復(fù)方甘草酸苷注射液對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成的影響

顏克香 祝綠川 鄭志忠

·論著·

復(fù)方甘草酸苷注射液對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成的影響

顏克香 祝綠川 鄭志忠

目的： 研究復(fù)方甘草酸苷注射液對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素的影響及其機(jī)制。方法： 通過(guò)CCK8、流式細(xì)胞術(shù)、NaOH裂解法、多巴氧化法和Western-blotting技術(shù)檢測(cè)復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，黑素合成與轉(zhuǎn)運(yùn)及酪氨酸酶活性和蛋白含量的影響。結(jié)果： （1）復(fù)方甘草酸苷注射液濃度低于30 μL/mL，對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響；濃度大于50 μL/mL，細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢；濃度達(dá)到500 μL/mL，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制。（2）濃度在10 μL/mL到200 μL/mL，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在復(fù)方甘草酸苷注射液濃度為50 μL/mL時(shí)增加最明顯；且酪氨酸酶活性呈濃度依賴性增加，在濃度為100 μL/mL和150 μL/mL時(shí)達(dá)到最高。結(jié)論： 復(fù)方甘草酸苷注射液有促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞黑素的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)及增加酪氨酸酶活性的作用。

復(fù)方甘草酸苷； B16鼠黑素瘤細(xì)胞； 酪氨酸酶

臨床上我們發(fā)現(xiàn)用復(fù)方甘草酸苷聯(lián)合其它治療白癜風(fēng)的藥物可明顯加快白斑皮損處色素的恢復(fù)，控制活動(dòng)期皮損的發(fā)展，國(guó)內(nèi)學(xué)者也有報(bào)道復(fù)方甘草酸苷可增加外用藥物如復(fù)方卡力孜然酊、鹵米松等的療效［1，2］，與其它藥物聯(lián)合運(yùn)用的治療效果要優(yōu)于潑尼松［3］。但復(fù)方甘草酸苷治療白癜風(fēng)的理論機(jī)制還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此，我們體外研究不同濃度復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、黑素合成與轉(zhuǎn)運(yùn)及酪氨酸酶活性的影響，探討復(fù)方甘草酸苷治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制，為臨床治療白癜風(fēng)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料 主要試劑:B16鼠黑素瘤細(xì)胞由中科院提供，Hacat細(xì)胞由本室凍存，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)，Gibco公司），新生小牛血清（Hyclone），左旋多巴（L-dopa），胰蛋白酶為Sigma產(chǎn)品，CCK-8（同仁化學(xué)研究所），復(fù)方甘草酸苷注射液（日本米諾公司提供），F(xiàn)ix&Perm破膜試劑盒（invitrogen公司），PE-cytokeratin（abcam公司），兔抗人的酪氨酸酶抗體（abcam公司），CFDA-SE（碧云天）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1B16鼠黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)，經(jīng)含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液和臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每一次實(shí)驗(yàn)均取自同一傳代細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.2B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16鼠黑素瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，以 5×103/孔接種至96孔培養(yǎng)板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，孵育6～12 h待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（1 μL/ mL，5 μL/mL，10 μL/mL，30 μL/mL，50 μL/mL，100 μL/mL，200 μL/mL，500 μL/mL），每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)只含培養(yǎng)液而無(wú)細(xì)胞的空白組和有細(xì)胞不加藥物的對(duì)照組，分別于加藥后24 h，48 h，72 h，96 h，120 h加入CCK-8 10 μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光度值，參考波長(zhǎng)是650 nm，用下列公式計(jì)算各組細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組 A450-空白組 A450）/（對(duì)照組A450-空白組A450）×100。

1.2.3酪氨酸酶活性和黑素含量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16鼠黑素瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以1×105/孔接種至6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，用NaOH裂解法測(cè)定黑素含量［4］，多巴氧化法測(cè)定酪氨酸酶的活性［5］，并加以修改。

