節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）CN2對對硝基苯酚的趨化性研究

喬鋮，任磊，賈陽，樊雙虎，王俊歡，閆艷春

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081）

節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）CN2對對硝基苯酚的趨化性研究

喬鋮，任磊，賈陽，樊雙虎，王俊歡，閆艷春*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081）

利用已獲取的對硝基苯酚降解菌CN2，以對硝基苯酚為底物，通過游動平板趨化性、土壤趨化性實驗以及毛細(xì)管趨化性實驗對該菌株的趨化特性進(jìn)行了研究，同時通過模擬土壤原位修復(fù)探究了菌株在實際應(yīng)用中的效果。高效液相色譜檢測結(jié)果表明，72 h內(nèi)菌株CN2對對硝基苯酚的降解率大于99%。CN2在平板趨化性與土壤趨化性實驗中均表現(xiàn)出對對硝基苯酚的趨化性特征，毛細(xì)管趨化性實驗中，當(dāng)對硝基苯酚濃度在一定范圍內(nèi)（5～800 mg·L-1）時，菌株的趨化性與對硝基苯酚濃度呈正相關(guān)，當(dāng)其濃度高于800 mg·L-1時，菌株的趨化性逐漸受到抑制。模擬土壤原位修復(fù)實驗的結(jié)果表明，菌株CN2在未滅菌土壤中的對硝基苯酚降解速率高于滅菌后土壤中的降解速率，在14 d內(nèi)其降解率可達(dá)95%。研究表明，該菌株對環(huán)境具有良好的適應(yīng)性，其對污染環(huán)境修復(fù)具有應(yīng)用價值與潛力。

節(jié)桿菌；對硝基苯酚；趨化性；環(huán)境修復(fù)

對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）作為重要的一類環(huán)境污染物，由于其水溶性好、極性強(qiáng)且穩(wěn)定性良好［1］，可在生產(chǎn)和使用過程中進(jìn)入空氣、土壤以及水體系統(tǒng)中，并可長期在生物體內(nèi)富集，從而對微生物、動植物以及人體健康產(chǎn)生巨大危害［2］。因此，美國環(huán)保署（US-EPA）已將其在自然水體中的濃度限制在10 ng· L-1以下［3］。修復(fù)該類物質(zhì)所造成的環(huán)境污染問題已成為近年來亟待解決的熱點［4-7］。

趨化性（Chemotaxis）是具有運動功能的微生物感應(yīng)并對某類化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生趨向或趨離的一種定向移動行為，是由于環(huán)境變化而引起的一種響應(yīng)能力［8］。多數(shù)情況下，正趨化物（Positive chemotant）因其可為細(xì)菌提供碳源、氮源以及能源而促進(jìn)自身的降解代謝，負(fù)趨化物（Negative chemotant）則由于對菌體的生長生活有毒害作用而使其發(fā)生趨離作用［9］。研究表明，具有運動能力的細(xì)菌對其可降解的化合物絕大多數(shù)都表現(xiàn)出明顯的趨化性，意味著微生物的趨化性可能是其對環(huán)境污染物降解的一個重要依據(jù)［10-12］。因此，對趨化性的研究能為微生物在環(huán)境修復(fù)中的實際應(yīng)用提供有效的理論基礎(chǔ)。細(xì)菌趨化性的研究方法主要有密度趨化性［13］、游動平板趨化性［14-16］、土壤趨化性［16］以及毛細(xì)管趨化性［5，17］等。

本研究以可徹底降解對硝基苯酚的節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）CN2為材料，對以對硝基苯酚為底物時菌株的趨化性進(jìn)行定性與定量分析，測定菌株在模擬土壤原位修復(fù)過程中對對硝基苯酚的降解能力，并分析修復(fù)過程中生物與非生物因素對降解的影響，以期為細(xì)菌趨化性研究及其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試菌株為本課題組分離并保藏的對硝基苯酚降解菌節(jié)桿菌CN2，菌株分離自常年生產(chǎn)有機(jī)磷農(nóng)藥的山東華陽農(nóng)藥廠（山東，泰安）廢水處理池中的活性淤泥。菌株的16S rRNA基因序列已遞交GenBank，登錄號為EU266494［18］。

