氫飽和生理鹽水對大鼠APALI的保護作用

冷波，薛鈺婷，李波

（1.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院普外科，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，四川瀘州646000；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

氫飽和生理鹽水對大鼠APALI的保護作用

冷波1，薛鈺婷2，李波3△

（1.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院普外科，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，四川瀘州646000；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

目的探討經(jīng)尾靜脈注射氫飽和生理鹽水對?；悄懰徕c誘導的大鼠重癥急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷（APALI）的保護作用。方法（1）大鼠重癥APALI模型的建立及處理：將54只健康SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組［重癥急性胰腺炎（SAP）+氯化鈉注射液（NS）組］和氫水處理組（SAP+H2組），每組18只；各組再按6、12、24 h 3個時間點分為三組，每組6只。Sham組大鼠開腹翻動胰腺數(shù)次后隨即關(guān)腹，不作其他處理，SAP+NS、SAP+H2組以5%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg）經(jīng)膽胰管開口逆行注入（0.1 mL/min）建立模型，在建模成功后1 h經(jīng)尾靜脈分別注射5 mL/kg生理鹽水或等量氫飽和生理鹽水。（2）各組分別在6、12、24 h 3個時間點處死大鼠，收集血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）檢測血清TNF-α、IL-1β水平。結(jié)果（1）SAP+NS、SAP+H2組血清中TNF-α水平在6、12、24 h各個時間點［SAP+NS組：（215.3± 6.0）、（263.2±7.4）、（288.0±5.6）ρg/mL，SAP+H2組：（204.1±8.5）、（122.4±10.3）、（84.1±8.6）ρg/mL］均高于Sham組［（58.8± 7.5）、（57.5±5.1）、（59.6±6.0）ρg/mL］，且SAP+NS組在3個時間點的TNF-α水平均高于SAP+H2組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（2）SAP+NS、SAP+H2組血清中IL-1β水平在6、12、24 h各個時間點［SAP+NS組：（152.8±9.8）、（215.4±10.4）、（254.3±8.6）ρg/mL，SAP+H2組：（154.7±6.8）、（80.3±8.3）、（59.3±8.2）ρg/mL］均高于Sham組［（39.8±3.3）、（39.5±3.3）、（40.5± 5.2）ρg/mL］，且SAP+NS組在12、24 h時IL-1β水平均高于SAP+H2組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而SAP+H2組6 h的IL-1β水平與SAP+NS組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論經(jīng)尾靜脈注射氫飽和生理鹽水對APALI有一定治療保護作用。

氫；氯化鈉；胰腺炎，急性壞死性/并發(fā)癥；肺/損傷；腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β；大鼠

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreastitis，SAP）在臨床上發(fā)展快、病死率高，尤其是急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷（acute pancreatitis associated lung injury，APALI）［1］是SAP最常見和最嚴重的并發(fā)癥之一，是SAP早期主要死亡原因。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminalkinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的成員之一，在應激因素如細胞炎癥因子（TNF-α、IL-1）、生長因子等刺激下激活。有研究表明，在SAP早期，肺組織中JNK信號通路已被激活，從而使活化蛋白-1（acti-vating protein 1，AP-1）激活，活化的AP-1可上調(diào)IL-1β、TNF-α的表達，在APALI中起重要作用［2］。同時，已有研究證實，在SAP發(fā)病早期氧化應激已發(fā)生，大量的氧自由基可影響細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導通路［3］。因此，抗氧化應激治療可能是減輕SAP病情發(fā)展、治療APALI的重要手段。

2007年日本學者Ohsawa等［4］發(fā)現(xiàn)，氫氣具有選擇性抗氧化作用。這一研究結(jié)果迅速引起眾多學者的廣泛關(guān)注，從而掀起了氫分子醫(yī)學的研究熱潮［5-6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氫分子具有減輕炎癥、抗肺纖維化、保護肺泡免受氧化損傷的作用［7-9］。本實驗研究擬在建立大鼠SAP模型的基礎(chǔ)上，探討經(jīng)尾靜脈注射氫飽和生理鹽水是否對SAP及APALI具有保護作用，旨在為SAP及APALI的抗氧化應激治療提供新方向。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康成年雄性SD大鼠54只，清潔級，體質(zhì)量250～300 g，購于西南醫(yī)科大學（原瀘州醫(yī)學院）實驗動物飼養(yǎng)中心。

1.1.2主要實驗試劑氫飽和生理鹽水，大鼠IL-lβ試劑盒、大鼠TNF-α試劑盒均購自德國Bender公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物分組將54只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組［SAP+氯化鈉注射液（NS）組］及氫水處理組（SAP+H2組），每組18只。各組再按6、12、24 h 3個時間點分為3個小組，每組6只。

