夏群辛培勇褚金芳*(中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所國家植物基因研究中心(北京),北京000)(中國科學院大學,北京00049)
全自動在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測水稻中6種內(nèi)源性植物激素
夏群1,2辛培勇1褚金芳*1
1(中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所國家植物基因研究中心(北京),北京100101)2(中國科學院大學,北京100049)
建立了同時檢測水稻中6種內(nèi)源性植物激素脫落酸(Abscisic acid,ABA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)、水楊酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)、吲哚-3-丙酸(Indole-3-propionic acid,IPA)和吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid,IBA)的全自動在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。植物樣品經(jīng)過甲醇提取,采用C18固相萃取柱富集凈化,流動相將待測物洗脫至C18分析色譜柱進行分離,最終使用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進行檢測。方法的線性范圍為8~320μg/L,相關系數(shù)為R2≥0.99;方法的檢出限(S/N=3)范圍為0.1~0.8μg/kg;實際樣品中方法回收率范圍為71.2%~126%,RSD<13%。應用本方法快速、準確地檢測了水稻幼穗中多種內(nèi)源性植物激素的含量,并與目前植物學領域內(nèi)常用的檢測方法進行了比較。同時,本方法對水稻受傷葉片的內(nèi)源植物激素含量變化進行了定量分析,其含量隨受傷時間的變化趨勢與其生物背景的實驗結果相吻合。
植物激素;在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;定量分析;水稻
植物激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一系列天然小分子化合物,參與調(diào)控植物的株型建成、光合作用及水分營養(yǎng)利用等重要生理過程[1]。植物激素在植物體內(nèi)含量極低,通常在鮮重0.1~50μg/kg的范圍內(nèi),且植物體內(nèi)化合物種類復雜多樣,因此,植物激素的定性和定量分析一直是植物激素研究領域的難點之一[2,3]。離線固相萃取(Off-line SPE)[4,5]前處理手段結合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用是目前常用的分析檢測技術[6~8],但操作相對繁瑣、費時,且易引入誤差。隨著技術的發(fā)展,在線固相萃取(On-line SPE)越來越多地與液相色譜聯(lián)用,該技術具有操作簡便、分析速度快、重現(xiàn)性與精密度好等優(yōu)點,多應用于基質(zhì)相對簡單的樣品,如水、牛奶等[9,10],而復雜基質(zhì)中痕量植物激素的應用報道較少[11,12]。
水稻是重要的糧食作物之一,其產(chǎn)量與品質(zhì)直接關系到全球的糧食安全問題。植物激素對水稻產(chǎn)量的提高與品質(zhì)的保持起著至關重要的作用[13]。因此,建立水稻材料中高通量和高靈敏度的多種植物激素同時分析方法,對內(nèi)源植物激素的網(wǎng)絡互作和水稻育種研究具有重要意義,但目前對水稻內(nèi)源多種植物激素同時分析的方法研究較少[14]。本實驗基于在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(On-line SPE-LC-MS/MS)開發(fā)了一種可以同時檢測水稻中6種植物激素的方法。相對于傳統(tǒng)的植物激素分析方法,本方法具有分析速度快、通量高、重現(xiàn)性與精密度良好等優(yōu)點。
2.1儀器與試劑
SymbiosisTMPharma在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)(荷蘭Spark Holland公司),配柱溫箱;C2SE、C8EC-SE和C18HD在線固相萃取柱(10 mm×2 mm,7μm,19.4 mg,荷蘭Spark Holland公司);Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)。
脫落酸(Abscisic acid,ABA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)和茉莉酸(Jasmonic acid,JA)標準品(美國Sigma公司);水楊酸(Salicylic acid,SA)、吲哚-3-丙酸(Indole-3-propionic acid,IPA)和吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid,IBA)標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司);ABA穩(wěn)定同位素內(nèi)標(2H6-ABA,捷克OlChem Im公司);其它穩(wěn)定同位素內(nèi)標(2H5-JA、2H4-SA和2H2-IAA,加拿大CDN Isotopes公司)。甲醇和乙腈(色譜純,美國Fisher Scientific公司);乙酸(LC-MS級,美國Fluka公司);甲酸(分析純,美國Acros Organics公司)。實驗所用18.2 MΩ超純水由PURELAB純水儀(英國ELGA公司)制備。