1.2 藥品與儀器

研究所用的對硝基苯酚（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）用無菌水溶解配制成濃度為2×104mg·L-1母液，避光儲存?zhèn)溆?。甲醇和乙腈為色譜純級（美國，F(xiàn)isher公司），其余藥品為分析純級（國藥集團(tuán)）。

所用儀器主要有Agilent 1200高效液相色譜儀（美國，Agilent公司），S-3000N掃描電鏡（日本Hi tachi公司），Supere G6R全自動菌落分析儀（杭州迅數(shù)科技有限公司）。點樣毛細(xì)管（上海欣鵬玻璃儀器有限公司）規(guī)格：內(nèi)徑0.2 mm，長度100 mm。

1.3 培養(yǎng)基及細(xì)菌懸浮液的制備

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂15 g·L-1（用于固體培養(yǎng)基），121℃滅菌30 min。

BM培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.0 g·L-1，MgSO40.2 g·L-1，CaCl2·2H2O 0.01 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 1.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，瓊脂15 g·L-1（用于固體培養(yǎng)基），pH 7.2，121℃滅菌30 min。

細(xì)菌懸浮液制備：CN2菌株在LB培養(yǎng)基30℃下置于搖床中180 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)期，取1 mL菌液5000 r·min-1離心10 min，菌體用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）沖洗3次后用去離子水重懸浮使其終濃度為109cfu·mL-1，菌懸液在4℃下儲存?zhèn)溆貌怀^24 h。

1.4 高效液相色譜法（HPLC）驗證底物降解

取100 μL上述菌液接入10 mL BM培養(yǎng)基中（含100 mg·L-1的對硝基苯酚）作為處理組，以含有相同濃度對硝基苯酚的BM培養(yǎng)基但不接菌作為對照，在180 r·min-1、30℃條件下培養(yǎng)72 h后取樣檢測對硝基苯酚的濃度。樣品經(jīng)0.2 μm孔徑的濾膜過濾后，利用高效液相色譜儀在320 nm紫外光下基于外標(biāo)法測定對硝基苯酚殘留濃度。高效液相色譜儀為安捷倫1200，色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm×5 μm），流動相為甲醇、乙腈和水的混合物（體積比42∶48∶10），進(jìn)樣量2 μL，流速1 mL·min-1，柱溫30℃，利用二極管陣列復(fù)合波長檢測器進(jìn)行檢測。

1.5 趨化性試驗方法

趨化性試驗方法包括游動平板趨化性、土壤趨化性和毛細(xì)管趨化性，全程均在無菌超凈工作臺內(nèi)操作，所有實驗至少重復(fù)3次。

1.5.1 游動平板趨化性［14-16］

向已滅菌的BM液體培養(yǎng)基中添加0.4%瓊脂糖，加熱融化待冷卻至室溫后加入對硝基苯酚至終濃度100 mg·L-1，制備BM半固體平板培養(yǎng)基，用已滅菌的濾紙片（r=0.8 cm）蘸取少許菌液，適當(dāng)晾干后放入平板中央，30℃下避光培養(yǎng)并定時觀察拍照。

1.5.2 土壤趨化性［16］

土壤趨化性實驗?zāi)M裝置如圖1（a）所示。實驗步驟如下：①取已滅菌土壤20 g，分4次加入對硝基苯酚母液至終濃度為100 mg·kg-1，每次劇烈搖晃使其混勻；②制備約50 mL不含對硝基苯酚的BM半固體培養(yǎng)基（含0.4%瓊脂糖），取3～5 mL滴至平板中央小環(huán)內(nèi)待其凝固；③在半固體BM培養(yǎng)基中加入250 μL對硝基苯酚使其終濃度為100 mg·L-1，平板中放入半環(huán)后加入該培養(yǎng)基，待其凝固后取出半環(huán)并在中間部分均勻加入土樣，使土樣邊緣與固體培養(yǎng)基充分接觸；④在平板中央加一滴菌樣，30℃下避光培養(yǎng)并定時觀察拍照。

