耐冬山茶抗寒基因CjCor1的全長克隆與表達(dá)分析

楊 凱 孫迎坤 王奎玲 劉慶華 高捍東

(1.南京林業(yè)大學(xué)，南京 210037； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109)

耐冬山茶抗寒基因CjCor1的全長克隆與表達(dá)分析

楊 凱1,2孫迎坤2王奎玲2劉慶華2高捍東1*

(1.南京林業(yè)大學(xué)，南京 210037；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109)

COR基因是植物冷馴化過程中重要的功能基因。為研究Cor基因在耐冬山茶(Camelliajaponica)抗寒方面的功能，采取同源克隆的方法，從自然低溫條件下的耐冬山茶葉片中分離到了617 bp的耐冬山茶同源COR基因全長序列，命名為CjCor1。該序列全長完整，含有600 bp的開放閱讀框。氨基酸序列分析顯示，CjCor1基因編碼的199個氨基酸蛋白質(zhì)，含有冷馴化蛋白家族WCOR413 Superfamily特有的保守域結(jié)構(gòu)，在同屬物種中的保守性極高。熒光定量PCR結(jié)果表明，在低溫(0℃以下時)條件下，相比南方山茶原種和常見栽培品種，CjCor1基因在耐冬山茶中具有較高表達(dá)量，且在耐寒性高的品種中的表達(dá)量也較高。

耐冬山茶；CjCor1基因；序列分析；基因表達(dá)

抗寒育種是目前世界所關(guān)注的研究熱點。針對當(dāng)前我國北方地區(qū)園林植物資源相對短缺以及大部分南方引進(jìn)品種不能夠在北方地區(qū)正常越冬等狀況，尋求耐寒性高的園林植物種(品種)顯得尤為重要。山茶(Camelliajaponica)為全世界人皆喜愛的木本常綠觀花植物，也是中國傳統(tǒng)十大名花之一，植株秀美，花期可自10月至翌年6月，其觀賞性極佳[1]。作為山茶分布最北界的原種——青島市市花耐冬山茶(C.japonica(Nai Dong))，較之分布于四川、浙江等地的其他山茶原種更具有強(qiáng)的耐寒性，可耐-17℃低溫[2]。

對于植物抗寒基因研究主要包括植物冷誘導(dǎo)基因、相關(guān)酶基因(脯氨酸基因、脂肪酸去飽和酶基因、超氧化物歧化酶基因等)和植物抗凍蛋白(AFP)等方面。冷馴化是是在低溫條件下植物內(nèi)在分子機(jī)制調(diào)控所表現(xiàn)出來的生理生化過程，其過程涉及很多基因。COR基因是其中重要的功能基因，其原理是低溫條件可誘導(dǎo)植物COR基因表達(dá)，生成COR蛋白，從而提高植物的抗寒能力[3]。目前已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大麥(Hordeumvulgare)、番茄(Cyphomandrabetacea)中等分離多個植物冷誘導(dǎo)基因，如COR78、blt4、CBF4等[4～5]。Weiser和Guy等認(rèn)為冷馴化能誘導(dǎo)和增加某些基因的表達(dá)發(fā)生改變。這些冷誘導(dǎo)基因表達(dá)的產(chǎn)物為調(diào)控蛋白或功能蛋白，其中后者與植物抗寒性的提高直接相關(guān)。冷馴化可以誘導(dǎo)多種COR蛋白基因表達(dá)，如擬南芥中產(chǎn)生的COR6.6、COR15a、COR47等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在干旱或低溫逆境中及ABA處理時能誘導(dǎo)COR15a蛋白基因表達(dá)產(chǎn)生可與葉綠體結(jié)合的多肽COR15am，其在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過量表達(dá)后可提高葉綠體、原生質(zhì)體的耐寒冷性，并增強(qiáng)原生質(zhì)膜穩(wěn)定性，減輕寒凍損害。

抗寒基因是一種誘發(fā)基因，在低溫、短日照等特定條件下，能夠產(chǎn)生抗寒促進(jìn)因子(如內(nèi)源脫落酸ABA)，與鈣信號系統(tǒng)一起執(zhí)行抗寒信號的傳導(dǎo)，并啟動相應(yīng)抗寒基因的表達(dá)[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的100多種由ABA誘導(dǎo)的基因可分為兩類：依賴ABA的傳導(dǎo)，如逆境誘導(dǎo)基因RD28和RD29；與ABA共同作用控制基因的表達(dá)，如擬南芥Cor6.6、PHH28等[7]。

