單側(cè)肺精確滴注法制作小鼠單側(cè)急性肺損傷模型的研究

姜寶珍，劉澤玉，劉 星，張志紅

單側(cè)肺精確滴注法制作小鼠單側(cè)急性肺損傷模型的研究

姜寶珍1，2，劉澤玉1，2，劉 星3，張志紅1，2

經(jīng)導(dǎo)管氣管內(nèi)滴注方法制作一種操作簡(jiǎn)捷可靠、劑量精確的小鼠單側(cè)肺損傷模型。經(jīng)導(dǎo)管分別滴注生理鹽水（NS組）、0.05%伊文斯蘭（EB組）、脂多糖（LPS組）至小鼠左肺，6 h測(cè)呼吸功能（Pehn），24 h取肺臟進(jìn)行病理分析，插管成功率為100%。解剖顯示EB組小鼠左肺均勻分布EB，右肺無明顯異常；NS組和EB組小鼠Pehn差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LPS組Pehn與NS組、EB組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；NS組和EB組小鼠雙肺病理HE染色均無明顯病理學(xué)改變，LPS組小鼠肺出現(xiàn)嚴(yán)重肺損傷。

單側(cè)氣管滴注；伊文斯蘭；脂多糖

近年來隨著實(shí)用性醫(yī)學(xué)研究的深入，各種疾病的動(dòng)物模型更能夠接近人類疾病臨床表現(xiàn)。急性肺損傷是創(chuàng)傷、急救醫(yī)學(xué)不可避免的研究問題，不同類型急性肺損傷的動(dòng)物模型也應(yīng)運(yùn)而生。小鼠易得且廉價(jià)，其基因背景99%與人類共享［1］，因此科學(xué)家多用小鼠來制作各種疾病模型。同樣地，小鼠急性肺損傷模型也被廣泛應(yīng)用。而如何精準(zhǔn)地制作小鼠急性肺損傷模型是關(guān)鍵。氣管滴注方法是建立急性肺損傷模型時(shí)經(jīng)常使用的手術(shù)方法之一。而現(xiàn)有的國內(nèi)外氣管滴注方法操作［2-7］誤差較大，造成造模顯著的不穩(wěn)定性和病變的不確定性。該研究在總結(jié)既往氣管滴注方法的基礎(chǔ)上，對(duì)導(dǎo)管、滴注手法加以改進(jìn)，并引入指示劑，建立及完善一種更高效、精確、便捷、重復(fù)性高的小鼠單側(cè)肺導(dǎo)管滴注方法。為今后呼吸道暴露方法能夠更好地應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)和環(huán)境醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 18只清潔級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。伊文斯蘭（E2129，美國Sigma Aldrich公司）；脂多糖（LPS 055：B5，美國Sigma Aldrich公司）；動(dòng)脈導(dǎo)管（427401，美國BD公司，圖1A）；手術(shù)器械高壓蒸汽滅菌（121℃、20 min）使用、冷光源（ULP-150，蘇州ULANP公司）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸功能檢測(cè)儀（gyd-003，法國EMKA-wbp公司）。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：ILAS-PG-2015-017）。各組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 18只小鼠按體重隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照（normal saline，NS）組6只，氣管滴注無菌醫(yī)用生理鹽水（1 μl/g體重）；伊文斯蘭（evans blue，EB）組6只，氣管滴管無菌0.05%伊文斯蘭-生理鹽水溶液（1 μl/g體重）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）組6只，氣管滴注無菌LPS-生理鹽水溶液（3.5 mg/kg體重）。操作步驟：①戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（50 mg/kg體重）麻醉小鼠，固定四肢于小動(dòng)物加熱板上，絲線固定門牙，使頸部充分暴露；②全部手術(shù)造模過程于潔凈工作臺(tái)內(nèi)完成，小鼠頸前部備皮處理，按手術(shù)常規(guī)消毒頸前部皮膚，于小鼠氣管正前方做5 mm縱行切口并鈍性分離氣管前肌肉、筋膜，暴露氣管（圖1B）；③將小鼠固定于傾斜60°的小動(dòng)物固定板上，術(shù)者位于小鼠頭端，將冷光源對(duì)向小鼠的喉咽部，利用器械充分暴露喉部以及聲門，清楚可見到光源由聲門處透射出并隨聲門開合呈現(xiàn)閃爍感（圖2A）；右手持導(dǎo)絲置入后的導(dǎo)管，于聲門張開瞬間向前上方平穩(wěn)插入氣管，可有輕微突破感，拔出導(dǎo)絲；于頸部切口處可見插入氣管的導(dǎo)管（圖2B）；調(diào)整導(dǎo)管向左側(cè)彎曲，再緩慢向氣管深處插入，深至距小鼠上門牙約2.8 cm以確保導(dǎo)管末端置于左主支氣管內(nèi)，末端連接胰島素注射器，向?qū)Ч軆?nèi)緩慢推注藥物，推注過程大于10 s，再補(bǔ)推注入約30倍液體體積的空氣；④輕柔拔出導(dǎo)管并豎直放置小鼠5 min，術(shù)后小鼠給予保溫措施等待蘇醒；⑤6 h后檢測(cè)小鼠呼吸功能，24 h后麻醉處死分離肺臟，肺組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片及HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察兩組小鼠肺臟組織的病理表現(xiàn)。