1.2.4B16鼠黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶蛋白的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16鼠黑素瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以1× 106接種至直徑6 cm的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/ mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用全細(xì)胞裂解液提蛋白，并用Brodford法測(cè)定蛋白濃度，取相同蛋白濃度的樣品熱變性后上樣，經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后先后加入一抗（1∶1000）和相應(yīng)的二抗孵育，plusECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)酪氨酸酶和β-actin蛋白的表達(dá)，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像分析儀對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.2.5B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定 取2×106B16鼠黑素瘤細(xì)胞用CFDA-SE標(biāo)記（按說(shuō)明書操作），將標(biāo)記后的B16鼠黑素瘤細(xì)胞和Hacat細(xì)胞以1∶2的比例接種于直徑3 cm的培養(yǎng)皿，并設(shè)立單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照組，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)96 h，將細(xì)胞用胰酶完全消化下來(lái)后，用PBS洗滌2次，分別加入試劑A和試劑B（按說(shuō)明書操作）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和通透后加入20 μL PE-cytokeratin，室溫孵育1 h，用含5%FBS的PBS洗滌3次后上流式檢測(cè)PE陽(yáng)性的Hacat細(xì)胞中CFDA-SE標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，即代表成功發(fā)生黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的Hacat細(xì)胞數(shù)目。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞形態(tài)的影響:復(fù)方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時(shí)，B16鼠黑素瘤細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞體變大，樹(shù)突增多，以200 μl/mL時(shí)最明顯，見(jiàn)圖1、2

2.2不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖率的影響:當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度在30 μl/mL以內(nèi)時(shí)，對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響；濃度大于50 μl/mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率開(kāi)始減慢，到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，見(jiàn)表1。

圖1　對(duì)照組

圖2　200 μl/mL組

表1　不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖的影響

2.3不同濃度復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響:當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度在10 μl/mL到200 μl/mL時(shí)，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在濃度為50 μl/mL時(shí)增加最明顯；酪氨酸酶活性呈濃度依賴性增加，在濃度為100 μl/mL和150 μl/mL時(shí)達(dá)到最高，見(jiàn)圖3。

圖3　不同濃度復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響

2.4不同濃度復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞酪氨酸蛋白表達(dá)的影響:當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度在30 μl/ mL和50 μl/mL時(shí)酪氨酸蛋白表達(dá)明顯增加，濃度大于75 μl/mL時(shí)，酪氨酸蛋白表達(dá)降低，當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL，酪氨酸蛋白表達(dá)明顯受抑制，見(jiàn)圖4。

圖4　不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對(duì)酪氨酸蛋白表達(dá)的影響

2.5不同濃度復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞向Hacat細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素的影響:復(fù)方甘草酸苷濃度在10 μl/mL～200 μl/mL之間時(shí)均有促進(jìn)黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，以濃度為75 μl/mL和150 μl/mL時(shí)，黑素轉(zhuǎn)運(yùn)能力最強(qiáng)，無(wú)明顯的劑量相關(guān)性，見(jiàn)圖5。

圖5　不同濃度復(fù)方甘草酸苷對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞向Hacat細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素的影響

3　討論

早在1987年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)甘草次酸抑制B16黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變和刺激黑素的合成，甘草酸苷也可導(dǎo)致同樣的改變但需要的濃度比甘草次酸高20多倍，甘草次酸處理細(xì)胞84 h后除去，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率可輕度恢復(fù)，但倍增時(shí)間是對(duì)照組的2倍，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)甘草次酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制是通過(guò)阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期造成的［6］。我們的結(jié)果表明復(fù)方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時(shí)，B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率開(kāi)始減慢，進(jìn)入平臺(tái)生長(zhǎng)期的時(shí)間延長(zhǎng)，這可能也與阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期有關(guān)。隨著復(fù)方甘草酸苷濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變也越明顯，主要表現(xiàn)為胞體增大，樹(shù)突增多，以濃度為200 μl/mL最明顯；當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL時(shí)，細(xì)胞胞體又開(kāi)始變小，樹(shù)突也減少。

