterus albus bone; the hydrolysis was allowed to proceed at 59.2 ℃ for 4.1 h at an initial pH of 5.8 with a substrate concentration of 40 mg/mL at an enzyme dosage of 8 000 U/g. The DPPH radical clearance rate of the resulting hydrolysate was 90.85%. In vitro antioxidant assays showed that Monopterus albus bone peptides had excellent concentration-dependent antioxidant activity.

Monopterus albus bone; peptides; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201601024

TS254.1

A

1002-6630（2016）01-0133-06

賈韶千, 李艷霞. 黃鱔魚骨多肽制備及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 133-138. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601024. http://www.spkx.net.cn

JIA Shaoqian, LI Yanxia. Preparation and antioxidant activity of Monopterus albus bone peptides[J]. Food Science, 2016, 37(1): 133-138. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601024. http://www.spkx.net.cn

2015-02-21

江蘇淮安市科技平臺(tái)項(xiàng)目（HAP201209）；江蘇省青藍(lán)工程資助項(xiàng)目（蘇教師[2014]23號(hào)）

賈韶千（1983—），男，講師，博士，主要從事食品活性物質(zhì)分離與純化研究。E-mail：qian12358@163.com