水溶性大豆多糖的分子表征和溶液流變學性質

楊慧嬌，蔡志祥，張洪斌,*，常忠義*

水溶性大豆多糖的分子表征和溶液流變學性質

楊慧嬌1,2，蔡志祥1，張洪斌1,*，常忠義2,*

（1.上海交通大學化學化工學院高分子科學與工程系，流變學研究所，上海 200240；2.華東師范大學生命科學院生物化學與分子生物學系，上海 200241）

采用核磁共振方法和凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）技術測定了水溶性大豆多糖（soluble soybean polysaccharides，SSPS）的酯化度和分子質量，并研究了SSPS在水溶液中的分子構象和流變學性質。結果表明，核磁共振方法可以快速準確地測定SSPS的酯化度，水溶液中SSPS呈緊密的無規(guī)線團構象，具有很低的本征黏度，SSPS水溶液表現(xiàn)出很強的剪切變稀行為，并具有明顯的觸變性。

水溶性大豆多糖；酯化度；分子參數；構象；流變特性

水溶性大豆多糖（soluble soybean polysaccharides，SSPS）是從已經提取過大豆油和大豆蛋白的剩余物中，分離提取出來的一種高度支化的天然聚陰離子多糖，其結構類似果膠，均含有部分甲酯化的半乳糖醛酸[1-4]。SSPS除具有膳食纖維所具有的功能特性[5]以外，還具有諸如乳化性、酸性條件下對蛋白顆粒的穩(wěn)定作用、抗黏結性、抗氧化性、成膜性能及泡沫穩(wěn)定性等特性[6-12]，是一種應用廣泛的功能性食品添加劑。

SSPS的性質和多重功能性在很大程度上依賴于其分子質量、支化度和酯化度[13-15]。其中酯化度（degreeof esterification，DE）是指分子鏈上甲酯化的半乳糖醛酸殘基占總半乳糖醛酸殘基數量的百分比值[16]。有研究表明，酯化度的不同對SSPS的性質和功能有重要的影響[17]。就多糖酯化度的測定而言，最早被應用和公認的測定方法是酸堿滴定法，如《美國食品化學法典》和《美國藥典》所述的方法[18-19]。該方法的優(yōu)點是實驗條件簡單，不需要使用復雜的儀器，但測試繁瑣耗時、樣品量需求也較大，特別是由滴定終點的判斷引起的誤差大，結果的重復性差。目前核磁共振技術已經廣泛應用于天然產物的結構確定，如通過該方法可確定SSPS的分子骨架組成[20]。但采用核磁共振法（nuelear magnetic resonance，NMR）確定SSPS的酯化度尚未見報道。核磁共振方法則能很好地解決滴定法存在的問題，所需的樣品量少，且快速、精度高。

除酯化度外，分子質量、本征黏度、溶液流變學性質也是SSPS重要的功能性指標。本實驗結合SSPS分子具有支化結構的特點，對不同酯化度的SSPS進行了分子參數表征，并討論了SSPS在水溶液中的分子構象和流變學性質，以期對SSPS的生產以及功能性應用提供基礎理論數據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣 金晶生物科技有限公司提供；SSPS 上海交通大學實驗室和華東師范大學實驗室自制。

氘代水（D2O）、氘代硫酸（D2SO4） 美國Sigma公司；硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、蒸餾水等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振波譜儀 瑞典Bruker公司；凝膠滲透色譜（Viscotek 270 GPC） 英國Malvern儀器有限公司；A6000M凝膠色譜柱 Pharmacia生物科技有限公司；AR-G2旋轉流變儀 美國TA儀器有限公司；Avanti J-25超速離心機 美國Beckman Coulter公司；FE20KPlus酸度計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋 北京光明醫(yī)療儀器廠；FA1004精密電子天平 上海天平儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 SSPS提取的基本流程

將脫除蛋白和脂肪后粉碎干燥的豆渣進行酸解提取，然后離心過濾后進行脫酯化處理，隨后將料液中和，取離心后上清液進行濃縮，所得濃縮液用乙醇沉淀，最后將沉淀物真空干燥即得產物。