Jung等研究證實(shí)甘草酸苷可以劑量依賴性方式促進(jìn)B16黑素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)，增加酪氨酸酶的活性及黑素的含量。酪氨酸相關(guān)蛋白2（TRP-2）mRNA水平也增加，而酪氨酸相關(guān)蛋白1（TRP-1）的變化不明顯。在甘草酸苷的有效濃度內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞毒性，而在同樣無(wú)毒性濃度下，甘草次酸對(duì)黑素合成無(wú)明顯影響［7］。這與1987年Abe等報(bào)道的甘草次酸能刺激黑素的合成不一致，分析原因可能與兩者的濃度不一樣有關(guān):Jung等的研究是在對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的條件下進(jìn)行，而Abe等的研究是在使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變的條件下進(jìn)行。雖然1分子的甘草酸苷含1分子的甘草次酸和2分子的葡萄醛酸，但相同劑量的甘草次酸不能增加酪氨酸酶mRNA和蛋白水平，對(duì)黑素合成無(wú)影響，這表明甘草酸苷中的糖苷結(jié)構(gòu)在黑素合成過(guò)程中起重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)復(fù)方甘草酸苷濃度在30 μl/mL和50 μl/mL時(shí)，酪氨酸酶蛋白表達(dá)增加，黑素的合成也增加，并在50 μl/mL時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)濃度大于75 μl/mL時(shí)，酪氨酸酶蛋白的表達(dá)開(kāi)始降低，當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL時(shí)，酪氨酸酶蛋白的表達(dá)明顯受抑制。酪氨酸酶活性的增加呈明顯的劑量相關(guān)性，在濃度為100 μl/mL和150 μl/mL時(shí)達(dá)到最高，然后又逐漸降低，但均高于對(duì)照組。

酪氨酸酶活性的增加與黑素合成的增加不完全一致，可能與復(fù)方甘草酸苷中甘氨酸的含量有關(guān)。甘氨酸是一種最簡(jiǎn)單的氨基酸，在蛋白合成中很重要，參與了動(dòng)物的許多生理反應(yīng)，國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸濃度為1～16 mM時(shí)對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，可抑制由α-MSH誘導(dǎo)的B16F0黑素瘤細(xì)胞內(nèi)黑素的合成，且高劑量時(shí)可降低酪氨酸酶蛋白的表達(dá)，但對(duì)酪氨酸酶的活性無(wú)影響［8，9］。當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度為 100 μl/mL時(shí)，甘氨酸的濃度為 26.64 mmol/L，當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度為50 μl/mL時(shí)，甘氨酸的濃度在14 mmol/L以內(nèi)，對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，本研究中觀察到的復(fù)方甘草酸苷濃度在75 μl/mL以上時(shí)，酪氨酸蛋白表達(dá)降低但酪氨酸酶活性增強(qiáng)可能與甘氨酸濃度增加有關(guān)。

黑素分為真黑素和褐黑素兩種，是整個(gè)黑素形成過(guò)程中的兩種不同產(chǎn)物，真黑素為棕色或黑色，褐黑素為紅色或黃色。研究發(fā)現(xiàn)在黑素小體內(nèi)褐黑素合成過(guò)程中巰基的供體來(lái)源主要是游離的半胱氨酸，而不是谷胱甘肽［10，11］；培養(yǎng)基中L-酪氨酸和L-半胱氨酸的濃度變化在體外情況下可調(diào)節(jié)真黑素和褐黑素的比例。在酪氨酸酶的活性足以保證真黑素生成的情況下，控制褐黑素合成的因素是半胱氨酸而不是多巴醌。低濃度的L-半胱氨酸（0.2 mM）增加酪氨酸酶的活性促進(jìn)黑素的合成，而高濃度的L-半胱氨酸抑制酪氨酸酶的活性，使褐黑素的產(chǎn)生增加［12］。當(dāng)復(fù)方甘草酸苷注射濃度為100 μl/mL，鹽酸半胱氨酸的濃度為0.634 mmol/L，本研究中當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時(shí)，黑素的含量又開(kāi)始降低，可能與半胱氨酸濃度過(guò)高導(dǎo)致褐黑素產(chǎn)生增加有關(guān)。

