PCR-熒光探針法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性及其與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性

白 微 唐少華

( 溫州醫(yī)科大學(xué) 溫州 325000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)，是指自然流產(chǎn)連續(xù)2次或2次以上，在全世界范圍內(nèi)其發(fā)生率為1%～2%，在中國其發(fā)生率高達(dá)5%。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因復(fù)雜，包括遺產(chǎn)因素、生殖道解剖異常、免疫因素、內(nèi)分泌因素、感染因素等，還有部分原因不明。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetra hydrofolate reducta，MTHFR)是葉酸代謝中的一個重要的酶，可將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程，間接為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基，并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一個較低的水平。MTHFR的突變會引起一系列的病理變化，現(xiàn)已證實(shí)與神經(jīng)管畸形、唇腭裂、先天性心臟病、妊娠期高血壓等密切相關(guān)。國內(nèi)外皆有MTHFR C677T與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性報(bào)道，但兩者的相關(guān)性存在較大的爭議。目前MTHFR基因多態(tài)性的檢測方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、高分辨溶解曲線突變檢測(HRM)和二代測序等，PCR-熒光探針法具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，檢測MTHFR具有優(yōu)越性。

本文旨在簡要評價PCR-熒光檢測MTHFR的性能，探討溫州地區(qū)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與MTHFR的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2015年6月～2016年6月我院中醫(yī)婦科保胎住院患者188 例，排除染色體異常、內(nèi)分泌疾病、解剖結(jié)構(gòu)異常、人工受精等。根據(jù)自然流產(chǎn)病史，連續(xù)自然流產(chǎn)2次及以上為實(shí)驗(yàn)組即RSA組，無自然流產(chǎn)史及無其他不良妊娠史且生育過健孩為對照組。RSA組年齡(31.46±4.64)歲，對照組年齡(31.33±4.46)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.027，P=0.869)。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得溫州市醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1PCR-熒光探針法檢測MTHFR C677T 基因多態(tài)性

采集EDTA抗凝的外周靜脈血2ml，提取全血的全基因DNA，借助PCR-熒光探針技術(shù)，利用探針可與DNA模板特異性結(jié)合的特點(diǎn)，通過報(bào)告熒光的不同來分辨出樣本的基因型。試劑盒購自深圳奧薩醫(yī)療有限公司。

1.2.2測序法檢測MTHFR C677T 基因多態(tài)性

選取20例不同基因型的樣本，送第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行全基因測序。

1.2.3統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 PCR-熒光探針法的性能評價

2.1.1最低檢測限

最低檢測限為200pg/ul，有文獻(xiàn)報(bào)道[1]最低檢測限5.0ng/ul可作為臨床應(yīng)用，本試劑盒最低檢測限適應(yīng)臨床需求。

2.1.2準(zhǔn)確性

以測序法作為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果見表1。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，Kappa值=1.0，說明兩種方法具有完全一致性。

表1 兩種檢測方法檢測結(jié)果

基因型CCCTTTCC800CT0100TT002

2.2 H-W平衡檢驗(yàn)

MTHFR有三種基因型：CC基因型、CT基因型、TT基因型。經(jīng)過Hard-Weinberg平衡分析，對照組(χ2=0.005，P=0.997)和RSA組(χ2=1.624，P=0.444)兩組人群處于均處于H-W平衡狀態(tài)，樣本具有本區(qū)域群體代表性。

2.3 MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布

三種基因型及等位基因在對照組中的分布頻率分別為CC(41.4%)、CT(46.5%)、TT(12.1%)和C(65.7%)、T(32.3%)；在RSA組中的分布頻率分別為CC(37.5%)、CT(38.9%)、TT(23.6%)和C(56.9%)、T(43.1%)。兩組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

基因型等位基因CCCTTTCT對照組48(41.4)54(46.5)14(12.1)15(65.7)82(32.3)RSA組27(37.5)28(38.9)17(23.6)82(56.9)62(43.1)χ2/P4.355/0.1132.236/0.135

3 討論

MTHFR是位于第一號染色體1p36.3位置。MTHFR全長20.374 kb，共有外顯子12個，mRNA全長7,150 bp。目前該基因中研究較為透徹的多態(tài)性位點(diǎn)是第五外顯子677位的C/T多態(tài)。目前MTHFR 基因多態(tài)性的檢測方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、高分辨溶解曲線突變檢測(HRM)和二代測序等，PCR-熒光探針法特異性高，方法靈敏，封閉管分析可有效避免污染。本研究使用PCR-熒光探針法和測序法同時檢測了20例樣本，CC型的符合率100%，CT型的符合率100%，TT型的符合率100%,Kappa值=1，兩種方法表現(xiàn)出了完全的一致性，說明PCR-熒光探針法具有高準(zhǔn)確度。

該位點(diǎn)的突變引起酶活性的下降或缺失，使血漿中同型半胱氨酸濃度升高，從而導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，造成血管內(nèi)皮損傷及血栓形成，而血液高凝狀態(tài)是胎盤動脈栓塞形成的內(nèi)在原因，同時高同型半胱氨酸對胚胎有毒性作用，可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)[2]。國內(nèi)有學(xué)者[3]對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析顯示，基因型為CT或TT的女性發(fā)生RSA的風(fēng)險較CC者分別高出93%和22%。王賢軍等人[4]研究了杭州地區(qū)RSA的情況，分析得出，攜帶TT基因型的女性發(fā)生RSA的風(fēng)險是正常女性的2.344倍。國外學(xué)者M(jìn)anju[5]和Ahmad[6]等人分別對北印度和伊朗RSA婦女研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T 基因多態(tài)性在病例組和對照組中的分布無差異。Baumann等[7]以高加索人為研究對象，認(rèn)為MTHTFR C677T 多態(tài)性可能是RSA的病理生理機(jī)制。

本研究未發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T 基因多態(tài)性與RSA存在相關(guān)性。TT基因型和T等位基因在RSA組的分布頻率較對照組增高，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究的結(jié)果與上述王賢軍等人的研究結(jié)果不一致，與Manju和Ahmad等人的結(jié)果相一致。究其原因，MTHFR的分布受人種、地域影響，例如中國人群中TT基因型頻率約為20%，而在非洲撒哈拉地區(qū)黑人種未發(fā)現(xiàn)有TT純合突變[8]；RSA的影響因素包括環(huán)境因素，生活習(xí)慣因素等；另外，研究的樣本大小、研究方法的不同亦造成研究結(jié)果的差異。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在妊娠婦女中的發(fā)生率日益增高，雖本次研究顯示其與MTHFR C677T基因多態(tài)性的相關(guān)性較小，但兩者之間的相關(guān)性從其他角度，如RSA婦女再妊娠的妊娠結(jié)局、早產(chǎn)兒、低體重胎兒等的關(guān)系值得深入研究。