1.5.3毛細(xì)管趨化性［5，17］

毛細(xì)管趨化性實驗?zāi)M裝置如圖1（b）所示。利用干凈的培養(yǎng)皿做簡化的反應(yīng)容器，可同時在毛細(xì)管中注入不同濃度的對硝基苯酚或緩沖液作為趨化物，選擇不同時長進(jìn)行菌落培養(yǎng)即可統(tǒng)計進(jìn)入毛細(xì)管中的菌落數(shù)。實驗步驟如下：①取干凈的平皿，用細(xì)針在其外沿?zé)_口徑相同的若干孔以使毛細(xì)管正常插入；②將干凈的載玻片緊貼平皿內(nèi)沿置于平皿中，用毛細(xì)管制成一個U型空腔置于載玻片中央并滴入懸浮菌液，蓋上蓋玻片；③毛細(xì)管在酒精燈火焰上通過幾次，稍加冷卻后放入對硝基苯酚溶液中，液體即被吸入約4 cm；④待毛細(xì)管冷卻后將其末端用酒精燈燒熔后封閉，即可在管內(nèi)形成約5 cm的空腔以使菌液進(jìn)入；⑤裝有對硝基苯酚的毛細(xì)管開口一端水平插入蓋玻片下的菌懸液中，輕輕蓋上平板蓋，置于30℃恒溫恒濕環(huán)境中，溫育不同時間后取出毛細(xì)管，用無菌蒸餾水沖洗外壁并用濾紙擦干，準(zhǔn)備細(xì)菌計數(shù)；⑥細(xì)菌計數(shù)采用平板菌落計數(shù)法，即溫育結(jié)束后，將毛細(xì)管中的內(nèi)容物用適量緩沖液沖出并涂至LB平板上（每個毛細(xì)管中的菌懸液梯度稀釋后涂在平板上），30℃下孵育24 h，利用迅數(shù)菌落計數(shù)儀統(tǒng)計平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)目。

1.6 土壤原位修復(fù)模擬

供試土壤采自無農(nóng)藥使用記錄的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院西門花園內(nèi)。土樣過20目篩后，部分直接用于實驗，部分則連續(xù)兩次經(jīng)121℃高溫高壓滅菌1 h后備用。土壤中加入對硝基苯酚溶液至終濃度為100 mg· kg-1并輕微振蕩混勻，分別取100g不同處理后的土壤裝入250mL干凈的三角瓶中，將CN2菌懸液分別加入滅菌與未滅菌土壤中至各自菌群濃度約為105cfu·g-1。以不接菌時含相同濃度對硝基苯酚的未滅菌土壤作為對照組。所有實驗組均在溫度為30℃，相對濕度為10%左右的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每個處理組中每24h取10 g土樣并溶于20mL無菌水，置于搖床中劇烈振蕩1h，4℃靜置過夜，用0.22μm的濾膜過濾后對所得樣品利用高效液相色譜儀檢測對硝基苯酚的濃度。

圖1 趨化性實驗裝置模擬圖Figure 1 Simulation devices for chemotaxis assays

2 結(jié)果與分析

2.1 對硝基苯酚降解能力驗證

HPLC檢測，對硝基苯酚的保留時間為1.73 min，選擇320 nm作為檢測波長。利用對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)品繪制其濃度與320 nm處吸收值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y= 5.384 3x+0.954 3；R2=0.999 8）。圖2為培養(yǎng)72 h后HPLC的檢出結(jié)果，其中（a）、（b）分別為以對硝基苯酚（100 mg·L-1）為對照組與CN2菌液在含對硝基苯酚的BM無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后的檢測結(jié)果?？梢姡闏N2在對硝基苯酚中培養(yǎng)72h后降解率大于99%。

