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    TGF—β1、MMP—2、TIMP—2與子宮脫垂發(fā)生的相關(guān)性

    2016-11-09 05:06:04張小紅劉志紅洪莉
    中國性科學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激

    張小紅 劉志紅 洪莉

    【摘要】目的:檢測盆腔器官脫垂(POP)患者子宮骶韌帶組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)蛋白的表達;分析TGF-β1、MMP-2、TIMP-2各變量之間的相關(guān)性;闡明氧化應(yīng)激可能是POP的發(fā)生發(fā)展的誘導(dǎo)因素。方法:Western blot檢測POP和非POP正?;颊咦訉m骶韌帶組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達。分析TGF-β1、MMP-2、TIMP-2各變量之間的相關(guān)性。結(jié)果:Western blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示,與非POP正常組相比,POP組子宮骶韌帶組織中 TGF-β1及 TIMP-2蛋白表達水平下降,而MMP-2蛋白表達水平增加,使得MMP-2/TIMP-2比值增大,上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。變量間相關(guān)性分析結(jié)果:POP組組織中TGF-β1 蛋白表達與MMP-2蛋白表達呈負相關(guān),(r=-0.463, P<0.05),而TGF-β1 蛋白表達與TIMP-2蛋白表達之間呈正相關(guān),相關(guān)具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.743 ,P<0.05);而非POP正常組組織中TGF-β1 蛋白表達與MMP-2及 TIMP-2蛋白表達均無顯著相關(guān)性(r=0.183, P>0.05;r=0.342, P>0.05)。結(jié)論:TGF-β1、MMP-2、TIMP-2可能通過機械力誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)對盆底組織的刺激作用;而TGF-β1在氧化應(yīng)激中有保護作用。

    【關(guān)鍵詞】氧化應(yīng)激;盆腔器官脫垂;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;基質(zhì)金屬蛋白酶-2;基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2

    Correlation of TGF-β1, MMP-2 and TIMP-2 and pelvic organ prolapseZHANG Xiaohong1, LIU Zhihong1, HONG Li2△. 1.Department of Obstetrics and Gynecology, Hanchuan Peoples Hospital, Xiaogan 431600, Hubei, China; 2.Department of GynecologyⅡ, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei, China

    【Abstract】Objectives: To explore the effect of oxidative stress on the pathophysiology of pelvic organ prolapsed (POP). Methods: The expression levels of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinase-2 (TIMP-2) of the samples were assessed by western blot analysis. Results: As revealed by western blot analysis, the expression levels of TGF-β1 and TIMP-2 were lower, while the MMP-2 expression was much higher in cardinal ligaments of POP group as compared with the control group, thus increasing the ratio of MMP-2/TIMP-2, with statistically significant differences (P<0.1). The levels of TGF-β1 were negatively correlated with those of MMP-2 in POP group (r = - 0.463, P<0.05); the levels of TGF-β1 were positively correlated with those of TIMP-2 in POP group (r = 0.743, P<0.05); the three factors in controls showed no positive correlation (r = 0.183, P> 0.05; r = 0.342, P> 0.05). Conclusion: Oxidative stress may be concerned with the pathophysiology of POPby influencing the expression levels of TGF-β1, MMP-2 and TIMP-2, thus regulating the balance of MMP-2 and TIPM-2 in the fibroblasts of cardinal ligaments.

    【Key words】Oxidative stress; Pelvic organ prolapse (POP); Transforming growth factor-β1 (TGF-β1); Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2); Tissue inhibitors of metalloproteinase-2 (TIMP-2)

    【中圖分類號】R711.74【文獻標(biāo)志碼】A

    盆腔器官脫垂( pelvic organ prolapse, POP) 是由于盆底支持結(jié)構(gòu)組織松弛或損傷致使盆腔臟器下垂,主要表現(xiàn)為陰道的前、后壁膨出、陰道穹窿脫垂或子宮脫出[1]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-1,TGF-β1)是細胞外基質(zhì)(extra cellularmatrix,ECM)的一種生物活性分子,與膠原代謝關(guān)系密切的細胞因子?;|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可降解膠原,基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)可特異性與MMPs結(jié)合,抑制膠原降解。研究證實[2-6]機體在氧化損傷中產(chǎn)生ROS能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β1,既可使成纖維細胞大量合成、分泌膠原蛋白,又可抑制ECM降解酶分泌,促進降解酶抑制劑的合成等方式調(diào)節(jié)ECM的代謝?;|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑證實在氧化應(yīng)激抗氧化的過程中是重要的抗氧化的蛋白酶抑制劑[7-9]。目前對POP分子學(xué)的研究主要是認為膠原的降解增多致使生物力學(xué)性能減弱而發(fā)病,是否由于生物力學(xué)的作用誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激還有待研究。本研究通過檢測POP患者子宮骶韌帶組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達,以闡明氧化應(yīng)激在子宮脫垂發(fā)生的機制中的作用。

