線粒體功能對(duì)輔助生殖技術(shù)的影響

姜永輝 周雪源 李艷 趙玉

【摘要】卵母細(xì)胞質(zhì)量與不孕、發(fā)育異常、囊胚數(shù)目的減少以及胚胎丟棄有關(guān)，而線粒體的功能是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要因素，同時(shí)也是受精和獲得健康后代的重要決定因素。越來(lái)越多的女性不孕癥患者伴隨著諸如糖尿病和肥胖等代謝疾病以及卵母細(xì)胞老化等問題，這類人群因?yàn)榫€粒體功能異常，在進(jìn)行輔助生殖技術(shù)助孕的過程中往往也較難取得令人滿意的妊娠結(jié)局。為了修復(fù)卵母細(xì)胞質(zhì)量提高輔助生殖技術(shù)的成功率，核置換、極體移植等新技術(shù)引起了人們的重視。

【關(guān)鍵詞】線粒體；卵母細(xì)胞；胚胎發(fā)育；新陳代謝；輔助生殖

Influences of mitochondrial functions on assisted reproductive technologyJIANG Yonghui1， ZHOU Xueyuan1， LI Yan1， ZHAO Yu2△. 1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， Shandong， China； 2. Department of Reproductive Medicine， The Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250001， Shandong， China

【Abstract】Quality-compromised oocytes are correlated with infertility， developmental disorders， reduced blastocyst cell number and embryo loss. Mitochondria are critical indicators of oocyte quality and are important for fertilization and development into viable offspring. Increasingly， women affected by metabolic disorders such as diabetes or obesity and oocyte aging are seeking treatment in assisted reproductive technology （ART）. However， these patients are difficult to obtain satisfactory outcomes. In order to restore oocyte quality and improve the success rate of ART， new technologies such as nuclear genome transfer and polar body genome transfer have caused peoples attention.

【Key words】Mitochondria； Oocytes； Embryo development； Metabolism； Assisted reproductive technology （ART）

【中圖分類號(hào)】R711.6【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

生育已經(jīng)成為一個(gè)世界性問題，線粒體功能異常與糖尿病、肥胖[1]及高齡婦女[2]的不孕情況有關(guān)。即使是在進(jìn)行輔助生殖技術(shù)助孕過程中，這類婦女的妊娠結(jié)局也不夠令人滿意。

線粒體對(duì)卵母細(xì)胞功能的影響重大，其功能是評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要指標(biāo)。線粒體的主要功能是產(chǎn)生ATP以提供能量。在已分化的體細(xì)胞中，ATP主要通過氧化磷酸化途徑產(chǎn)生[3，4]；在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞中主要通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生。ATP產(chǎn)生途徑的變化主要與線粒體結(jié)構(gòu)有關(guān)。胚胎形成階段的線粒體結(jié)構(gòu)從圓形（未成熟）轉(zhuǎn)變?yōu)槭蓍L(zhǎng)型（成熟、分化）時(shí)，線粒體代謝從主要的糖酵解途徑轉(zhuǎn)變成氧化磷酸化途徑。和體細(xì)胞相比，我們對(duì)卵母細(xì)胞和提前移植胚胎的線粒體的了解相對(duì)較少，但是我們知道卵母細(xì)胞和胚胎線粒體的功能異常與不孕和胚胎發(fā)育異常有著重要的關(guān)系。

線粒體功能對(duì)減數(shù)分裂紡錘體的形成以及受精時(shí)MⅡ期的維持十分重要。ATP缺乏會(huì)導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生，有研究指出，人卵母細(xì)胞染色體分離出錯(cuò)的比例大約是15%～20%[5]，5%是非整倍體的發(fā)生[6]。糖尿病和肥胖以及高齡婦女的卵母細(xì)胞發(fā)生非整倍體的頻率更高。線粒體移植已經(jīng)成功應(yīng)用于一些質(zhì)量受損的卵母細(xì)胞中[7]，但是這一新技術(shù)引起了廣泛的倫理討論的同時(shí)也帶來(lái)了線粒體異質(zhì)性和遺傳疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。本文將從線粒功能及對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育的影響；線粒體功能異常；克服線粒體功能異常以提高試管嬰兒成功率的機(jī)遇與挑戰(zhàn)三個(gè)方面論述。