2.2 游動平板趨化性

菌株在以對硝基苯酚（100 mg·L-1）為唯一碳源的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出明顯的趨化性。平板培養(yǎng)基中接入CN2于30℃恒溫培養(yǎng)，可觀察到菌株將培養(yǎng)基中的部分對硝基苯酚降解，使菌落周圍培養(yǎng)基由黃綠色變?yōu)闊o色，出現(xiàn)透明的水解圈（圖3），且隨著時間的延長，細(xì)菌不斷向外運動，使得菌落邊緣逐漸增大。圖3（a）所示為初始時刻將CN2菌液接入平板中形成的菌落，其直徑約為2.5 mm；培養(yǎng)24 h后菌落直徑擴(kuò)大

至8 mm，待96 h后菌落直徑約增至12 mm，分別如圖3（b）、圖3（c）所示。這說明菌株CN2在利用平板中的對硝基苯酚時首先將細(xì)胞周圍的對硝基苯酚降解，隨著底物的減少，菌體逐漸向底物濃度較高的位置移動，這正是細(xì)菌對底物趨化性作用的表現(xiàn)。同時通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌株CN2具有較長鞭毛，如圖3（d），這是其具有較強(qiáng)運動能力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2.3土壤趨化性

由于微生物在環(huán)境修復(fù)過程中具有易實施、無二次污染且成本小等特點，目前微生物降解已被證明為實現(xiàn)環(huán)境污染物降解的有效措施［19］。為了解菌株在真實環(huán)境中的降解性能，本文利用土壤趨化性實驗對其進(jìn)行了模擬。圖4所示為CN2接種于土壤平板中培養(yǎng)一周后外圈培養(yǎng)基中對硝基苯酚的降解情況?？梢?，接種后30℃下避光培養(yǎng)一周，在半固體培養(yǎng)基中的底物對硝基苯酚即被顯著降解，原來的黃綠色培養(yǎng)基變?yōu)闊o色透明。

圖2 對硝基苯酚在320 nm處的HPLC檢測結(jié)果Figure 2 Detecting results for p-nitrophenol under 320 nm by HPLC

圖3 菌株CN2在平板培養(yǎng)基中的趨化性效果及其掃描電鏡觀察Figure 3 Chemotaxis response of CN2 in swarm plate assay

2.4 毛細(xì)管趨化性

為定量分析菌株CN2對底物對硝基苯酚的趨化性，通過改進(jìn)后的毛細(xì)管趨化性實驗進(jìn)行了驗證。將進(jìn)入毛細(xì)管中的菌落梯度稀釋后涂至LB平板上，根據(jù)其生長情況可以確定，當(dāng)稀釋104后平板中的菌落易于準(zhǔn)確計數(shù)，稀釋濃度過高或過低均不利于統(tǒng)計與分析。

圖5為用趨化物誘導(dǎo)20 min后將毛細(xì)管中菌液稀釋104后涂布至LB平板24 h后的生長情況，其中圖5a為以BM緩沖液為對照時進(jìn)入毛細(xì)管的菌落數(shù)，圖5b～圖5i分別為以不同濃度對硝基苯酚為底物時進(jìn)入毛細(xì)管中菌落細(xì)胞的生長情況，分別利用迅數(shù)菌落計數(shù)儀統(tǒng)計不同平板中菌落數(shù)目?？梢?，該菌株在一定濃度范圍的底物誘導(dǎo)下表現(xiàn)出明顯的趨化性，進(jìn)入毛細(xì)管中的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目與底物濃度呈正相關(guān)；

當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^800 mg·L-1時則表現(xiàn)出趨化性的減弱，且隨著底物濃度的增加，進(jìn)入毛細(xì)管中細(xì)菌的數(shù)目逐漸減少。這也是該菌株在高濃度時對底物趨離作用的表現(xiàn)，即當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞周圍的化學(xué)物質(zhì)濃度達(dá)到一定閾值時會對其產(chǎn)生毒害作用，細(xì)菌因遠(yuǎn)離該類物質(zhì)而避免了危害的發(fā)生。