鑒于此，本研究從耐冬山茶中分離了COR基因，對其蛋白質(zhì)功能和生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行熒光定量實驗，旨在探討該基因?qū)μ岣咧参锬秃缘脑?，并為后期的耐冬山茶抗寒機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實驗采用的植物材料為耐冬山茶，俗稱耐冬，以及山茶原種(南方)、品種‘寬彩帶’(C.japonica‘Kuancaidai’)和‘金盤荔枝’(C.japonica‘Jinpan Lizhi’)。其中，耐冬葉片采自山東省青島市世紀(jì)公園露天栽培植株，‘寬彩帶’葉片采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)膠州科技示范園塑料大棚內(nèi)，山茶原種(南方)葉片采自浙江象山野外，‘金盤荔枝’葉片采自中國林科院亞林所。采集時間為2015年12月～2016年1月氣溫低于0℃時的清晨或傍晚，樣品為植株上半部分嫩葉，采后迅速除主脈、剪碎，用錫箔紙包裹放入液氮中速凍暫存，帶回實驗室存放于-70℃冰箱。

植物總RNA提取試劑盒RN38-EASYspin Plus購自北京艾德萊生物科技有限公司，RNAase固相清除劑購自北京天恩澤基因公司，T4DNA連接酶購自寶生物工程大連有限公司，pGEM?-T easy vector試劑盒購自Promega公司。SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒購自美國Clontech公司，高保真酶Prime STAR HS DNA Polymerase、常用限制性內(nèi)切酶、大腸桿菌E.coliDH5α、熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒和染料法SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒皆購自寶生物工程大連有限公司，cDNA第一鏈合成試劑購自Fermentas公司。凝膠回收、質(zhì)粒提取試劑和熒光定量所用耗材等皆來源于美國Axygen公司。PCR引物由上海生工合成，測序交由華大基因公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐冬CjCor1基因擴(kuò)增引物設(shè)計

根據(jù)GenBank網(wǎng)站提供的山茶較近緣物種Cor同源基因的完整mRNA和CDS序列信息，通過比對軟件分析出此類基因的保守區(qū)域，用Premier 5.0軟件設(shè)計正向(P-1)和反向(P-2)引物片段并進(jìn)行確認(rèn)；然后在耐冬中進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取保守區(qū)；根據(jù)測序所得目的序列設(shè)計3′和5′RACE擴(kuò)增特異的引物GSP1和GSP2；然后根據(jù)擴(kuò)增得到的保守區(qū)序列、3′和5′RACE的cDNA序列進(jìn)行電子全長拼接，并根據(jù)拼接序列設(shè)計全長擴(kuò)增引物P-3和P-4(表1)。

1.2.2 耐冬CjCor1基因全長擴(kuò)增

樣品耐冬山茶等的總RNA提取依據(jù)植物RN38-EASYspin Plus試劑盒進(jìn)行操作，耐冬提取的RNA再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用同源克隆方法，用上表中引物P-1、P-2對耐冬cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃，5 min；95℃，30 s，54℃，30 s，72℃，50 s，32 cycles；72℃，7 min[8]。對目的條帶凝膠進(jìn)行回收，然后連接到T Easy載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，藍(lán)白斑篩選后，對陽性單克隆測序，得到該基因的保守區(qū)片段。然后，采用GSP1、GSP2引物分別進(jìn)行cDNA末端擴(kuò)增，得到相應(yīng)的3′和5′序列。對于全長電子拼接序列利用P-3、P-4引物，在耐冬葉片中擴(kuò)增全長序列，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序并在GenBank網(wǎng)站中Blast，進(jìn)行近緣植物的分析比對。

表1耐冬山茶CjCor1基因克隆和表達(dá)分析引物

Table1PrimersforcloningandexpressionofCjCor1geneinC.japonica

引物名稱Primers引物序列(5′—3′)PrimerssequenceP?1CCAACATTCTCACAACGCTTTP?2TATGCAGACAGAGTTGGAAAGGCGSP1TGCTTTGCCATCGCGTGTTACTTGCGSP2TCGTATCAGCAATCAACCCGGGAGCP?3GAACAGTTATTTGGCTATGAAGGCP?4ACTATAGCAAGTCGTCAAACAGAGC18S?1GACTCAACACGGGGAAACTTACC18S?2CAGACAAATCGCTCCACCAACQP?1GGAAGACCAACATTCTCACAACGCTQP?2GCGACCACAACAAGAAGAATCAATG