1.3.2 不同脫酯化程度SSPS的制備

按照1.3.1節(jié)的方法進行，在脫酯化處理的反應階段，針對脫酯化反應的3 個影響因素，pH值、反應溫度和脫酯化時間分別進行單因素試驗。將酸解提取，離心過濾后的上清液用NaOH調至一定pH值，待升溫至一定溫度后，將上清液置于水浴鍋或高壓滅菌鍋中進行脫酯化反應，即得脫酯化程度不同的產物。

1.3.3 酯化度的測定

酯化度測定分別采用核磁共振法[21-22]和酸堿滴定法[23]。核磁共振法中，待測多糖樣品以質量比為3∶1的D2O和D2SO4混合溶液作為溶劑，配制成質量分數為6.5%的溶液。測試溫度為80 ℃，以四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）作為內標，掃描64 次。

1.3.4 分子質量和本征黏度的測定

多糖樣品分子質量和本征黏度的測定采用Viscotek TDAmax多檢測器凝膠色譜系統(tǒng)，所用檢測器分別為光散射檢測器、濃度檢測器和黏度檢測器，色譜柱為2 根A6000M柱子串聯(lián)使用。測試樣品的質量濃度為2 mg/mL，進樣體積為150 μL，流動相為0.1 mol/L的NaNO3溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫40 ℃。

1.3.5 溶液流變學性質的測定

取適量SSPS粉末溶于蒸餾水中，攪拌使其充分水合溶解，配制成一定質量濃度（5、10、15、20 g/100 mL）的多糖溶液，采用AR-G2流變儀進行流變性質的測定。實驗夾具為直徑60 mm的錐板，錐角2°1′8″，間距58 μm。測試溫度為25 ℃。穩(wěn)態(tài)剪切黏度曲線測試中，剪切速率由0.01 s－1升至1 000 s－1再回掃降至0.01 s－1。以扭矩值變化在3 個連續(xù)取樣周期（20 s）小于5%為達到穩(wěn)態(tài)。為了解預剪切對樣品流變學性質的影響，將樣品在100 s－1的剪切速率下預剪切5 min，然后進行動態(tài)時間掃描測試，測定其隨時間變化的儲能模量（G’）。測試頻率為1 Hz，應力為0.01 Pa。

2 結果與分析

2.1 脫酯化程度的主要影響因素和脫酯化條件

未脫酯化處理樣品的酯化度為60.5%。由圖1可知，脫酯化pH值處理后，樣品的酯化度值與未作處理的對照組發(fā)生了顯著的降低，并隨著脫酯化pH值的升高，可溶性大豆多糖的酯化度大幅度降低。由于反應溶液中的糖類和所含少量的蛋白類物質會發(fā)生美拉德反應，使產物顏色加深變黑，因此，脫酯化pH值的變化會影響可溶性大豆多糖的外觀色澤。當pH≥11時，美拉德反應加速進行，提取干燥后的可溶性大豆多糖的顏色已接近深褐色。因此，在實際脫酯化過程中一般選定的pH值介于9～10之間。

圖1 不同脫酯化pH值對酯化度的影響（100 ℃，90 min）Fig.1 Influence of pH on the degree of esterification of SSPS at 100 ℃for 90 min

圖2 不同脫酯化時間對酯化度的影響（pH 10，100 ℃）Fig.2 Influence of de-esterification time (at 100 ℃ and pH 10) on degree of esterification of SSPS

由圖2可知，隨著脫酯化處理時間的增加，可溶性大豆多糖的酯化度都有不同程度的降低，當反應時間超過90 min后，酯化度的下降趨緩，反應時間達到120 min時，酯化度可達10%或以下。但是，處理時間超過100 min，同樣會由于美拉德反應，使所得可溶性大豆多糖顏色加深而影響使用。因此，脫酯化時間以不大于90 min為佳。

表1 脫酯化程度不同樣品的制備條件Table 1 Preparation conditions for SSPS samples with different degrees of de-esterification

