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    硫酸右旋糖苷對(duì)人胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移防治作用的對(duì)比研究*

    2016-11-10 03:25:08王娟黃允寧顏貝王紅紅金秀王瀟飛徐遠(yuǎn)義
    現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2016年18期
    關(guān)鍵詞:整合素糖苷癌細(xì)胞

    王娟,黃允寧,顏貝,王紅紅,金秀,王瀟飛,徐遠(yuǎn)義△

    (1.寧夏醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系,寧夏銀川750004;2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院,銀川750002;3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院精子庫(kù),寧夏銀川750001)

    硫酸右旋糖苷對(duì)人胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移防治作用的對(duì)比研究*

    王娟1,黃允寧2,顏貝3,王紅紅2,金秀1,王瀟飛1,徐遠(yuǎn)義1△

    (1.寧夏醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系,寧夏銀川750004;2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院,銀川750002;3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院精子庫(kù),寧夏銀川750001)

    目的探討預(yù)防性使用硫酸右旋糖苷(DS)和治療性使用DS對(duì)人胃癌細(xì)胞腹腔種植的作用。方法培養(yǎng)胃癌BGC-823細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠動(dòng)物模型:選用BALB/C裸鼠共110只,隨機(jī)分為預(yù)防組(60只)和治療組(50只)。預(yù)防組在注射腫瘤細(xì)胞的同時(shí)注射DS,治療組注射腫瘤細(xì)胞24 h后注射DS。打開(kāi)裸鼠腹腔,觀察胃癌細(xì)胞腹腔種植的數(shù)量,所有結(jié)節(jié)經(jīng)HE染色證實(shí)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色(SP法)檢測(cè)大網(wǎng)膜整合素β1蛋白的表達(dá),應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)大網(wǎng)膜整合素β1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示治療組裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于預(yù)防組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SP法結(jié)果顯示治療組整合素β1蛋白的表達(dá)量明顯高于預(yù)防組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),RT-PCR結(jié)果顯示治療組整合素β1 mRNA的表達(dá)量明顯高于預(yù)防組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論DS預(yù)防胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的效果比治療胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的效果更佳。

    硫酸類(lèi);右旋糖酐類(lèi);胃腫瘤/病理學(xué);腹腔;抗原,CD29;整合素β1;種植

    腫瘤腹腔種植轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、連續(xù)性、多個(gè)不同階段參與的復(fù)雜過(guò)程。腫瘤細(xì)胞黏附到腹膜上是腫瘤細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移的基本步驟之一,是由多種因素決定的。有研究表明,腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移與其黏附分子表達(dá)的改變有關(guān)[1]。整合素是黏附因子家族中的一員,其表達(dá)異常與腫瘤細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。整合素是α、β亞基以非共價(jià)鍵形成的異二聚體[3],以整合素β1的作用最為突出,其通過(guò)胞外區(qū)與多種細(xì)胞外基質(zhì)黏附,參與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附,其胞內(nèi)區(qū)也可通過(guò)與細(xì)胞骨架和多種信號(hào)分子結(jié)合形成黏附物進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4-5],腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與整合素β1的表達(dá)量有密切關(guān)系。

    Hagiwara等[6]研究及本課題組前期研究[7]結(jié)果表明,硫酸右旋糖苷(DS)可以通過(guò)抑制整合素β1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的腹腔種植轉(zhuǎn)移。本研究擬進(jìn)一步探討使用DS對(duì)整合素β1的表達(dá)及胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療是否有差別。現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1細(xì)胞選用北京金紫晶公司腫瘤細(xì)胞庫(kù)培育的人胃癌BGC-823細(xì)胞株,儲(chǔ)存于液氮中,經(jīng)復(fù)蘇接種于10%滅活小牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,在溫度37℃、濕度70%、5%CO2條件下培養(yǎng)。

    1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用購(gòu)自北京維通利華公司的BALB/c裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,動(dòng)物許可證號(hào):SCXX(京)2006-0009,均為雄性,5~6周齡,體質(zhì)量18~22 g。裸鼠可自由攝入無(wú)菌食物和水。

    1.1.3藥品與試劑大分子DS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,用0.9%NaCl溶液稀釋后,再利用22 μm過(guò)濾器過(guò)濾,最終配制成0.3%DS溶液。濃縮型CD34兔抗多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司,兔抗鼠VEGF兔抗多克隆抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司,兔抗羊二抗即用型抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司,PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司,Total RNA Kit購(gòu)自O(shè)megaBio-Tek公司,RT reagentKit購(gòu)自美國(guó)Frementas公司。