圖1 操作準(zhǔn)備

圖2 操作過程

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示；經(jīng)檢驗(yàn)計(jì)量資料均符合正態(tài)分布及方差齊性，多組比較采用單因素方差分析和兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 狀態(tài)觀察 NS組和EB組小鼠在經(jīng)導(dǎo)管單側(cè)肺滴注藥物過程中保持較平穩(wěn)呼吸，沒有出現(xiàn)窒息或死亡，術(shù)后觀察咽部無明顯充血、紅腫，聲門無明顯損傷；小鼠蘇醒后，活動(dòng)、進(jìn)食水等無明顯異常表現(xiàn)。LPS組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)量及進(jìn)食、飲水次數(shù)減少，呼吸急促、精神萎靡等表現(xiàn)。

2.2 大體觀察 EB組小鼠氣管滴注24 h后，解剖離體肺臟呈現(xiàn)左肺均勻分布藍(lán)色EB生物指示劑，而右肺為淡粉色。見圖3。

2.3 呼吸功能（Pehn） 3組小鼠的呼吸功能（Pehn）程度的方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（NS組：=0.429，σ=0.041；EB組：=0.464，σ= 0.019；LPS組：=5.59，σ=0.349；F=211.480，P =0.000 1）；而NS組與EB組小鼠呼吸功能表現(xiàn)無明顯差異（t=1.250，P=0.252），表明0.05%伊文斯蘭-生理鹽水溶液氣管滴注對(duì)小鼠呼吸功能無明顯影響；LPS組呼吸功能分別與NS組、EB組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.699，P= 0.000 1；t=10.794，P=0.000 1）。見圖4。

圖3 EB組離體肺

圖4 小鼠的呼吸功能（Pehn）

2.4 肺組織病理學(xué) NS組與EB組雙肺肺組織均無明顯組織病理損傷；LPS組右肺未見明顯損傷或輕微損傷，肺泡結(jié)構(gòu)完整，左肺肺組織可見彌漫性的出血水腫，肺泡壁增厚、結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡萎陷不張。見圖5。

圖5 小鼠肺組織病理學(xué)改變 HE×400

3 討論

氣管滴注方法是近年來實(shí)驗(yàn)人員探索開發(fā)出的一種呼吸道給藥和染毒方法，如何簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確和可重復(fù)一直是困擾該方法的瓶頸。本研究分別在手術(shù)方法和器械等方面進(jìn)行了相應(yīng)的改進(jìn)，手術(shù)后的小鼠均狀態(tài)良好，能正常存活，插管成功率達(dá)100%。本實(shí)驗(yàn)還采用該研究方法成功地建立了LPS導(dǎo)致小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型。

現(xiàn)有的國內(nèi)外氣管滴注方法主要包括非暴露式和暴露式氣管滴注，非暴露式是指滴鼻吸入［2］、咽后壁滴注或?qū)Ч芙?jīng)咽喉插入氣管內(nèi)滴注［3-4］；而暴露式氣管滴注法是指經(jīng)有創(chuàng)操作暴露動(dòng)物氣管，注射器直接刺入氣管進(jìn)行滴注［5］。兩種滴注方法仍存在一些不足之處：①無法精確控制給藥量及藥物的肺內(nèi)分布；②人為操作誤差大，造成造模顯著的不穩(wěn)定性和病變的不確定性。國外也有少數(shù)研究者開始探索導(dǎo)管單側(cè)肺滴注［6-7］，但還存在如下問題：①實(shí)驗(yàn)者大多使用一次性靜脈留置針或穿刺針進(jìn)行氣管插管，材料的性質(zhì)導(dǎo)致導(dǎo)管插入部位隨機(jī)性較大；②插管接口僅與普通注射器相匹配，給藥量精確度控制欠佳［8］；③操作無法實(shí)時(shí)確定導(dǎo)管插入成功與否，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的盲目性，同時(shí)增加了實(shí)驗(yàn)損耗。