    1材料與方法

    1.1研究對象

    選取2013年11月至2015年6月在湖北省漢川人民醫(yī)院住院的病人,參照POP-Q評估分類系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn),患者診斷為Ⅲ或Ⅳ期盆腔器官脫垂,可伴或不伴壓力性尿失禁,均進行的手術(shù)方式為陰式全子宮切除術(shù)和(或者)陰道的前和(或者)后壁修補術(shù)等一種或多種盆底手術(shù)24例患者為POP組,非盆腔器官脫垂的良性疾病患者而行陰式或腹式或腹腔鏡全子宮切術(shù)20例患者為非POP正常組。應(yīng)盡量減少對氧化應(yīng)激水平有影響的混雜因素,故應(yīng)排除患者與雌激素相關(guān)性疾病,如子宮內(nèi)膜的增生、子宮肌瘤、內(nèi)膜異位癥的相關(guān)疾病、激素分泌性卵巢腫瘤,也要排除合并癥的患者如惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病、糖尿病、心血管疾等均不被納入,也要排除最近3個月內(nèi)未使用任何激素及抗氧化類藥物,手術(shù)后病理診斷為非功能性卵巢腫瘤等與雌激素相關(guān)性疾病的患者。兩組間均無顯著差異性(P > 0.05),具有可比性。

    1.2組織來源

    經(jīng)漢川市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后,納入研究的所有患者均要簽訂知情同意書,選取術(shù)中患者切除子宮骶韌帶組織0.5×0.5×0.2cm3,用無菌生理鹽水簡單清洗后迅速將組織放入含雙抗(青霉素100kU/mL, 鏈霉素100mg/mL, 杭州吉諾生物有限公司)無血清DMEM培養(yǎng)基,為組織蛋白的提取用。

    1.3方法

    1.3.1組織蛋白的提取 ①取100mg 新鮮組織標(biāo)本,眼科剪刀剔除干凈后剪碎;②以1∶5比例,將1mg組織加入5mL裂解液的比例加入含PMSF的裂解液(1mL裂解液加入10μLPMSF),用超聲器勻漿至充分的裂解;③裂解30min后,將裂解液移入1.5cm的離心管中,10000~14000g離心15min,取上清,-80℃保存。④整個組織裂解及離心過程均置4℃進行。

    1.3.2蛋白質(zhì)凝膠電泳①將玻璃板清洗干凈后置放并晾干,對齊后緊卡在模具架中,同時也要垂直緊卡在架子上以備灌膠;② 配備12%分離膠,加TEMED和10%AP后立即搖勻后即行快速灌膠;③待水和膠間出現(xiàn)一條明顯的折射線時,說明膠已凝固,即可棄去膠的上層液體;④配備4%濃縮膠,加TEMED和10%AP后快速來回混勻即行灌膠; ⑤所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣,操作輕柔避免吸入氣泡,以避免上樣不準(zhǔn)確。

    1.3.3蛋白轉(zhuǎn)膜①將裁減好的NC膜置于超純凈水中充分浸泡大約20min后,再將其轉(zhuǎn)移到緩沖液中浸潤完全即可使用;②要先將蛋白凝膠電泳玻璃板的兩端用吸水紙盡量吸干凈,然后輕撬開玻璃板后,除去薄玻璃板并用其將濃縮膠棄去,注意勿使分離膠刮破。分離膠而后置于轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡15min,即行轉(zhuǎn)膜;③恒流200mA,轉(zhuǎn)膜2h;④轉(zhuǎn)膜完成后,打開轉(zhuǎn)移器,將膜輕取出,在室溫下晾干備用。

    1.3.4免疫反應(yīng)①將電轉(zhuǎn)好的膜用TBS清洗后,置放在5%脫脂牛奶中封閉,搖床lh;②TBS清洗膜3遍,置適當(dāng)比例一抗溶液中并搖床上4℃過夜;③取出膜搖床0.5h,待其恢復(fù)到室溫,收集一抗溶液,4℃保存,可以重復(fù)使用3~4次;④TBST清洗膜3遍,膜置放在適當(dāng)比例生物素標(biāo)記二抗溶液中,搖床lh;⑤〗TBST清洗膜3遍;⑥而后進行掃膜拍照,根據(jù)條帶灰度分析系統(tǒng)定量,獲取蛋白的表達。