    1.2方法人胃癌細(xì)胞株腹腔種植裸鼠模型的制備:將110只BALB/c裸鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為預(yù)防組(60只)和治療組(50只)。所有裸鼠在造模前進(jìn)行麻醉:將戊巴比妥鈉粉末用0.9%NaCl溶液配制成0.5%戊巴比妥溶液,采用50 mg/kg的劑量麻醉裸鼠,將所有裸鼠腹部皮膚和腹中線(xiàn)常規(guī)消毒,選擇左側(cè)正中旁切口,長(zhǎng)為0.8cm,暴露胃壁,將濃度為每毫升1×107個(gè)的BGC-823胃癌細(xì)胞懸浮液懸空滴入裸鼠胃壁(每只0.2 mL),使胃癌細(xì)胞懸浮液延胃壁表面流入胃壁附近的腹腔并關(guān)腹,立即向預(yù)防組裸鼠腹腔中注射0.3%DS(每只1 mL);治療組裸鼠于注射癌細(xì)胞24 h后向裸鼠的腹腔中注射0.3%DS(每只1 mL)。整個(gè)造模過(guò)程中嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作。預(yù)防組分別在注射癌細(xì)胞后1、2、3、7、14 d處死裸鼠,并留一自然死亡組,根據(jù)這6個(gè)處死時(shí)間隨機(jī)均分為6個(gè)小組,每組10只。治療組分別在注射癌細(xì)胞的2、3、7、14 d處死裸鼠,并留一自然死亡組,根據(jù)5個(gè)處死時(shí)間隨機(jī)均分為5個(gè)小組,每組10只。

    1.2.1實(shí)驗(yàn)裸鼠的處理按時(shí)間點(diǎn)采用頸椎脫臼法處死裸鼠,取大網(wǎng)膜組織均分為2份,其中一份大網(wǎng)膜組織立即置于10%甲醛固定液中,用于HE染色、免疫組織化學(xué)染色(SP法);另一份大網(wǎng)膜組織放入凍存管[預(yù)先消毒并用焦碳酸二乙酯溶液處理]中,在-80℃冰箱中儲(chǔ)存,用作RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2HE染色及SP法將所取標(biāo)本經(jīng)如下步驟:10%甲醛固定,石蠟包埋、切片、HE染色、SP法處理。整合素β1經(jīng)SP法后加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照,以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。在IPP圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)中,400倍鏡下選定空白區(qū)作為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn),再選定具有代表性的5個(gè)視野,利用IPP圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)對(duì)所選視野的平均光密度(optical density,OD)值進(jìn)行計(jì)算,比較各組整合素β1的表達(dá)情況。

    1.2.3RT-PCR利用Total RNA Kit試劑盒提取大網(wǎng)膜組織的總RNA,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。上海生工生物工程有限公司合成整合素β1引物,上游引物:5′-CGTAGCAAAGGAACAGCAGA-3′,下游引物:5′-GTAAGACAGGTCCATAAGGTAGTAG-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為168 bp,反應(yīng)條件:94℃4 min,94℃30 s,54.2℃30 s,72℃1 min,共30個(gè)循環(huán),72℃7 min。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物購(gòu)自美國(guó)Fermatans公司,上游引物:5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′,下游引物:5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為496 bp,反應(yīng)條件:94℃4 min,94℃30 s,58℃30 s,72℃1 min,共30個(gè)循環(huán),72℃7 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,再用溴化乙啶進(jìn)行染色,采用美國(guó)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,記錄染色結(jié)果,采集圖像的擴(kuò)增產(chǎn)物用Quantity One分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,基因表達(dá)豐度用相對(duì)光密度(relative optical density,ROD)代表,按整合素β1 ROD值/GAPDH ROD值計(jì)算各組的OD值。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以表示,兩樣本比較采用t檢驗(yàn),多樣本比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1HE染色檢測(cè)預(yù)防組和治療組不同時(shí)間點(diǎn)腹腔種植的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較小鼠腹腔種植的腫瘤結(jié)節(jié)體積大小不一,質(zhì)地略硬,表面較光滑,呈灰白色或瓷白色。界限清楚的腫瘤結(jié)節(jié)記為一個(gè)大結(jié)節(jié),相互融合的記為一個(gè)獨(dú)立結(jié)節(jié),所有結(jié)節(jié)均經(jīng)HE染色證實(shí)病理類(lèi)型為胃癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。隨著注射癌細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng),預(yù)防組和治療組腹腔種植的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)均逐漸增多,第14天、自然死亡時(shí)預(yù)防組小鼠腹腔種植的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且兩組腹腔種植的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.296,P= 0.044)。見(jiàn)表1。

    2.2SP法檢測(cè)預(yù)防組和治療組不同時(shí)間點(diǎn)整合素β1表達(dá)OD值比較預(yù)防組第2、3天及自然死亡時(shí)整合素β1表達(dá)OD值明顯低于治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且兩組整合素β1表達(dá)OD值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=243.890,P=0.000)。見(jiàn)圖1、表2。