經(jīng)過改良的氣管滴注方法主要有以下優(yōu)點(diǎn)：方法的改進(jìn)更便于操作，采用暴露小鼠氣管的方式，能直觀地明確導(dǎo)管的插入位置；給藥范圍更明確，由于傳統(tǒng)氣管滴注方法可導(dǎo)致藥物在不同肺葉分布不均，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較大的隨機(jī)性，本實(shí)驗(yàn)方法由導(dǎo)管直接將藥物滴注到左主支氣管，使藥物均勻分布于左肺，減小了個(gè)體間藥物分布誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入了指示劑組小鼠左肺EB均勻分布，右肺無明顯指示劑分布。改良后的手術(shù)器械增加了安全性和精準(zhǔn)度，實(shí)驗(yàn)選用動(dòng)脈導(dǎo)管替代一次性靜脈留置針或穿刺針，并且在導(dǎo)管內(nèi)加入金屬絲既保證了安全性又增加了硬度，最大限度上減小了手術(shù)操作對(duì)動(dòng)物可能造成的損傷，可重復(fù)操作；相比原有方法所使用的普通醫(yī)用注射器，給藥量控制誤差較大［8］的問題，本實(shí)驗(yàn)改用胰島素注射器進(jìn)行給藥，其精確性顯著提高［9］，給藥量更精確。除此之外，改良后的方法操作簡(jiǎn)捷、高效，僅需一人，每只小鼠約10 min即可完成滴注，極大地提高了滴注手術(shù)的效率和成功率。

肺組織病理學(xué)和呼吸功能檢查在臨床診療過程中應(yīng)用廣泛，在呼吸系統(tǒng)疾病的診斷、疾病程度和療效的評(píng)估等方面都有十分重要的意義。EB是一種臨床常用的測(cè)定血漿和血容量的指示劑，本實(shí)驗(yàn)表明，EB對(duì)小鼠呼吸功能無明顯損傷作用，肺組織病理學(xué)檢查未見明顯病理改變，因此EB可作為氣管滴注給藥的一種指示劑。本研究采用改良后的氣管滴注方法制作LPS導(dǎo)致小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型，LPS導(dǎo)致小鼠呼吸功能損傷嚴(yán)重程度較正常對(duì)照組明顯加重；肺組織病理學(xué)顯示左肺直接滴注LPS后，出現(xiàn)肺組織彌漫性出血水腫，肺泡壁增厚、結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡萎陷不張，而右肺僅有輕微損傷。研究表明氣管滴注LPS能夠嚴(yán)重?fù)p傷直接暴露的肺組織，非直接暴露肺組織損傷程度較輕，因此，藥物在肺組織內(nèi)的分布以及局部肺組織的藥物濃度直接影響肺部病變。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)節(jié)的把握，針對(duì)定位不準(zhǔn)確的問題通過引入EB指示劑加以完善，規(guī)范導(dǎo)管及微量注射器等裝置降低實(shí)驗(yàn)誤差，增加了氣管滴注實(shí)驗(yàn)操作的可重復(fù)性和規(guī)范性，避免了造模效果不穩(wěn)定、造模結(jié)果差異顯著等問題的發(fā)生，并成功應(yīng)用于LPS導(dǎo)致小鼠急性肺損傷模型建立，為將來進(jìn)一步實(shí)施精準(zhǔn)給藥、定點(diǎn)染毒奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，本方法是一種簡(jiǎn)捷可靠、劑量精確、可重復(fù)性高的小鼠單側(cè)導(dǎo)管肺滴注方法，將來可廣泛應(yīng)用于小鼠經(jīng)呼吸道給藥、染毒等各項(xiàng)肺損傷相關(guān)模型的制作和研究中。

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Explore an accurate approach for setting up acute single lung inflammation in mice through intratracheally instillation

Jiang Baozhen1，2，Liu Zeyu1，2，Liu Xing3，et al
（1Dept of Eldery Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital
of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Institute of Respiratory Disease，Anhui Medical
University，Hefei 230022；3Institute of Laboratory Animal Science，PUMC&CAMS，Beijing 100021）

To establish a simple，efficient and accurate approach for setting upacute lung inflammation in left lung in mice through intratracheally instillation.3 groups were intratracheally instilled with normal saline（NS group），0.05%Evans Blue（EB group）and lipopolysaccharide（LPS group）into the left lung with a catheter respectively. Mice respiratory functions（Pehn）were measured at 6 hours after administration of the above reagents.Distribution of EB was observed by pathological analysis after mice were sacrificed at 24 hours after instillation.100%of the flexible tube was intubated in the exact site of the left main trachea and EB was distributed evenly in the left lung of all the EB group mice.No differences of the Pehn and histopathological changes were found between the NS and EB groups，however，significantly decreased Pehn and sever acute lung injury under microscope were observed in LPS group（P＜0.001）.

intratracheal instillation；Evans Blue；lipopolysaccharide

R 563.9

A

1000-1492（2016）08-1221-04

時(shí)間：2016-6-22 14：44：59

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.070.html

2016-05-12 接收

安徽省學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人選基金（編號(hào)：皖人社秘［2013］228號(hào)）；安徽省衛(wèi)生廳青年領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（編號(hào)：皖衛(wèi)計(jì)委［2015］145號(hào)）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（編號(hào)：DWS201510）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)呼吸病研究所，合肥 230022

3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所，北京 100021作者簡(jiǎn)介：姜寶珍，女，碩士研究生；

張志紅，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhangzhihope@126.com；

劉 星，女，主管技師，責(zé)任作者，主管技師，E-mail：xingliu1976@163.com