1.2.2實驗動物模型的建立所有大鼠在實驗前12 h禁食不禁飲%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉顯效后，常規(guī)消毒、鋪巾。取上腹正中切口入腹，暴露胰腺及十二指腸。SAP+NS、SAP+H2組在大鼠近肝門處尋找到膽總管，用動脈夾進行夾閉，用4號半頭皮針經(jīng)十二指腸壁、十二指腸乳頭穿刺入膽胰管約0.5cm，緩慢注入（0.1mL/min）5%無菌?；悄懰徕c（1 mL/kg）；用動脈夾夾閉靠近十二指腸乳頭的膽胰管遠端，5 min后可見胰腺腫脹、充血，去除動脈夾使膽胰管復通，用紗布壓迫穿刺孔，查無膽漏后關(guān)腹。Sham組大鼠開腹后翻動十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次，隨即關(guān)腹，不做其他處理。SAP+NS、SAP+H2組在大鼠SAP模型建模成功后1 h分別經(jīng)尾靜脈注射5 mL/kg生理鹽水或等量氫飽和生理鹽水。

1.2.3血液樣本每組大鼠在麻醉顯效后，心臟采血3～4 mL，12 000 r/min低溫高速離心得血清1.5～2.0 mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4檢測指標及方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）測定大鼠血清TNF-α、IL-1β水平，具體操作步驟如下。（1）標準品（試劑原液）的稀釋：從4℃冰箱取出試劑盒，開啟試劑盒之前在室溫平衡30 min。取120 μL原倍標準品加入120 μL的標準品稀釋液（1號），取120μL1號標準品加入120μL的標準品稀釋液（2號），取120 μL 2號標準品加入120 μL的標準品稀釋液（3號），取120 μL 3號標準品加入120μL的標準品稀釋液（4號），取120 μL 4號標準品加入120 μL的標準品稀釋液（5號）。（2）加樣：具體操作過程見表1。蓋上封板膜，振蕩混勻，37℃溫育60 min。（3）洗滌和顯色：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，再每孔加滿稀釋的洗滌液（濃縮洗滌液∶蒸餾水為1∶19），靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。再依次加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL，振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。（4）終止和測定：每孔加終止液50 μL，終止反應。在加終止液后10 min內(nèi)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD）值。（5）計算：以標準品濃度及對應OD值作標準曲線并計算直線回歸方程，再以樣品OD值代入回歸方程計算對應的樣品濃度。

表1　加樣具體操作過程

1.3統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，多樣本比較采用方差分析；變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，取雙側(cè)a=0.05為標準。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠不同時間點血清中TNF-α水平比較SAP+NS、SAP+H2組大鼠血清中TNF-α水平在6、12、24 h 3個時間點均高于Sham組，且SAP+NS組各時間點TNF-α水平均高于SAP+H2組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。TNF-α水平標準曲線見圖1。

2.2各組大鼠不同時間點血清中IL-1β水平比較SAP+NS、SAP+H2組大鼠血清中IL-1β水平在6、12、24 h 3個時間點均高于Sham組，且SAP+NS組在12、24 h時IL-1β水平均高于SAP+H2組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；雖然SAP+H2組在6 h時IL-1β水平高于SAP+NS組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。IL-1β水平標準曲線見圖2。

表2　各組大鼠不同時間點血清中TNF-α水平比較（，ρg/mL）

表2　各組大鼠不同時間點血清中TNF-α水平比較（，ρg/mL）

注：與Sham組同一時間點比較，aP＜0.05，與SAP+NS組同一時間點比較，bP＜0.05。

Sham組SAP+NS組SAP+H2組24 h 59.6±6.0 288.0±5.6a84.1±8.6ab6 6 6 6 h 58.8±7.5 215.3±6.0a204.1±8.5ab12 h 57.5±5.1 263.2±7.4a122.4±10.3ab

圖1　TNF-α水平標準曲線

表3　各組大鼠不同時間點血清中IL-1β水平比較（，ρg/mL）

表3　各組大鼠不同時間點血清中IL-1β水平比較（，ρg/mL）

注：與Sham組同一時間點比較，aP＜0.05；與SAP+NS組同一時間點比較，bP＜0.05。

組別Sham組SAP+NS組SAP+H2組24 h 40.5±5.2 254.3±8.6a59.3±8.2abn 6 6 6 6 h 39.8±3.3 152.8±9.8a154.7±6.8a12 h 39.5±3.3 215.4±10.4a80.3±8.3ab