2.2 核磁共振法測得的酯化度及其與酸堿滴定法的比較

水溶性多糖在氘代試劑D2O中得到的氫峰?；ハ嘀丿B在一起，而采用D2O-D2SO4混合液作為溶劑可使糖單元之間的糖苷鍵斷裂以提高峰形分辨率[22]。研究表明，選擇質量比為3∶1的D2O-D2SO4混合液作為氘代試劑可以有效地提高峰形分辨率，進而計算SSPS的酯化度。將SSPS在氘代試劑中80 ℃條件下溶解15 min，常溫下測試可獲得SSPS的氫譜（見圖4，樣品2）。結合圖5中SSPS骨架結構式可知，圖4中，化學位移δ=4.68～4.70處為羧基旁的H-5峰（相應的峰面積ICOO－），δ=4.99～5.01處為酯基旁邊的H-5峰（峰面積ICOOMe），δ=5.01～5.02處為半乳糖醛酸頭碳氫H-1峰（峰面積IH-1）。通過δ=4.68～4.70（峰面積ICOO－）和δ=4.99～5.01（峰面積ICOOMe）處2 個峰面積可以計算SSPS的酯化度，計算公式為：

但由于化學位移δ=4.99～5.02處酯基旁邊的H-5峰（ICOOMe）和H-1峰（IH-1）相重疊，難以分開，因此可以把H-1和酯基旁的H-5峰結合在一起，通過方程變換[22]，采用下式計算SSPS酯化度：

圖3 脫酯化溫度對酯化度的影響（pH 10，90 min）Fig.3 Influence of de-esterification temperature (at pH 10 for 90 min) on degree of esterification of SSPS

圖4 SSPS的氫譜圖Fig.41H-NMR spectrum of SSPS in D2O-D2SO4

由圖3可知，隨著脫酯化處理溫度的提高，脫酯化反應速率加快，酯化度也逐漸降低。

綜上，SSPS脫酯化程度隨pH值和反應溫度的升高以及脫酯化時間的延長而下降。本研究根據不同pH值、反應溫度和脫酯化時間分別得到了4 種脫酯化程度不同的樣品，其制備條件見表1。

由核磁氫譜所得不同脫酯化SSPS樣品的酯化度與參考果膠酯化度酸堿滴定測定法[23]測得的酯化度比較見圖6。圖中每個酯化度值為3 個平行樣品的平均值。可以看到，兩類方法所得酯化度值非常吻合，反映出核磁共振法能快捷、準確地測得SSPS酯化度。

圖5 SSPS骨架結構式Fig.5 Structure of SSPS

圖6 SSPS核磁共振氫譜法與酸堿滴定法測得酯化度的相關性Fig.6 Linear relationship between degrees of esterification determined using1H-NMR spect roscopy and D2O-D2SO4for SSPS

2.3 分子質量測定和分子構象

Mark-Houwink方程給出了聚合物溶液的本征黏度（[η]/（dL/g））和聚合物分子質量（M）之間的關系：

式中：K和α為Mark-Houwink參數，與聚合物和溶劑的種類以及測試溫度有關。

對于給定溫度下的某種聚合物溶液，在一定分子質量范圍內，K和α是與分子質量無關的常數。參數α被認為是一個有關高分子鏈形狀的系數[24]，它與聚合物在溶劑中所呈的構象有關。當α值在0～0.1之間時，聚合物在溶劑中為球狀構象，當α在0.35～0.8之間時，聚合物在溶劑中呈現(xiàn)無規(guī)線團構象，并且α值越接近0.8，其聚合物線團越為伸展，而當α≥1，此時聚合物在溶劑中呈剛性線團狀。

圖7所示為在25 ℃條件下SSPS分子質量（Mw）和本征黏度（[η]）的測定結果。結合Mark-Houwink方程可以得出如下關系式：

式中：α值為0.42，與文獻[20]報道值（0.47）較為一致。該值表明，SSPS在水溶液中呈不太伸展的無規(guī)線團構象。這種構象與其具有高度支化的結構有關，不同于能伸展的線型高分子，而與另一高支化多糖玉米纖維膠（α=0.471）類似[25]。這兩種高度支化多糖的α值均小于呈伸展構象的線型高分子透明質酸多糖的α值（約為0.6）[25]。

SSPS的這種構象也與其具有低的本征黏度相吻合。SSPS的本征黏度很低，即使是高分子質量（5.65×105D）的樣品4，也僅為0.417 dL/g，該值遠低于分子質量僅為3.33×105D的玉米纖維膠的本征黏度（1.482 dL/g），而分子質量為3.56×105D的透明質酸，其本征黏度高達8.784 dL/g[25]。這表明SSPS較玉米纖維膠具有更加緊密的構象結構。

