天津地區(qū)滑舌鰨養(yǎng)殖水體微生物多樣性研究

馬超++鄭德斌++賈磊++張博++肖廣俠

摘 要：天津半滑舌鰨工廠化水產養(yǎng)殖已經實現(xiàn)了快速的發(fā)展，本文對A1（漢沽地區(qū)養(yǎng)殖所用水源）、A2（漢沽區(qū)域流水式養(yǎng)殖水體）、B1（漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)處理水體）、B2（漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖水體1）、Bb（漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)病魚專養(yǎng)池養(yǎng)殖水體）、C1（大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)處理水體）、C2（大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖水體1）、Cb（大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)病魚專養(yǎng)池養(yǎng)殖水體）8個養(yǎng)殖區(qū)域的微生物，利用宏基因組技術對微生物多樣性進行研究，初步獲取微生物遺傳信息。分析方法主要為對16S rRNA的高變區(qū)V3區(qū)序列進行PCR擴增，并對拼接后的序列進行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。通過分析可知8個養(yǎng)殖區(qū)域的微生物多樣性之間存在著一定的差異。

關鍵詞：半滑舌鰨養(yǎng)殖；水體微生物；多樣性分析

中圖分類號： S966 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160832010

目前野生半滑舌鰨數量驟減，大部分都為養(yǎng)殖品種。半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖是天津水產養(yǎng)殖的支柱產業(yè)之一。其經濟價值高，適合工廠化養(yǎng)殖，在我國已形成了較大的養(yǎng)殖規(guī)模。半滑舌鰨的養(yǎng)殖環(huán)境與半滑舌鰨的生長及病害發(fā)生息息相關，因此分析工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨水環(huán)境中微生物的多樣性，對于研究半滑舌鰨的生長和病害發(fā)生有著重要意義。

本文利用宏基因組技術對天津市工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨的水環(huán)境中的微生物多樣性進行研究，初步獲取微生物遺傳信息，解讀半滑舌鰨養(yǎng)殖水環(huán)境中細菌優(yōu)勢類群及其豐度，揭示半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖水環(huán)境中的菌群特征，分析其菌群的組成和功能。探討?zhàn)B殖水環(huán)境微生物群落同魚病之間的關系，探求微生物群落對魚體健康的影響，以期從養(yǎng)殖池原位環(huán)境鑒定并篩選具有潛在益生作用的功能微生物。

1 實驗方法

1.1 從樣品中提取總DNA后，針對16S rRNA的高變區(qū)V3區(qū)序列設計特異性引物進行PCR擴增

對擴增后的產物進行提純，末端修復，連上接頭、測序引物后，采用IlluminaMiSeq進行測序。

1.2 分析流程

對于測序所得到的序列，通過去除低質量、接頭污染等過程完成數據過濾，得到可信的目標序列，用于后續(xù)分析。過濾后的序列，稱為Clean data或Clean Reads，將雙端測序相應的read1與read2（read1與read2是指分別從5和3端2個方向測序所得到的序列片段）進行拼接；利用軟件QIIME 1.8.0版本對拼接后的序列進行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。

2 結果分析

2.1 數據過濾統(tǒng)計

某些原始序列帶有adapter序列，或含有少量低質量序列。經過一系列數據過濾處理以去除雜質數據，得到Clean Reads。Raw Reads包含低質量的序列、接頭污染的序列、含N比例大于5%的序列，以及Clean Reads。Clean Reads所占的比例越高，數據質量越好，根據每種序列所占的比例繪制如下柱狀圖，可以直觀地反映數據過濾情況。

2.2 數據量統(tǒng)計

數據經過過濾得到Clean Data，下圖為本項目全部樣本的Clean Data數據量統(tǒng)計圖，可以很直觀看出Clean Data數據量已滿足要求。

2.3 測序數據質量值分布

為了反映Clean Data的質量，以保證分析的準確性，以Q30/Q20堿基百分比作為指標進行統(tǒng)計，Q30/Q20堿基百分比越大說明測序錯誤率小于0.1%/1%的堿基在總堿基中的比例越大。下圖以所有樣本為橫軸，以Q30百分比作為對應的縱軸直觀地反映了最終過濾后的數據質量，同時也反映了過濾后各個樣本的質量的均一性（每個樣本的Q30堿基百分比相近）。

為了粗略反映測序過程中測序質量的穩(wěn)定性，以Clean Reads的堿基位置作為橫坐標，每個位置的平均測序質量值作為縱坐標，得到每個樣本測序質量分布圖：

2.4 物種比較分析

在了解每個OTUs對應的物種后，由于存在同一個物種具有多個不同的OTUs的情況。把具有相同物種分類的OTUs合并到一起，統(tǒng)計不同樣品間的物種成分變化，可以了解不同樣品之間的菌群多樣性。如下柱狀圖展示的是Phylum level下的各個樣品中的物種分布：

2.5 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性展示的是樣品內的菌群的多樣性情況，包括菌種的類別豐富度以及菌種數目的均勻度。Alpha多樣性越高即細菌種類越豐富，細菌數目越均勻則表示此群落愈加穩(wěn)定。根據4種不同的計算指標在不同的取樣深度下求得了alpha多樣性chao1度量指標的值，如下圖所示：

區(qū)域Bb的物種多樣性最強，其次為C2和B1，區(qū)域Cb和A1的物種多樣性最差。

2.6 Beta多樣性分析

Beta多樣性展示的是樣品間的菌群的差異情況，根據樣品的物種分布，計算了unweightedUniFrac距離（只考慮各樣品中的物種類別差異）和weighted UniFrac距離（考慮了樣品之間物種類別差異以及各類別物種的豐度的差異）。

然后，對樣品間的距離矩陣進行主成分分析，做出如下的三維PCA圖。

3 小結

對A1、A2、B1、B2、Bb、C1、C2、Cb8個養(yǎng)殖區(qū)域的微生物，利用宏基因組技術對微生物多樣性進行研究，并對拼接后的序列進行分析（OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等），各個區(qū)域的物種多樣性之間存在著一定的差異，其中區(qū)域Bb的物種多樣性最強，C2和B1次之，區(qū)域Cb和A1的物種多樣性最差。

參考文獻

[1]Pei，A. Y.et al.Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes[J].Applied and Environmental Microbiology，2010（76）：3886-3897 .

[2]Vasileiadis，S.et al.Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene v regions coupled with Multi-Million read generating sequencing technologies[J].PLoS ONE，2012（7）：e42671.

[3]Caporaso，J. G. et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Meth，2010（7）：335-336.

[4]Ahn，J.et al.Human gut microbiome and risk for colorectal cancer[J].Journal of the National Cancer Institute，2013（105）：1907-1911.

[5]Adler，C.J.et al.Sequencing ancient calcified dental plaque shows changes in oral microbiota with dietary shifts of the neolithic and industrial revolutions[J].Nat Genet，2013（45）：450-455.

[6]Zhang，J.Kobert，K.Flouri，T.&Stamatakis，A. PEAR：a fast and accurate illumina Paired-End reAdmergeR[J].Bioinformatics，2013（30）：btt593-620.