圖4 菌株CN2的土壤趨化性實驗Figure 4 Soil chemotaxis response of CN2

圖5 菌株CN2在LB平板中24 h后的生長情況Figure 5 Growth of CN2 in LB plates for 24 h

為進(jìn)一步驗證菌株CN2的趨化性，我們以不同濃度的對硝基苯酚為趨化物，對培養(yǎng)不同時長后進(jìn)入毛細(xì)管中的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示（圖6a），當(dāng)?shù)孜餄舛仍?～2×104mg·L-1時，隨著培養(yǎng)時間的遞增，進(jìn)入毛細(xì)管中的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)逐漸增大，在30 min時達(dá)到最大值，此后培養(yǎng)時間分別為40 min和50 min時進(jìn)入毛細(xì)管中的菌落數(shù)雖高于20 min時但均略小于30 min時的菌落數(shù)目?？梢姡囵B(yǎng)30 min以后細(xì)菌進(jìn)入毛細(xì)管中的速率逐漸降低。

以50 mm為細(xì)菌進(jìn)入毛細(xì)管中所經(jīng)過的路程，以不同時長下進(jìn)入毛細(xì)管中CN2菌落數(shù)的平均值為細(xì)菌數(shù)量，則CN2在單位時間內(nèi)移動一定距離時進(jìn)

入毛細(xì)管中菌落數(shù)（N）變化的速率方程式可表示為：

式中：N表示菌落數(shù)目，cfu；x1、x0分別為t1、t0時間所對應(yīng)的CN2菌株在毛細(xì)管中移動的距離。

本文中，（x1-x0）為一定值50 mm，t0為CN2菌株進(jìn)入毛細(xì)管中的初始時刻，（t1-t0）即為相應(yīng)的統(tǒng)計時間（10～50 min）。由圖6（b）可知，培養(yǎng)30 min時，細(xì)菌進(jìn)入毛細(xì)管的平均速率達(dá)到最大，約為8.56×103cfu· mm-1·min-1。10～20 min內(nèi)平均速率基本一致，經(jīng)30 min以后則隨時間的遞增細(xì)菌進(jìn)入毛細(xì)管中的速率呈逐漸下滑趨勢。這一結(jié)論與圖6（a）中結(jié)果一致。

2.5土壤原位修復(fù)模擬

由圖7可見，隨著培養(yǎng)時長的增加，土壤中對硝基苯酚濃度呈逐漸下降趨勢。至培養(yǎng)14 d時，滅菌土壤中對硝基苯酚仍有殘留且濃度基本穩(wěn)定在高于20 mg·L-1。未滅菌土壤中對硝基苯酚則殘留較少，其降解速率也明顯快于滅菌后土壤中的降解速率，至培養(yǎng)14 d時，對硝基苯酚降解率達(dá)到95%。滅菌后土壤中殘留的對硝基苯酚濃度始終高于未滅菌土壤中的濃度，推測可能是由于未滅菌土壤中存在其他可同時降解對硝基苯酚或可與菌株CN2共降解對硝基苯酚的微生物群落［2］，同時由于高溫高壓滅菌過程會改變原有土壤的結(jié)構(gòu)層次以及化合物組成，從而對外源性菌株的降解作用產(chǎn)生了抑制效果。

圖6 菌株CN2在不同濃度底物的誘導(dǎo)下培養(yǎng)不同時間后的生長情況及其進(jìn)入毛細(xì)管中菌落數(shù)的速率變化Figure 6 Growth of CN2 in p-nitrophenol of various concentrations after different period of culturing and the varying rates of colonies in capillary

圖7 不同土壤中CN2對對硝基苯酚的降解曲線Figure 7 Degradation of p-nitrophenol in different soil by CN2