甘草酸苷是由一分子的18β-甘草次酸和兩分子的葡萄醛酸構(gòu)成的親水性三萜皂苷，是甘草提取物中最重要的有效成分之一，具有抗炎、抗過(guò)敏和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者粟玉珍等人的研究也發(fā)現(xiàn)18β-甘草酸濃度在低于3 mmol/L時(shí)對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞無(wú)毒性并有促進(jìn)增殖的作用，但當(dāng)濃度大于4 mmol/L，B16黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。而18β-甘草次酸濃度在大于10 μmol/L時(shí)及對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞有抑制作用，且隨劑量的增大抑制作用增強(qiáng)［13］。上述研究表明低濃度的甘草次酸對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，高濃度的甘草酸苷才對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞有抑制作用。B16鼠黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶的活性和黑素的含量與甘草酸苷和甘草次酸濃度呈劑量依賴性增強(qiáng)，甘草酸苷濃度在2 mmol/L時(shí)達(dá)到最高，甘草次酸濃度在40 μmol/L時(shí)達(dá)到最高，此濃度對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制作用，但在對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用濃度（10 μmol/L以下）時(shí)對(duì)黑素合成無(wú)影響［13］，這與Jung和Abe等的研究結(jié)果一致。雷鐵池等研究發(fā)現(xiàn)甘草等中藥的乙醇提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性有明顯的抑制作用，并進(jìn)一步證實(shí)甘草活性成分18α-甘草酸雙胺鹽在100 μmol/L時(shí)，可明顯抑制酪氨酸酶的活性和降低黑素的含量而不影響細(xì)胞的增殖［14］。這與粟玉珍等的研究結(jié)果不一致，他們研究結(jié)果的差異可能甘草酸分子結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)，一個(gè)是18β-甘草酸，一個(gè)是18α-甘草酸雙胺鹽；也可能與濃度相關(guān)，從雷鐵池等研究結(jié)果的圖表中可以看出當(dāng)18α-甘草酸雙胺鹽濃度在1000μmol/ L時(shí)也表現(xiàn)為增加酪氨酸酶的活性和促進(jìn)黑素的合成。當(dāng)復(fù)方甘草酸苷注射濃度為100 μl/mL，甘草酸苷的濃度為4.25 mmol/L。本研究中復(fù)方甘草酸苷濃度在100 μl/mL和150 μl/mL時(shí)，酪氨酸酶的活性最高，這與粟玉珍等研究結(jié)果一致。復(fù)方甘草酸苷中的甘草酸苷主要是18β-甘草酸。

因此，復(fù)方甘草酸苷可直接激活黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性促進(jìn)黑素的合成，此外還可以促進(jìn)黑素細(xì)胞內(nèi)合成的黑素轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)形成細(xì)胞，這可能是臨床上復(fù)方甘草酸苷治療白癜風(fēng)有效的原因之一。

［1］袁星海，姚新民，王豫平，等.復(fù)方甘草酸苷片聯(lián)合鹵米松乳膏治療白癜風(fēng)的療效觀察［J］.中國(guó)藥房，2005，16（14）:1092-1093.

［2］林偉濤，林偉林.復(fù)方卡力孜然酊聯(lián)合復(fù)方甘草酸苷治療白癜風(fēng)31例［J］.嶺南皮膚性病科雜志，2005，12（4）:315 -316.

［3］鄭成彬，劉秀玲，李桂雙.復(fù)方甘草酸苷片聯(lián)合白癜風(fēng)濃縮丸治療進(jìn)展期白癜風(fēng)的療效觀察［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2008，7（2）:101.