    2.3RT-PCR法檢測(cè)預(yù)防組和治療組不同時(shí)間點(diǎn)整合素β1mRNA表達(dá)ROD值比較與治療組比較,預(yù)防組第3、7、14天整合素β1 mRNA表達(dá)ROD值明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且兩組整合素β1 mRNA表達(dá)ROD值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.844,P=0.002)。見(jiàn)表3。

    表1 HE染色檢測(cè)預(yù)防組與治療組不同時(shí)間點(diǎn)腹腔種植的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較(,個(gè))

    表1 HE染色檢測(cè)預(yù)防組與治療組不同時(shí)間點(diǎn)腹腔種植的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較(,個(gè))

    注:-表示無(wú)此項(xiàng)。

    組別預(yù)防組治療組t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡時(shí)FP 0.00±0.002.2960.044 ---0.00±0.00 0.33±0.52 -1.581 0.175 0.67±0.82 1.67±2.34 -0.989 0.346 4.60±3.20 6.83±3.55 -1.146 0.279 10.50±3.45 18.83±8.28 -2.244 0.049 41.83±3.75 58.00±2.90 -2.256 0.047 ----

    表2 SP法檢測(cè)預(yù)防組和治療組不同時(shí)間點(diǎn)整合素β1表達(dá)OD值比較()

    表2 SP法檢測(cè)預(yù)防組和治療組不同時(shí)間點(diǎn)整合素β1表達(dá)OD值比較()

    注:-表示無(wú)此項(xiàng)。

    組別預(yù)防組治療組t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡時(shí)FP 35.75±0.95 ---9.90±1.34 14.87±0.41 -6.190 0.003 28.84±2.15 49.41±1.22 -14.403 0.000 50.85±0.82 53.56±2.53 -1.757 0.154 58.36±0.81 57.22±1.62 1.096 0.335 94.35±3.49 171.57±11.98 -10.723 0.000 243.8900.000 ----

    表3 RT-PCR法檢測(cè)預(yù)防組和治療組不同時(shí)間點(diǎn)整合素β1 mRNA表達(dá)ROD值比較()

    表3 RT-PCR法檢測(cè)預(yù)防組和治療組不同時(shí)間點(diǎn)整合素β1 mRNA表達(dá)ROD值比較()

    注:-表示無(wú)此項(xiàng)。

    組別預(yù)防組治療組t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡時(shí)FP 1.05±0.0949.8440.002 ---1.22±0.11 1.60±0.27 -2.327 0.080 1.19±0.05 1.76±0.12 -7.410 0.002 1.56±0.10 2.44±0.10 -11.164 0.000 1.82±0.18 2.63±0.10 -6.652 0.003 2.22±0.08 2.15±0.17 0.652 0.550 ----

    圖1 SP法檢測(cè)預(yù)防組和治療組第3天整合素β1的表達(dá)(400×)

    3 討論

    胃癌在全國(guó)和世界范圍內(nèi)都有很高的發(fā)病率和死亡率,隨著近年來(lái)胃癌根治術(shù)的不斷開(kāi)展和成熟,胃癌的治療和預(yù)后有了明顯的改善,但由于胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移使胃癌在各種惡性腫瘤中的病死率仍居于前列。胃癌術(shù)后的腹腔化療是阻止胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的常規(guī)治療手段。目前用于胃癌腹腔化療的藥物很多,但由于在腹腔吸收快,無(wú)法達(dá)到長(zhǎng)期有效藥物濃度等原因,治療效果不是十分理想。本研究采用的DS是一種大分子右旋糖苷,相對(duì)分子質(zhì)量大,約為50×104,在腹腔的吸收慢,使其能夠在腹腔內(nèi)長(zhǎng)期維持有效的藥物濃度。國(guó)外自1997年就有科研人員開(kāi)始研究DS的抗癌作用。有研究已表明,DS可以阻止B-16黑色素瘤細(xì)胞在大網(wǎng)膜乳斑和腹膜上種植[8-9],可以安全地用于胃腸吻合手術(shù)。

    腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是指腫瘤從原發(fā)部位脫離向周?chē)瓦h(yuǎn)處組織擴(kuò)散形成另一同類(lèi)型的腫瘤[1],是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過(guò)程。其基本步驟包括:癌細(xì)胞脫落進(jìn)入腹腔形成具有生物活性的脫落癌細(xì)胞;脫落癌細(xì)胞在腹腔內(nèi)游走并黏附于腹膜;癌細(xì)胞著床,增殖侵襲,最終發(fā)展成具有生物活性的轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)。在這一過(guò)程中,細(xì)胞黏附是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。有研究表明,無(wú)論體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí),整合素β1在胃癌細(xì)胞黏附固定于腹膜的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[6,8]。Matsuoka等[10]在研究胃癌細(xì)胞株OCUM-2MD3附著于腹膜的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)整合素β1在具有腹膜轉(zhuǎn)移特性的OCUM-2MD3細(xì)胞中表達(dá)量明顯增高,且明顯高于OCUM-2MD3(不具腹膜轉(zhuǎn)移特性胃癌細(xì)胞株)的表達(dá)??梢?jiàn)整合素β1在腫瘤細(xì)胞離開(kāi)腫瘤母體侵襲到腹膜的這一過(guò)程中,尤其在黏附過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