1線粒體功能及對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育的影響

線粒體是多功能的細(xì)胞器，參與細(xì)胞能量產(chǎn)生、鈣離子內(nèi)環(huán)境平衡[9]、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡[10]以及其它細(xì)胞活動(dòng)[11]。在不同環(huán)境條件下，線粒體有巨大的潛能去調(diào)節(jié)它們的功能、動(dòng)力以及新陳代謝活動(dòng)。許多關(guān)于線粒體新陳代謝、動(dòng)力、生物化學(xué)、分子組成和一些相關(guān)功能的研究已經(jīng)在體細(xì)胞上證實(shí)，線粒體功能異常與人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟疾病、糖尿病和癌癥等有關(guān)[12]。線粒體還是半自主的細(xì)胞器，人類mtDNA的長(zhǎng)度為16，569bp，擁有37個(gè)基因，編碼了2種rRNA（12S rRNA和16S rRNA）、22種tRNA（同樣轉(zhuǎn)運(yùn)20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，只是亮氨酸和絲氨酸都有兩種對(duì)應(yīng)的tRNA）以及13種多肽（呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的亞基）。線粒體活性除了主要依賴于線粒體整體的活力和動(dòng)力外，還依賴于一些對(duì)細(xì)胞周期十分重要的功能和特性，如線粒體轉(zhuǎn)換孔、膜電位、定位、分布模式和足夠數(shù)量的mtDNA。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一組蛋白復(fù)合體，是一種非特異性通道，其分子組成尚未完全清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由外膜電壓依賴的陰離子通道（VDAC）、內(nèi)膜的腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)位蛋白（ANT）以及親環(huán)素D等組成[13]。線粒體膜電位受線粒體活性影響，并且對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量非常重要，相反，卵母細(xì)胞中低極性的線粒體會(huì)導(dǎo)致胚胎的發(fā)育異常[14]。

早期胚胎細(xì)胞的線粒體是圓形的，只有少數(shù)嵴，這一般作為功能未成熟線粒體和未分化細(xì)胞的特征。雖然現(xiàn)在還沒有完全了解線粒體的功能機(jī)制，但是我們知道線粒體對(duì)于卵母細(xì)胞的成熟、受精和早期胚胎的發(fā)育很重要，并且為核膜分解、微管的組裝和拆卸以及減數(shù)分裂和有絲分裂紡錘體的形成等活動(dòng)提供ATP。

1.1卵母細(xì)胞的成熟

線粒體對(duì)卵母細(xì)胞的成熟十分重要，是卵母細(xì)胞在成熟過程中質(zhì)量變化的可靠指標(biāo)。初生女嬰卵巢中的卵母細(xì)胞停留在GV期，在激素等促排卵因素的刺激下，生發(fā)泡破裂，第一極體（Pb1）排出，進(jìn)入MⅡ期，成為成熟卵子。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的線粒體主要分布于紡錘體周圍[15]。這種分布意味著線粒體對(duì)于紡錘體的形成以及維持紡錘體的完整性有重要意義。卵母細(xì)胞的重構(gòu)過程需要線粒體提供ATP。線粒體提供的ATP對(duì)蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化也十分重要，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的成熟以及MⅠ期和MⅡ期紡錘體的形成[16，17]。

1.2受精

受精開始于MⅡ期，第二極體的排出是受精的標(biāo)志，同時(shí)也是獲得母親單倍體遺傳的標(biāo)志。哺乳動(dòng)物的胚胎中，精子的線粒體在受精的過程中被損壞了[18]，所以胚胎中的線粒體全部來(lái)自母親[19]。MⅡ期卵母細(xì)胞包含胚泡期生長(zhǎng)所需要的全部的足量的線粒體。線粒體分配不均導(dǎo)致人胚胎2-4細(xì)胞階段線粒體遺傳不均衡[20]，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體缺乏的卵裂球細(xì)胞溶解。發(fā)育中胚胎細(xì)胞的丟失會(huì)對(duì)胚胎的移植產(chǎn)生不良影響。

1.3早期胚胎發(fā)育

胚胎發(fā)育過程中需要的能量逐漸增加，此時(shí)線粒體特性的重塑就十分重要。胚胎早期發(fā)育時(shí)，線粒體會(huì)由一個(gè)簡(jiǎn)單的球形向更復(fù)雜的形態(tài)轉(zhuǎn)變，包括發(fā)育更完全的嵴、密度更大的基質(zhì)、瘦長(zhǎng)或者枝狀的形狀。形態(tài)上的復(fù)雜變化與糖酵解到氧化磷酸化這樣生物能量學(xué)轉(zhuǎn)化有關(guān)，這一轉(zhuǎn)化包括呼吸鏈復(fù)雜密度的增加和ATP的產(chǎn)生。細(xì)胞分化到滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)時(shí)線粒體的變化尤其明顯[21]。Schatten[22]研究指出，線粒體的延長(zhǎng)和增加的嵴的形成發(fā)生在滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分化成上皮層時(shí)，此時(shí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞保持圓形，包含只有很少或沒有嵴的線粒體。