3 討論

微生物在環(huán)境修復(fù)中的作用，尤其是細(xì)菌對污染物的降解中，扮演了重要的角色。事實上，環(huán)境中污染物大量富集的過程也是對微生物自然馴化的過程，一些微生物通過改變或增強(qiáng)自身性能從而可在以這些化合物為碳源、氮源及能源的條件下實現(xiàn)對環(huán)境污染物的降解。而實現(xiàn)生物修復(fù)首先要保證微生物與底物的良好接觸，細(xì)菌所具有的趨化性系統(tǒng)則有效克服了這一難題，使其可以感應(yīng)并游向目標(biāo)物質(zhì)，從而增加污染物周圍菌體濃度，促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞生長或通過生物薄膜的形成而提高化合物的生物可利用性及降解性［20］。其次在相對有限的資源環(huán)境中有效攝取營養(yǎng)為自身提供碳源、氮源以及代謝所需能源，從而將環(huán)境中的污染物完全降解為小分子物質(zhì)［21-23］。微生物的這一特性對于環(huán)境污染的修復(fù)有至關(guān)重要的作用，其固有的優(yōu)勢是常規(guī)的物理化學(xué)方法所不能比擬的［23］。

本實驗以對硝基苯酚這一重要的環(huán)境污染物為底物，不僅是因為菌株CN2對此具有趨化性，也是因為在該菌株將其完全降解的過程中可明顯觀察到對硝基苯酚本身具有的黃綠色逐漸消失的現(xiàn)象。通過游動平板趨化性、土壤趨化性以及毛細(xì)管趨化性等方法

對該菌株的趨化性進(jìn)行了定性與定量研究。結(jié)果表明，該菌株對對硝基苯酚具有明顯的趨化性且可在較短時間內(nèi)將其高效降解。游動平板趨化性與土壤趨化性實驗中均可觀察到培養(yǎng)基中對硝基苯酚的降解效果，且通過模擬細(xì)菌在真實生態(tài)環(huán)境中的作用，進(jìn)一步證實了菌株CN2的趨化性在促進(jìn)其對環(huán)境污染物的降解過程中發(fā)揮了重要作用。這正是細(xì)菌利用復(fù)雜有效的趨化性系統(tǒng)而趨向有利于自身生存條件，從而增加對環(huán)境適應(yīng)性的表現(xiàn)。

毛細(xì)管趨化性實驗可定量反映細(xì)菌在趨化過程中的重要特征。由于菌株CN2具有鞭毛，游動能力較強(qiáng)，其進(jìn)入毛細(xì)管中的最大速率可達(dá)8.56×103cfu· mm-1·min-1，在模擬真實環(huán)境中的作用時該菌株的降解速率也較快。這與上文所述的結(jié)論是一致的。

此外，通過模擬土壤原位修復(fù)作用發(fā)現(xiàn)，滅菌后土壤中對硝基苯酚的殘留濃度遠(yuǎn)大于未滅菌土壤中殘留底物的濃度，且降解速率相對降低。對其可能的原因有兩個方面的推測：一方面是由于原土樣中存在其他可利用對硝基苯酚進(jìn)行代謝的微生物或可與外源性菌株CN2共降解的土著微生物；另一方面可能是由于原土在高溫高壓滅菌后其土層結(jié)構(gòu)遭到破壞或原土中化合物的組成有所改變，從而抑制了菌株的降解特性。已有研究證實，長期受污染的土壤中外源性真菌的添加會同時改變環(huán)境修復(fù)效率以及土壤中土著微生物群落的多樣性［24］。進(jìn)一步的研究也表明，通過改變土壤中的土著微生物群落結(jié)構(gòu)以及一些非生物因素如土壤中沙土、泥土以及粘土的組成比例等，發(fā)現(xiàn)外源性降解菌的降解效率均受顯著影響［25］。這些都可能會成為抑制外源性菌株發(fā)揮生物修復(fù)作用的因素，即土壤中存在的微生物群落以及土壤組成成分等都會改變菌株在環(huán)境修復(fù)過程中的效率［26-27］。據(jù)此推測，土壤的滅菌過程實質(zhì)上也是對土壤微生物群落的破壞過程。因此，減少了可與外源菌實現(xiàn)對底物共同降解的細(xì)菌數(shù)目，造成外源性菌株在土壤中對底物的局部降解，從而導(dǎo)致土壤中的污染物長時間存在殘留并富集，破壞了土壤生態(tài)環(huán)境。