    本實(shí)驗(yàn)將小鼠開(kāi)腹注入癌細(xì)胞后,預(yù)防組立即注射DS,在胃癌細(xì)胞發(fā)生腹腔種植之前DS就以一定的濃度存在,以此研究DS的預(yù)防作用,而治療組是在癌細(xì)胞注射24 h后再注射DS,使胃癌細(xì)胞先于DS在腹腔中存在,以此研究DS的治療作用。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明,DS可以減少胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量,并可能通過(guò)抑制整合素β1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的腹腔種植轉(zhuǎn)移[11-12]。本研究中SP法和RT-PCR結(jié)果均顯示,預(yù)防組整合素β1的表達(dá)明顯低于治療組,預(yù)防組癌細(xì)胞腹腔種植的數(shù)量也明顯少于治療組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說(shuō)明DS預(yù)防胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的效果明顯優(yōu)于治療的效果。

    本課題組前期對(duì)DS抑制胃癌腹腔種植的作用進(jìn)行了深入研究,但對(duì)于DS何時(shí)應(yīng)用效果更好還沒(méi)有明確的支持依據(jù)。本研究通過(guò)比較預(yù)防組和治療組胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和整合素β1的表達(dá)量,研究DS對(duì)胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移預(yù)防和治療效果的影響,結(jié)果顯示,預(yù)防性使用DS使癌細(xì)胞一進(jìn)入腹腔就處于DS的藥物環(huán)境中比癌細(xì)胞注入24 h再治療性使用DS的效果好。這一研究結(jié)果為DS的具體臨床用藥時(shí)間提供了依據(jù),為臨床胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的預(yù)防性用藥提供了廣闊的前景。

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    [12]王娟,趙雪艷,王紅紅,等.硫酸右旋糖苷對(duì)人胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移和VEGF表達(dá)的影響[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(6):625-628.

    Comparative study of prevention and treatment effect of dextran sulfate on human gastric cancer cells celiac planting metastasis*

    Wang Juan1,Huang Yunning2,Yan Bei3,Wang Honghong2,Jin Xiu1,Wang Xiaofei1,Xu Yuanyi1△
    (1.Department of Pathology,Ningxia Medical University,Yinchuan,Ningxia 750004,China;2.Ningxia Hui Autonomous Region People′s Hospital,Yinchuan 750002,China;3.Sperm Bank,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan,Ningxia 750001,China)

    ObjectiveTo study the effect of dextran sulfate(DS)between preventive use and treatment use on human gastric cancer cells celiac plantation.MethodsGastric cancer BGC-823 cells were cultured for constructing the nude mice model.One hundred and ten BALB/C nude mice were randomly divided into the prevention group(60 cases)and treatment group(50 cases).The prevention group was simultaneously injected by tumor cells and DS,while the treatment group was injected with DS at 24 h after injecting tumor cells.The abdominal cavity of nude mice was opened for observing the celiac planting number of gastric cancer cells.The whole nodules were verified by the HE staining.The expression level of greater omentum integrin β1 protein was detected by immunohistochemistry and the expression of greater omentum integrin β1 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsThe HE staining showed the number of intraperitoneal metastatic tumor nodules in the treatment group was significantly more than that of the prevention group,the difference was statistically significant(P<0.01).The immunohistochemical results showed that the expression of integrin β1 protein in the treatment group was significantly higher than that in the prevention group,the difference was statistically significant(P<0.05).The RT-PCR results showed that the expression of integrin β1 mRNA in the treatment group was significantly higher than that in the prevention group,the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionDS has better effect for preventing gastric cancer celiac implanting metastasis than for treating gastric cancer celiac implanting metastasis.

    Sulfuric acids;Dextrans;Stomach neoplasms/pathology;Abdominal cavity;Antigens,CD29;Integrin beta 1;Plant

    10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.004

    A

    1009-5519(2016)18-2793-03

    寧夏回族自治區(qū)科技廳科技支撐項(xiàng)目(2002310201);寧夏醫(yī)科大學(xué)校級(jí)課題項(xiàng)目(XM2015002)。

    王娟(1987-),碩士研究生,從要從事腫瘤病理研究工作。

    △,E-mail:nxxyy@hotmail.com。

    (2016-04-15)

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