許多關(guān)于成熟、受精、胚胎發(fā)育的研究已經(jīng)在鼠、兔、牛、豬等動(dòng)物身上試驗(yàn)過，但是關(guān)于人類的研究卻很少。為了提高IVF成功率，這一領(lǐng)域的研究已在迅速發(fā)展。

2線粒體功能異常

卵母細(xì)胞成熟缺陷與ATP數(shù)量、鈣穩(wěn)態(tài)、激素效應(yīng)等幾個(gè)方面因素有關(guān)[23]。一些代謝性疾病如肥胖、糖尿病以及高齡等因素會(huì)降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。代謝異常不僅影響成年女性的卵母細(xì)胞質(zhì)量，還會(huì)影響胚胎原始生殖細(xì)胞的功能[24]。線粒體對(duì)細(xì)胞質(zhì)的成熟[25]（參與ATP合成）很重要，因此細(xì)胞質(zhì)成熟過程中mtDNA復(fù)制數(shù)量的最低值意義重大。目前已有學(xué)者在鼠[26]、牛[27]、豬[28]以及人身上[29]進(jìn)行相關(guān)研究。鼠、牛和豬的卵母細(xì)胞mtDNA復(fù)制數(shù)量個(gè)體間沒有很大的差異。然而在人卵母細(xì)胞中，卻有著20000～598000的顯著的變化區(qū)間，平均為193000[29]，256000[30]，314000[31]。人卵母細(xì)胞中這一顯著的區(qū)間變化可能反應(yīng)了不同受驗(yàn)的IVF病人的差異[32]，這也意味著人卵母細(xì)胞質(zhì)量變化與生殖問題有關(guān)。

線粒體功能異常對(duì)卵母細(xì)胞老化的影響包括以下幾點(diǎn)：mtDNA復(fù)制數(shù)量的變化、突變負(fù)荷幾率的增加、線粒體基因表達(dá)的變化、線粒體膜電位的降低、線粒體動(dòng)力的改變、線粒體密度的增高、線粒體膜破裂的頻率、ATP合成和代謝反應(yīng)在電子傳遞鏈中的降低以及活性氧的增加[33]?；钚匝醍a(chǎn)生于ATP生成的過程中，它可以導(dǎo)致mtDNA的氧化損傷進(jìn)而導(dǎo)致突變和mtDNA數(shù)量的減少。由于mtDNA修復(fù)酶的數(shù)量很少，線粒體對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷十分敏感[34]。mtDNA突變率是核DNA突變率的10～20倍[35]，這可能與有限的DNA修復(fù)能力有關(guān)。mtDNA突變負(fù)荷的積累反向影響線粒體功能進(jìn)而對(duì)早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響。

糖尿病和肥胖已經(jīng)成為了引起全世界關(guān)注的問題，據(jù)估計(jì)全世界大約有15億人和10億人受糖尿病和肥胖問題干擾。糖尿病和肥胖是導(dǎo)致線粒體功能異常的兩個(gè)主要誘因，這大大增加了輔助生殖技術(shù)中糖尿病和肥胖患者的人數(shù)。

3克服線粒體功能異常以提高IVF成功率的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

提高IVF成功率最具有挑戰(zhàn)性的難點(diǎn)是如何提高糖尿病、肥胖、高齡以及其它代謝異常女性卵母細(xì)胞線粒體的質(zhì)量。細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，即受體卵母細(xì)胞接受含有健康線粒體的供體卵母細(xì)胞的置換，已經(jīng)被認(rèn)為是消除線粒體突變的優(yōu)選治療方式[36]。許多發(fā)育異常疾病與線粒體功能異常相關(guān)的研究近年來(lái)有較大進(jìn)展，比如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、癌癥、免疫系統(tǒng)以及一些影響世界大部分人的疾病[37]。由于核基因組上線粒體的功能依賴性，用于供體轉(zhuǎn)移的細(xì)胞類型需要特別考慮。生殖系優(yōu)質(zhì)線粒體最好可以從卵母細(xì)胞前體細(xì)胞中獲得，優(yōu)先使用以減少可能損害氧化磷酸化作用[38]。這可能會(huì)出現(xiàn)線粒體異質(zhì)性，但是在體細(xì)胞核移植（SCNT）上的研究證實(shí)其在一定程度上可以接受[39]。正常婦女出現(xiàn)線粒體異質(zhì)性的幾率是3%[40]，目前并沒有在這些人身上發(fā)現(xiàn)不良影響。通過細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移來(lái)增加健康線粒體的數(shù)量不僅有利于母親克服生育問題，也有利于受母親影響的孩子避免遺傳缺陷的線粒體。在許多情況下，小數(shù)量的線粒體轉(zhuǎn)移足以恢復(fù)最佳線粒體功能并防止次優(yōu)線粒體遺傳給下一代。