1.2.3耐冬CjCor1基因編碼蛋白質(zhì)生物信息學(xué)比對分析

登錄NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，進(jìn)行CjCor1基因編碼蛋白的同源序列比對分析，采用ORF Finder分析該基因cDNA序列的開放閱讀框ORF(Open reading frame)。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對、系統(tǒng)發(fā)育等分析。

1.2.4CjCor1基因在山茶原種和品種葉片中的相對熒光定量表達(dá)

分別提取耐冬、山茶原種(南方)和‘寬彩帶’、‘金盤荔枝’葉片總RNA，合成cDNA第一鏈。以山茶18S rRNA(GenBank網(wǎng)站登錄號：U42815.1)為內(nèi)參，進(jìn)行實時熒光定量擴(kuò)增。定量反應(yīng)在PCR儀(StepOnePlus)上進(jìn)行，所用試劑為SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ，反應(yīng)程序為94℃，30 s；94℃，5 s；60℃，31 s，設(shè)置40個循環(huán)。每個試驗和樣品各重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐冬CjCor1基因全長cDNA

運用CjCor1基因保守區(qū)的引物P-1和P-2，以耐冬山茶總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板擴(kuò)增，測序后獲得357 bp的目的片段(圖1中片段1)。對片段所編碼的蛋白進(jìn)行NCBI比對，發(fā)現(xiàn)其與茶樹(C.sinensis)冷馴化蛋白WCOR413-like同源性高達(dá)97%以上。由特異引物GSP1、GSP2進(jìn)一步進(jìn)行RACE擴(kuò)增擴(kuò)增后，獲得耐冬CjCor1基因的3′和5′末端序列(圖1中片斷2和片斷3)，結(jié)合已經(jīng)得到的同源片斷，獲得780 bp的基因序列全長，命名為CjCor1。將此序列在ORF finder中分析開放閱讀框信息，得到該基因的保守區(qū)序列，最終擴(kuò)增后得到617 bp的目的基因序列(圖1中片斷4)，測序結(jié)果與CjCor1基因電子拼接結(jié)果一致。

圖1 耐冬CjCor1基因PCR擴(kuò)增 M.分子量標(biāo)準(zhǔn)AL2000；1.CjCor1基因保守區(qū)片段；2. 3′RCAE擴(kuò)增片段；3. 5′RACE擴(kuò)增片段；4.CjCor1基因全長Fig.1 PCR amplification of CjCor1 in C.japonica M. Marker AL2000; 1.CjCor1 fragment; 2. 3′RCAE fragment; 3. 5′RACE fragment; 4. Full length of CjCor1

2.2 耐冬CjCor1基因cDNA核苷酸序列分析

在耐冬山茶中獲得的CjCor1基因780 bp的電子拼接全長序列中(圖2)，包含典型的Poly(A)結(jié)構(gòu)；利用ORF Finder軟件對序列分析，該序列包含600 bp的開放閱讀框。由全長引物對擴(kuò)得的617 bp的基因全長序列，ORF長度為600 bp，5′UTR長16 bp，3′UTR長1 bp，終止密碼子為TAG。由此證明本研究所克隆到的CjCor1基因開放閱讀框獨立、完整，基因序列合理。同時，在線比對分析結(jié)果顯示，該基因與茶樹全基因同源性高達(dá)97%。

2.3耐冬CjCor1基因編碼蛋白序列多重比對與同源性分析

對耐冬山茶CjCor1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLAST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其保守域中的13～187個氨基酸與基因庫中已有的冷馴化蛋白家族(WCOR413 Superfamily，登錄號pfam05562)相吻合(圖3)，表明該序列的此部分保守域序列在許多物種[如日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、海島棉(Gossypiumbarbadense)、檉柳(Tamarixandrossowii)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)等]中都是穩(wěn)定的。對序列相似度高于65%的12個物種的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)CjCor1基因編碼的蛋白缺少其他物種起始的8～9個氨基酸序列，這是耐冬山茶物種特異性原因所致還是存在其他原因有待進(jìn)一步研究；第21～30個氨基酸序列是山茶屬區(qū)別與其他物種的特異性序列，其他序列物種間差別不太明顯，尤其是中后部序列，相似度極高；尤其在WCOR413保守域結(jié)構(gòu)中同源性更高，其高度同源位點如圖4三角處標(biāo)記所示多達(dá)74個氨基酸序列。這表明，山茶屬的COR蛋白與其它物種區(qū)別較明顯，耐冬山茶又與同屬物種蛋白存在特異性差異，如圖4星號所標(biāo)記，與茶樹在WCOR413保守域結(jié)構(gòu)中存在10個特異性氨基酸序列。因此，分析耐冬山茶CjCor1基因?qū)τ谥参锏哪秃匝芯烤哂刑囟ǖ囊饬x。