［4］Oikawa A，Nakayasu M.Quantitative measurement of melanin as tyrosine equivalents and as weight of purified melanin［J］.Yale J Biol Med，1973，46（5）:500-507.

［5］鄧瑞春，周勇，章金剛，等.氫化可的松對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶及黑素影響研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（4）:433-436.

［6］Abe H，Ohya N，Yamamoto KF，et al.Effects of glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid on growth and melanogenesis in cultured B16 melanoma cells［J］.Eur J Cancer Clin Oncol，1987，23（10）:1549-1555.

［7］Jung GD，Yang JY，Song ES，et al.Stimulation of melanogenesis by glycyrrhizin in B16 melanoma cells［J］.Exp Mol Med，2001，33（3）:131-135.

［8］Ishikawa M，Kawase I，Ishii F.Glycine inhibits melanogenesis in vitro and causes hypopigmentation in vivo［J］.Biol Pharm Bull，2007，30（11）:2031-2036.

［9］Ishikawa M，Kawase I，Ishii F.Combination of amino acids reduces pigmentation in B16F0 melanoma cells［J］.Biol Pharm Bull，2007，30（4）:677-681.

［10］Potterf SB，Virador V，Wakamatsu K，et al.Cysteine transport in melanosomes from murine melanocytes［J］.Pigment Cell Res，1999，12（1）:4-12.

［11］Kinnaert E，Duez P，Morandini R，et al.Cysteine but not glutathione modulates the radiosensitivity of human melanoma cells by affecting both survival and DNA damage［J］. Pigment Cell Res，2004，17（3）:275-280.

［12］Smit NP，Van der Meulen H，Koerten HK，et al.Melanogenesis in cultured melanocytes can be substantially influenced by L-tyrosine and L-cysteine［J］.J Invest Dermatol，1997，109（6）:796-800.

［13］粟玉珍，周婧，于淞.18β-甘草酸對(duì)鼠黑素瘤B16細(xì)胞酪氨酸酶的影響［J］.臨床皮膚科雜志，2005，34（6）:372-373.

［14］雷鐵池，朱文元，夏明玉，等.甘草酸、熊果苷及氫醌對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成影響的比較研究［J］.臨床皮膚科雜志，2004，29（2）:69-72.

（收稿:2016-05-01 修回:2016-06-12）

The effect of compound glycyrrhizin injection on the melanogenesis of B16 murine melanoma cells

YAN Kexiang，ZHU Lvchuan，ZHENG Zhizhong.
Department of Dermatology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China
Correspondence author:ZHENG Zhizhong，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com

Objective:To investigate the effect of compound glycyrrhizin injection on melanogenesis and mechanism of B16 murine melanoma cells.Methods:The influence of compound glycyrrhizin injection on the growth of B16 murine melanoma cells and the protein level and enzyme activity of tyrosinase，melanogenesis and melanosome transport was measured by CCK8，flow cytometry，NaOH splitting methods，dopa hydrocarbonylation and western-blotting technique，respectively.Results:（1）There was no influence on the growth of B16 murine melanoma cells when the concentration of compound glycyrrhizin injection was lower than 30 μL/mL；The growth rate of B16 murine melanoma cells was retarded when the concentration was higher than 50 μL/mL；The cells were greatly inhibited when the concentration reached 500 μL/mL.（2）The melanogensis and the protein level of tyrosinase were stimulated when the concentration of compound glycyrrhizin injection was between 10 μL/mL and 200 μL/mL；The melanogenesis was greatly stimulated when the concentration was 50 μL/mL，and the tyrosinase activity was increased in a concentration-dependent manner，which was peaked when the concentration was 100 μL/mL or 150 μL/mL.Conclusion:Compound glycyrrhizin injection can stimulate the melanogenesis and melanosome transport，and increase the tyrosinase activity.

compound glycyrrhizin injection；B16 murine melanoma cell；tyrosinase

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海，200040

鄭志忠，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com