圖2　IL-1β水平標準曲線

3　討論

APALI在并發(fā)癥中的發(fā)生率高達60%～70%，其中繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征占20%，為SAP早期的主要死亡原因［10］。有研究報道，SAP激活了全身炎癥連鎖反應［11］。實驗證明，氧化應激反應在APALI早期已發(fā)生，其產(chǎn)生的氧自由基可通過調(diào)控蛋白細胞信號通路致炎癥因子增加，加重肺組織損傷，在APALI中發(fā)揮重要作用［12-13］。因此，抗氧化應激可能是改善APALI的一種途徑。

基于前面的研究，本實驗在建立大鼠APALI模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)尾靜脈注射氫飽和生理鹽水觀察其治療效果。結(jié)果顯示，SAP+H2組大鼠在6、12、24 h時血清中TNF-α水平均低于SAP+NS組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明氫飽和生理鹽水對TNF-α炎癥因子有明顯抑制作用；SAP+H2組在6 h時血清中IL-1β水平與SAP+NS組比較無明顯差異，而隨著時間的變化，在12、24 h時均低于SAP+NS組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明氫飽和生理鹽水對IL-1β炎癥因子有抑制作用。

綜上所述，本實驗通過向APALI大鼠模型尾靜脈注射氫飽和生理鹽水后觀察到血清中TNF-α、IL-1β水平有所抑制。因此，作者認為，氫飽和生理鹽水可能通過其選擇性抗氧化應激作用，從而下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達，對APALI起到一定的治療保護作用。但是，實驗中也觀察到在SAP早期（6 h以內(nèi)）SAP+H2組與SAP+NS組血清中IL-1β水平無明顯差異，這些問題有可能是后續(xù)實驗研究的另一方向。

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Protective effect of hydrogen saturated saline on severe acute pancreatitis associated lung injury in rats

Leng Bo1，Xue Yuting2，Li Bo3△
（1.Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；2.Department of Intensive Care Medicine，Affiliated Hospital，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；3.Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Hospital，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of intravenous hydrogen saturated saline on sodium taurocholate induced rat severe acute pancreatitis associated lung injury（APALI）.Methods（1）The establishment and treatment of severe APALI model：54 healthy male SD rats were randomly divided into the sham operation group（Sham group），model group［severe acute pancreatitis（SAP）+normal saline（NS）group］and hydrogen water treatment group（SAP+H2group），18 cases in each group；each group was subdivided into 3 subgroups according to the time points of 6，12，24 h，6 cases in each subgroup.In the Sham group，the pancreas was stirred for several times after laparotomy and then the abdominal cavity was closed without conducting other treatment.In the SAP+NS group and SAP+H2group，5%sodium taurocholate（1 mL/kg）was retrogradely injected by the biliarypancreatic duct opening（0.1 mL/min）for constructing the model，5 mL/kg normal saline or the equivalent hydrogen saturated saline was respectively injected by the tail vein at 1 h after successfully constructing the model.（2）Rats in each group were killed for collecting serum at the time points of 6，12，24 h.The serum TNF-α and IL-1β levels were detected by ELISA.Results（1）The TNF-α levels at 6，12，24 h were（215.3±6.0），（263.2±7.4），（288.0±5.6）ρg/mL in the SAP+NS group and（204.1±8.5），（122.4±10.3），（84.1±8.6）ρg/mL in the SAP+H2group，which were higher than（58.8±7.5），（57.5±5.1），（59.6±6.0）ρg/mL in the Sham group，moreover the TNF-α level at 3 time points in the SAP+NS were higher than those in the SAP+H2group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.（2）The IL-1β levels at 6，12，24 h were（152.8±9.8），（215.4±10.4），（254.3±8.6）ρg/mL in the SAP+NS group and（154.7±6.8），（80.3±8.3），（59.3±8.2）ρg/mL in the SAP+H2group，which were higher than（39.8±3.3），（39.5± 3.3），（40.5±5.2）ρg/mL in the Sham group，moreover which at 12，24 h in SAP+NS group were higher than those in the SAP+H2group，the differences were statistically significant（P＜0.05），while the IL-1β level at 6 h had no statistical difference between the SAP+H2group and SAP+NS group（P＞0.05）.ConclusionThe tail vein injection of hydrogen saturated saline has certain treatment and protective effect on APALI.

Hydrogen；Sodium chloride；Pancreatitis，acute necrotizing/complications；Lung/injuries；Tumor necrosis factor-alpha；Interleukin-1beta；Rats

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.007

A

1009-5519（2016）18-2803-03

冷波（1984-），碩士研究生，主要從事普外科臨床工作。

△，E-mail：Liboer2002@126.com。

（2016-04-30）