    1.4統(tǒng)計方法

    將western blot條帶轉(zhuǎn)化為灰度值后,用SPASS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,使用配對樣本T檢驗比較POP組和非POP組間檢測指標(biāo)的差異(檢驗水準(zhǔn)為α= 0.05),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Spearmar進行變量相關(guān)性分析,P<0.01差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1POP組和非POP正常組組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白水平表達比較用Western Blot檢測POP組與非POP組組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達,結(jié)果顯示,POP組與非POP組比較, POP組組織中TGF-β1 和TIMP-2蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而POP組組織中MMP-2蛋白表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

    2.2POP組和非POP正常組組織TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達中變量之間相關(guān)關(guān)系POP組的組織中TGF-β1 與MMP-2蛋白的表達呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.463)而TGF-β1與TIMP-2蛋白的表達之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.743),且相關(guān)均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);非POP正常組的組織中 TGF-β1 蛋白表達與MMP-2及 TIMP-2蛋白表達均無相關(guān)性(P>0.05)。見圖2。

    3討論

    女性盆底是一個復(fù)雜支持系統(tǒng),由肌肉群、筋膜、韌帶及其神經(jīng)等組織構(gòu)成。女性盆底肌肉群、筋膜、韌帶及其神經(jīng)等組織構(gòu)成盆底復(fù)雜的支持系統(tǒng),支撐子宮、膀胱和直腸等盆腔臟器于正常位置,一旦脫離正常位置達一定程度,就表現(xiàn)POP。研究[10,11]發(fā)現(xiàn)盆底支持組織結(jié)構(gòu)松弛是細胞外基質(zhì)的膠原成分的改變所致,也成為了POP發(fā)生的主要原因。研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子及其調(diào)控其作用的轉(zhuǎn)化生長因子-β1能夠調(diào)節(jié)膠原代謝,TGF-β1也能夠促進纖維蛋白及膠原表達而抑制ECM分解在ECM的合成調(diào)控中起重要作用[12,13 ]。

    MMP-2(明膠酶A)主要作用底物是Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅳ型膠原、彈性蛋白、纖維粘連蛋白等。而TIMP-2是MMP-2抑制劑。MMP-2活化在細胞表面進行,主要由體內(nèi)的結(jié)締組織細胞以非活性酶原形式分泌再進行活化,先由膜型基質(zhì)降解酶(MT-MMP)發(fā)動,隨后取決于MT-MMP和TIMP-2復(fù)合體的形成,這是與其它類MMPs家族成員作用的不同之處。首先,MMP-2 酶原結(jié)合于結(jié)締組織細胞表面的MT-MMP/TIMP-2 復(fù)合體(受體)上,就構(gòu)成了一個新的MT-MMP/TIMP-2/MMP-2 酶原三元復(fù)合體[33]。復(fù)合體形成后,才可使鄰近游離MT-MMP 分子分解已固定的MMP-2酶原,再由無活性MMP-2變成中間狀態(tài)的形式,而后自發(fā)水解釋放出活性MMP-2,使得活化完成。因此,細胞內(nèi)TIMP-2濃度對MT-MMP介導(dǎo)的MMP-2活化扮演著不可低估的作用。當(dāng)TIMP-2過量時,可減少細胞內(nèi)游離MT-MMP含量,其MMP-2酶原不能得到活化;而TIMP-2 量少時,導(dǎo)致細胞內(nèi)游離的MT-MMP增加,MMP-2酶原活化得到增多。TIMP-2是與活化MMP -2以非共價形式結(jié)合,其結(jié)合以1∶1分子比例形成。機體在生理情況下,MMP -2和TIMP -2之間是維持動態(tài)平衡,使ECM沉積與降解之間平衡起重要的作用。而在某些病理狀態(tài)下MMP -2和TIMP -2代謝異常致兩者之間的動態(tài)平衡被打破,使膠原降解增加,進一步加重細胞外基質(zhì)代謝失衡。氧化應(yīng)激可能通過引起盆底支持組織中MMP -2和TIMP-2異常,導(dǎo)致其生物力學(xué)性能下降,參與POP的發(fā)生;而TGF-β1作為機體重要的MMP -2/TIMP-2的調(diào)控作用,也可能參與氧化應(yīng)激對POP的調(diào)控。

    實驗結(jié)果顯示,POP患者子宮旁韌帶組織中TGF-β1和TIMP-2蛋白水平低于對照組且有顯著差異性,POP組組織MMP-2蛋白水平高于非POP正常組,提示TGF-β1、MMP-2、TIMP-2可能參與POP的發(fā)生發(fā)展過程。