除了細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，補(bǔ)充輔酶Q10增加線粒體活性，也被認(rèn)為是提高質(zhì)量受損的卵母細(xì)胞線粒體功能的一個(gè)途徑[41]。線粒體呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移過程中的輔酶Q10助劑是能量產(chǎn)生過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。其它治療方法還包括線粒體靶向藥物的研究[12]等。消除mtDNA突變遺傳給后代的可行性方法是選取不同女性的兩個(gè)卵母細(xì)胞。

3.1紡錘體-染色體復(fù)合物移植[36]

在GV期或者M(jìn)II紡錘體期，將患者卵子的核轉(zhuǎn)移到含有健康線粒體的去核供卵中。重組后的卵包含了供體的mtDNA、患者的核DNA，以及少量的隨核一起轉(zhuǎn)移過來(lái)的患者mtDNA。然后把通過卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)獲得的胚胎移植到患者子宮里。這一過程也叫做“三親試管嬰兒”，但是其核基因主要來(lái)自于父母。

3.2原核移植

含有異常線粒體的患者的卵受精后，把其原核取出并轉(zhuǎn)移到去除原核的擁有正常線粒體的受精卵中。重組后的受精卵在體外培養(yǎng)到一定階段后再移植到患者子宮中。原核移植過程中仍然會(huì)有少量患者的mtDNA隨原核一起轉(zhuǎn)移。

3.3極體移植[42]

前兩種方法都無(wú)法徹底替換掉不正常的線粒體，最新的研究發(fā)現(xiàn)，極體中線粒體含量極少并且擁有與核一樣的遺傳物質(zhì)，故有望成為線粒體捐贈(zèng)的首選核供體?；诖?，首先移除供卵MⅡ期紡錘體使其無(wú)核化，然后患者卵子受精后取出第二極體并移植到無(wú)核的供體卵母細(xì)胞中。此時(shí)供體卵母細(xì)胞包含著患者的核DNA和健康的線粒體，接下來(lái)通過常規(guī)IVF獲得妊娠。

線粒體置換能夠有效的解決線粒體遺傳病問題和輔助生殖低成功率的問題，然后這一新技術(shù)的廣泛應(yīng)用仍然面臨著許多倫理問題。早在2011年，英國(guó)人類受精與胚胎管理局（human fertilisation and embryology authority，HFEA）便已著手總結(jié)當(dāng)年線粒體置換調(diào)研結(jié)果[43]。2014年6月，經(jīng)過漫長(zhǎng)的科學(xué)和倫理評(píng)估以及公共咨詢之后，英國(guó)公布了新的草案，擬允許HFEA批準(zhǔn)醫(yī)院進(jìn)行線粒體置換的臨床研究[44]。2015年2月份英國(guó)下議院通過了mtDNA替代療法新技術(shù)的決議，若繼續(xù)通過上議院的投票，世界上首個(gè)“三親嬰兒”將有望在2016年出生。

4前景與展望

過去十年見證了質(zhì)量缺陷卵母細(xì)胞潛在治療的巨大希望，這一領(lǐng)域的研究對(duì)肥胖、糖尿病、高齡等代謝障礙的婦女意義重大。膳食補(bǔ)充輔酶Q10、線粒體移植等將為卵母細(xì)胞質(zhì)量缺陷的婦女提高IVF成功率和實(shí)施新的治療方法提供了希望。通過對(duì)線粒體不斷的探索和研究，相信mtDNA必然可以在輔助生殖技術(shù)中發(fā)揮更重要的作用，造福于患者及其家庭，使人類的生殖醫(yī)學(xué)水平邁進(jìn)一大步。

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