目前，由于對硝基苯酚在環(huán)境中的廣泛分布，細(xì)菌對這一環(huán)境污染物的趨化性也引起了人們濃厚的興趣［28］，細(xì)菌正逐漸被用作環(huán)境修復(fù)主要的生物資源。然而，自Adler［29］發(fā)現(xiàn)趨化性以來，盡管已有一些報道對細(xì)菌鞭毛的運動方式及其化學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等有所報道［30-32］，但對趨化性的分子機(jī)理研究尚不透徹，仍需進(jìn)一步做深入的研究。

4 總結(jié)

本研究利用課題組已獲得的節(jié)桿菌株CN2，通過游動平板趨化性、土壤趨化性以及毛細(xì)管趨化性等方法，主要研究了其在對硝基苯酚的生物降解過程中所發(fā)生的趨化性現(xiàn)象，證實了該菌株可高效降解對硝基苯酚。進(jìn)一步通過模擬分析其在自然環(huán)境中實現(xiàn)土壤原位修復(fù)的過程，揭示了趨化性在微生物降解過程中的重要作用，表明利用微生物降解環(huán)境污染物的策略具有良好的應(yīng)用潛力與價值。

微生物對污染物的降解是環(huán)境修復(fù)的重要組成部分，然而對于部分污染物的降解機(jī)理與趨化性機(jī)制尚未研究清楚，仍需進(jìn)一步從分子水平上深入探究。

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Chemotaxis of Arthrobacter sP.CN2 towards p-nitroPhenol

QIAO Cheng，REN Lei，JIA Yang，F(xiàn)AN Shuang-hu，WANG Jun-huan，YAN Yan-chun*（Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Microbial chemotactic systems are critical for bacteria to sense chemicals in the surrounding medium，which enable them to move towards or away from certain chemotant.Strain Arthrobacter sp.CN2，which could efficiently degrade p-nitrophenol，was used in swarm plate assay，soil chemotaxis assay and capillary chemotaxis assay with p-nitrophenol as the sole substrate，respectively.In the meanwhile，a test of in situ soil assay was carried out in order to assess the application performance of CN2.High Performance Liquid Chromatography（HPLC）test revealed the ability of strain CN2 to degrade over 99%of p-nitrophenol within 72 h.A series of chemotaxis assays indicated that strain CN2 had obvious chemotaxis toward p-nitrophenol.Specifically in the capillary assay，the strain was positively chemotactic to pnitrophenol within a certain range of concentrations（5～800 mg·L-1），but was gradually inhibited when the concentration of p-nitrophenol was higher than 800 mg·L-1.Furthermore，test of in situ soil assay showed a higher degradation efficiency in unsterilized soil than in sterilized soil where the degradation rate could reach up to 95%within 14 days.Our data revealed an excellent adaptability of CN2 to the environment and claimed the potential application in environmental remediation of pollutants.

Arthrobacter sp.；p-nitrophenol；chemotaxis；environmental bioremediation

X171.5

A

1672-2043（2016）10-1945-08

10.11654/jaes.2016-0528

喬鋮，任磊，賈陽，等.節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）CN2對對硝基苯酚的趨化性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2016，35（10）：1945-1952.

QIAO Cheng，REN Lei，JIA Yang，et al.Chemotaxis of Arthrobacter sp.CN2 towards p-nitrophenol［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（10）: 1945-1952.

2016-04-17

國家自然科學(xué)基金項目（31170119，31540067）

喬鋮（1988—），男，碩士研究生，主要從事環(huán)境污染物的生物降解研究。E-mail：cheng0315qw@163.com

*通信作者：閆艷春E-mail：yanyanchun@caas.cn