    為了進一步分析TGF-β1、MMP-2、TIMP-2在POP中是如何起調(diào)控作用,對POP組和非POP正常組組織TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白水平的表達進行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)非POP正常組組織TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達之間無明顯相關(guān)性,POP組組織TGF-β1與MMP-2蛋白的表達呈負相關(guān)而與TIMP-2蛋白表達呈正相關(guān),致使MMP-2/TIMP-2比例升高,繼而兩者動態(tài)平衡性破壞,使ECM分解增多,因此從相關(guān)性分析得出TGF-β1 對MMP-2/TIMP-2比例的影響是POP發(fā)生的關(guān)鍵。

    研究[14-16]證實氧化應(yīng)激可導(dǎo)致心、眼、腎、肺組織損傷及纖維化改變,發(fā)現(xiàn)TIMPs顯著增高,與轉(zhuǎn)化生長因子-β1有關(guān)。研究已表明氧化應(yīng)激可能參與子宮脫垂的發(fā)生,如[17]POP患者盆底支持組織中抗氧化酶產(chǎn)物表達比非POP患者的組織中降低。

    本研究證實POP患者子宮韌帶中TGF-β1降低及調(diào)控的基質(zhì)金屬蛋白酶升高,提示TGF-β1與POP發(fā)生相關(guān),并且是POP的保護因素。那么POP患者子宮旁韌帶中TGF-β1及其調(diào)控代謝相關(guān)變化是否由氧化損傷所致,目前尚無文獻報道。

    本研究說明可能機械力激活ROS,從而使TGF-β1下調(diào),使MMP-2/TIMP-2比例的發(fā)生改變,參入了POP的發(fā)生。

    參考文獻

    [1]樂杰, 婦產(chǎn)科學(xué). 第5版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2002: 409.

    [2]竇肇華,張遠強,郭順根.免疫細胞學(xué)與疾病.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2004:901-904.

    [3]Akhtar K, Broekelmann TJ, Miao M, et al. Oxidative and nitrosative modifications of tropoelastin prevent elastic fiber assembly in vitro. J Biol Chem,2010(285): 37396.

    [4]Fisher GJ, Wang ZQ, Datta SC, et al. Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light. N Engl J Med, 1997(337): 1419.

    [5]Fisher GJ, Datta S, Wang ZQ, et al. c-Jun-dependent inhibition of cutaneous procollagen transcription following ultraviolet irradiation is reversed by all-trans retinoic acid. J Clin Invest,2000(106): 663-670.

    [6]Siwik DA, Pagano PJ, Colucci WS. Oxidative stress regulates collagen synthesis and matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts. Am J Physiol Cell Physiol, 2001( 280): C53.

    [7]楊麗娟, 游育紅. 細胞受到氧化應(yīng)激后損傷的檢測方法. 醫(yī)學(xué)綜述, 2010,16 (6):924-927.

    [8]杜先華,李海燕,等. H2O2誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞氧化應(yīng)激損傷. 中國老年醫(yī)學(xué)雜志,2011,2(31):644-646.

    [9]Rivaux G, Rubod C, Dedet B, et al. Comparative analysis of pelvic ligaments: a biomechanics study. Int Urogynecol J, 2013, 24(1):135-139.

    [10]Massoval I, Kotra LP, Fridman R, et al. The matrix metalloProteinases: structures, evolution and diversification. FASEBJ, 1998, 12(12) : 1075-1095.

    [11]Iyer S, Wei S, Brew K, et al. Crystal structure of the catalytic domain of matrix metalloproteinase-1 in complex with the inhibitory domain of tissue inhibitor of metalloproteinase. J Biol Chem, 2007(282): 364-371.

    [12]沈愛群,李莉,陳信良,等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2及其組織抑制因子-2在女性盆底功能障礙中的表達及意義.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2008,17(1):45-49.

    [13]Grande JP.Mechanisms of progression of renal damage in lupus nephritis:pathogenesis of renal scarring.Lupus,1998(7):604-610.

    [14]吳蕊, 凃玲. 氧化應(yīng)激與心血管疾病. 心血管病學(xué)進展. 2007, 28(1): 110-113.

    [15]錢令嘉. 應(yīng)激與應(yīng)激醫(yī)學(xué). 疾病控制雜志, 2003, 7(5): 393-396.

    [16]李國平, 吳靈飛, 蒲澤錦. 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HepG2 肝癌細胞凋亡的研究. 中國病理生理雜志,2008, 24(1): 105-111.

    [17]孫青, 洪莉, 吳德斌,等. 盆底功能障礙疾病患者恥骨宮頸筋膜中谷胱甘肽過氧化物酶-1的表達. 武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2012, 33(2): 255-258.

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