同時，在所登錄的物種中，通過對包括耐冬山茶在內(nèi)的13個Cor同源性較高的植物進(jìn)行反復(fù)比對，建立了耐冬山茶耐冬CjCor1系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹包括2個大分支，其中，耐冬山茶與同屬的茶樹(Camelliasinensis)同屬一個大分支，其余11個樹種歸屬另一個大分支(圖5)。此結(jié)果進(jìn)一步表明，Cor序列在同屬物種中的進(jìn)化是高度保守的。

圖2 CjCor1基因全長序列分析 第31～33個堿基為起始密碼子，第628～630個堿基為終止密碼子，最后2行紅線以上堿基顯示Poly(A)結(jié)構(gòu)Fig.2 Nucleotide sequence analysis in CjCor1 gene Number 31-33 nucleotides is initiation codon; 628-630 ones is termination codon; Poly(A) form are up red lines of last two lines

圖3 耐冬山茶CjCor1基因編碼的蛋白保守域Fig.3 Conserved domain of CjCor1 gene encoded protein in C.japonica

圖4 耐冬山茶Cor與其它物種氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment of Cor protein in C.japonica with other species

圖5 耐冬山茶CjCor1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of CjCor1 in C.japonica

圖6 CjCor1基因在山茶原種和品種中的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression level of CjCor1 gene in C.japonica and its varieties

2.4耐冬CjCor1基因在山茶原種及品種中的表達(dá)分析

熒光定量PCR所使用儀器為StepOnePlus，對耐冬山茶CjCor1基因在山茶原種(南方)、耐冬山茶以及南方栽培品種‘寬彩帶’、‘金盤荔枝’中的表達(dá)情況進(jìn)行測定，實驗結(jié)果如圖6所示。在低溫(0℃以下時)條件下，相比南方山茶原種和常見栽培品種，CjCor1基因在耐冬中具有較高表達(dá)量；同時，此基因在‘寬彩帶’、‘金盤荔枝’中的相對表達(dá)量也明顯高于原種。這個結(jié)果也與所試材料的實際抗寒能力一致[9]。這初步表明，CjCor1基因的表達(dá)能力與植物的抗寒性成正比關(guān)系。

3 討論

本研究采用同源片斷克隆的方法，從耐冬山茶葉片中分離到了耐冬山茶Cor基因全長，命名為CjCor1基因。該基因全長617 bp，序列中開放閱讀框為600 bp，編碼199個氨基酸的蛋白質(zhì)，全長序列完整。CjCor1基因編碼的蛋白質(zhì)含有冷馴化蛋白家族特有的WCOR413保守域結(jié)構(gòu)，在同屬物種中的保守性極高。

熒光定量PCR法對CjCor1基因在山茶原種(南方)、耐冬山茶以及南方栽培品種‘寬彩帶’、‘金盤荔枝’中的表達(dá)情況分析結(jié)果表明，CjCor1基因在耐冬中較南方品種具有較高表達(dá)量。

Cor基因為冷馴化表達(dá)基因，目前多從經(jīng)濟(jì)植物中獲得[10]。從目前研究報道可總結(jié)出其在低溫處理條件下即可表達(dá)，且其相對表達(dá)量隨著低溫處理時間的延長而成倍增加[11～12]。葡萄Vvcor27基因在4℃條件下，處理24和48 h的表達(dá)量分別為早期處理0～8 h的50和100倍，這表明該基因的表達(dá)很可能受到其他脅迫基因的誘導(dǎo)調(diào)控[13～14]。此外，葡萄Vvcor27基因和擬南芥Atcor27基因啟動子區(qū)的差別可能是2個基因相應(yīng)冷脅迫表達(dá)模式不同的原因[10]，在后續(xù)的研究中有必要對CjCor1基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行研究，進(jìn)一步明晰該基因的抗寒性能。