圖7 SSPS的本征黏度隨分子質量的變化曲線Fig.7 Plot of [η] versus Mwfor SSPS in aqueous solution

2.4 流變學性質

圖8 剪切速率升降過程中不同質量濃度SSPS溶液黏度與剪切速率的關系Fig.8 Steady shear viscosity SSPS solutions as a function of shear rate upon increasing shear rate

SSPS這種緊密的構象結構和低本征黏度還與其流變學性質完全相符。圖8為不同質量濃度的SSPS（樣品4）溶液的流動曲線?？梢钥吹?，與阿拉伯膠溶液[25]和玉米纖維膠溶液[25]類似，盡管分子質量很高、水溶性很好，但SSPS溶液在質量濃度很高的情況下，仍具有低黏度的特性（20 g/100 mL的溶液在剪切速率為1 s－1時，黏度僅約為1 Pa·s）。SSPS溶液黏度與剪切速率的關系，也與阿拉伯膠溶液非常類似，在低剪切速率區(qū)不能觀測到牛頓區(qū)，且剪切變稀現(xiàn)象非常明顯。此外，在剪切速率由低到高，再由高到低回掃過程中，兩條黏度曲線并不重合，特別是較高質量濃度的大豆多糖水溶液在低剪切速率區(qū)。圖9為預剪切后該溶液彈性模量G’隨時間的變化?？捎^察到預剪切后溶液彈性模量隨時間延長快速上升直至達某一平衡值。這些流變學性質反映出，SSPS溶液如同阿拉伯膠溶液[26]一樣，由于大分子間存在相互作用，在溶液中形成微結構，使體系具有明顯的觸變性。

圖9 預剪切（1000 ss－1，5 min）后5 g/100 mL SSPS溶液彈性模量G’隨時間的變化Fig.9 G’ as a function of time for 5 g/10000 mmLL SSPS solution after per-shearing at 100 s－1for 5 min

3 結 論

采用核磁共振法，利用1H-NMR譜，可以準確、快捷測定SSPS的酯化度；25 ℃水溶劑中，SSPS溶液的Mark-Houwink方程為[η]＝1.51×10－3Mw0.42；SSPS在水溶液中呈緊密的無規(guī)線團構象，盡管分子質量較高，但本征黏度遠低于其他水溶性多糖；SSPS水溶液具有高質量濃度時黏度低的流變學特性，并具有明顯的觸變性。

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Molecular Characterization of Soluble Soybean Polysaccharide and Rheological Properties of Its Aqueous Solution

YANG Huijiao1,2, CAI Zhixiang1, ZHANG Hongbin1,*, CHANG Zhongyi2,*
(1. Advanced Rheology Institute, Department of Polymer Science and Engineering, School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200241, China)

The degree of esterifi cation and molecular weight of soluble soybean polysaccharide (SSPS) were measured by1H-NMR spectroscopy and gel permeation chromatography (GPC), respectively, and the conformation of SSPS in water and the rheological properties of aqueous SSPS solution were investigated. It was found that the degree of esterifi cation of SSPS could be determined by using1H-NMR accurately and rapidly. The experimental results also showed that SSPS chains exhibited random coils with compact conformation in water, and that SSPS aqueous solutions possessed a very low intrinsic viscosity, signifi cant shear thinning behavior and thixotropy.

soluble soybean polysaccharides (SSPS); degree of esterifi cation (DE); molecular parameter; conformation; rheological property

10.7506/spkx1002-6630-201601001

TS201.7

A

1002-6630（2016）01-0001-05

楊慧嬌, 蔡志祥, 張洪斌, 等. 水溶性大豆多糖的分子表征和溶液流變學性質[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 1-5.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601001. http://www.spkx.net.cn

YANG Huijiao, CAI Zhixiang, ZHANG Hongbin, et al. Molecular characterization of soluble soybean polysaccharide and rheological properties of its aqueous solution[J]. Food Science, 2016, 37(1): 1-5. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601001. http://www.spkx.net.cn

2015-02-13

國家自然科學基金面上項目（21274090）；上海市重點學科建設項目（B202）

楊慧嬌（1989—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物提取。E-mail：yhj_890330@126.com

*通信作者：張洪斌（1965—），男，研究員，博士，研究方向為天然產物和食品親水膠體功能化及其應用。

E-mail：hbzhang@sjtu.edu.cn

常忠義（1968—），男，副教授，博士，研究方向為微生物與食品生物化學。E-mail：zychang@bio.ecnu.edu.cn