本實驗中通過熒光定量分析，CjCor1基因的表達(dá)能力與植物的抗寒性成正比關(guān)系，這與同屬物種茶樹CsCOR1基因在茶樹葉片中過表達(dá)后植株抗寒能力明顯增強(qiáng)的結(jié)果是相符的[15]，在其他物種中也有過類似結(jié)果的研究[13,16]。在對擬南芥等物種的研究中發(fā)現(xiàn)，Cor基因的表達(dá)與植物的抗寒性有關(guān)[17]；耐冬葉片經(jīng)歷了從深秋到寒冬的低溫馴化過程，由此推測CjCor1基因的表達(dá)可能也與耐冬的抗凍性有關(guān)。凍害發(fā)生時，細(xì)胞膜首先會受到損傷，由此推斷CjCor1基因可能對于穩(wěn)定膜脂雙分子層結(jié)構(gòu)具有一定作用，我們正在開展后續(xù)的實驗進(jìn)行驗證。

本研究所分離到的CjCor1基因編碼的蛋白質(zhì)含有冷馴化蛋白家族特有的WCOR413保守域結(jié)構(gòu)，從屬于Cor413基因家族。通過對GenBank中所登錄的Cor413基因家族表達(dá)的組織特異性進(jìn)行研究，Breton等[18]發(fā)現(xiàn)多數(shù)Cor413基因在植物的營養(yǎng)器官(根、葉)中有表達(dá)，也有部分植物中Cor413基因在其生殖器官有表達(dá)(水稻花序、小麥花穗、西紅柿花芽等)，秦華等[19]還發(fā)現(xiàn)Cpcor413pm1基因在蠟梅(Chimonanthuspraecox)花發(fā)育的不同時期都有不同程度的表達(dá)，且隨著花發(fā)育進(jìn)程的發(fā)展表達(dá)量成升高趨勢。因此，在下一步的研究工作中，可進(jìn)一步研究耐冬山茶Cor基因在耐冬芽、花發(fā)育不同階段等的表達(dá)情況，為全面挖掘該基因的耐寒功能提供參考；同時通過轉(zhuǎn)基因和生理指標(biāo)的測定，深入分析耐冬山茶CjCor1基因的上下游調(diào)控脈絡(luò)，剖析耐冬山茶的抗寒機(jī)理，可為提高北方植物的抗寒育種提供科學(xué)基礎(chǔ)。

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Colleges and universities science & technology plan in Shandong province(No.J13LE16);National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period(No.2012BAD01B0703)

introduction：YANG Kai(1975—),male,ectorate,doctor in school,mainly engaged in the study of forest tree seedlings and ornamental plant breeding.

date:2016-05-16

CloningandExpressionAnalysisofCjCor1GenecDNAfromCamelliajaponica(NaiDong)

YANG Kai1,2SUN Ying-Kun2WANG Kui-Ling2LIU Qing-Hua2GAO Han-Dong1*

(1.Nanjing Forestry University,Nanjing 210037；2.Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109)

CORgenes play important roles in plant cold acclimation process. In order to study theCorgene function ofCamelliajaponicato severe cold, adopting homologous cloning method, a 617 bp full-length cDNA sequence was cloned from leaves ofC.japonica(Nai Dong) under the natural low temperature condition, namedCjCor1. The total length sequence is complete, and contains an opening reading frame of 600 bp. Amino acids sequence alignment shows thatCjCor1 gene encodes a protein of 199 amino acids, containing specific conservative domain structure of WCOR413 in cold acclimatization protein superfamily, and highly conservative property in species belonged to same genus. By real-time PCR analysis, comparing with southernCamelliaspecies and common varieties,CjCor1 genes had higher expression inC.japonica(Nai Dong) under the condition of low temperature(below 0℃), and also had higher expression in higher cold resistance varieties.

Camelliajaponica(Nai Dong);CjCor1 gene;sequence analysis;gene expression

山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖?J13LE16)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2012BAD01B0703)

楊凱(1975—)，男，講師，博士研究生，主要從事林木種苗和觀賞植物育種研究。

* 通信作者：E-mail:gaohd@njfu.edu.cn

2016-05-16

* Corresponding author：E-mail:gaohd@njfu.edu.cn

S685.14

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.05.017