2.2實驗條件
質(zhì)譜條件:電噴霧離子源負離子模式(ESI-);毛細管電壓為2.80 kV;源溫110℃;脫溶劑氣溫度400℃;脫溶劑氣流速800 L/h;錐孔氣流50 L/h;倍增器電壓650 V;碰撞氣(氬氣)0.17 L/h;掃描方式多重反應監(jiān)測(MRM)模式;優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM parameters for tandem mass spectrometry
色譜條件:Waters公司XBridgeTMBEH C18色譜柱(3.0 mm×75 mm,2.5μm);流動相A為0.2% (V/V)乙酸;流動相 B為甲醇;梯度洗脫程序:0~0.5 min,20%B;0.5~11 min,20%~95%B; 11~11.5 min,95%B;11.5~12 min,95%~20%B;12~14.5 min,20%B;流速0.2 mL/min;柱溫30℃。
在線固相萃取條件:SPE柱經(jīng)過1 mL甲醇和1 mL 1%(V/V)甲酸活化平衡,流速5mL/min;10μL樣品由0.4 mL 1%(V/V)甲酸上樣,流速0.7mL/min;淋洗液為0.9mL 1%(V/V)甲酸和0.1mL 1%(V/ V)甲酸-甲醇的混合液,流速5 mL/min;淋洗后,流動相將待測物梯度洗脫至分析柱,洗脫時間7 min,流速0.2 mL/min;洗脫的同時,新的SPE柱進行活化、上樣和淋洗。
2.3方法學考察實驗
ABA,IAA,SA,JA,IPA和IBA標準品儲備液為5 mg/L,溶劑為甲醇,于-20℃儲存。用80% (V/V)甲醇稀釋儲備液,配制工作溶液為20μg/L混合標準品,儲存于4℃。通過稀釋標準品儲備液,配制5個濃度的混合標準品進樣分析,計算標準曲線。ABA,IAA,SA和JA采用穩(wěn)定同位素稀釋法進行定量分析,IPA與IBA采用外標法進行定量分析。取低中高3個濃度的標準品溶液連續(xù)進樣5天,每天測定5次,考察方法的精密度。在水稻幼穗中加ABA,IAA,SA和JA的同位素內(nèi)標以及IPA、IBA標準品,按S/N=3和S/N=10確定方法的檢出限和定量限。在水稻基質(zhì)中,采用標準添加法,計算低中高3個濃度的方法回收率。
2.4樣品前處理和水稻培養(yǎng)與傷害
水稻植物材料在液氮條件下收集與研磨。稱取約0.2 g鮮重植物材料于7 mL離心管中,加入2 mL甲醇(含銅試劑),同時加入2H6-ABA,2H2-IAA,2H4-SA和2H5-JA各10 ng,渦旋混合,-20℃過夜提取。于4℃下,以15000 r/min離心15 min,收集上清液,氮氣吹干溶解于200μL 80%(V/V)甲醇中,經(jīng)0.2μm PTFE濾膜過濾后,由在線固相萃取系統(tǒng)分析。
水稻種子由70%乙醇和2.5%次氯酸鈉消毒后于37℃萌發(fā),將萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)管中,用Hoagland全營養(yǎng)液進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:光/暗周期(16/8 h);溫度25℃;濕度70%。傷害實驗材料為3周水稻幼苗,對水稻幼苗第三片完全展開的葉片用止血鉗夾出2個傷口,間隔4 cm,收集受害5,15,30,60,120和360 min后的葉片,考察多種植物激素含量變化。
3.1液相色譜條件優(yōu)化
分別比較了乙腈和甲醇作為色譜有機流動相時,6種目標化合物保留行為。當乙腈作為有機相時,隨著混合標準品進樣次數(shù)的增加,ABA,JA與IBA的質(zhì)譜響應穩(wěn)定,而IAA,SA與IPA的響應逐漸降低;當甲醇作為有機相時,6種植物激素都能保持穩(wěn)定的質(zhì)譜響應,并且分離度較好。本實驗選擇了甲醇作為有機流動相。在流動相中添加少量的添加劑可以增強質(zhì)譜離子源的離子化效率,實驗分別考察了10 mmol/L甲酸銨、0.05%甲酸、0.05%乙酸、0.1%乙酸和0.2%乙酸作為添加劑時的效果。添加乙酸時,IPA,IBA,SA與JA的質(zhì)譜平均響應峰面積比添加甲酸時高(圖1),因此選擇用乙酸調(diào)節(jié)pH值。盡管添加0.05%乙酸時其它5種植物激素的平均響應峰面積最高,但是IAA響應峰面積的RSD>15%,因此最終選擇了0.2%(V/V)乙酸作為水相流動相。
圖1 不同添加劑(甲酸銨、甲酸和乙酸)對6種植物激素質(zhì)譜響應峰面積的影響Fig.1 Effects of different addictives(ammonium formate,formic acid and acetic acid)in aqueous mobile phase for the response of six phytohormones
3.2在線固相萃取方法優(yōu)化
3.2.1在線固相萃取柱的選擇考察了目標化合物在3種反相填料SPE柱(C2SE,C8EC-SE和C18HD)上的保留情況。C8EC-SE和C18HD對6種酸性植物激素保留能力較強,C2SE保留能力最弱。C18HD作為在線固相萃取柱時,IAA和SA的質(zhì)譜響應峰面積比C8EC-SE更高(圖2),說明C18HD對標準品的回收率更高,最終選用C18HD柱作為在線固相萃取柱。
圖2 不同SPE柱對分析物保留能力的比較Fig.2 Comparison of different SPE sorbents for six phytohormones
3.2.2淋洗條件的優(yōu)化淋洗液為1%(V/V)甲酸(A)和1%(V/V)甲酸-甲醇(B)混合溶液,分別比較了1 mL不同比例(B/(A+B),0,10%,15%和20%)淋洗液的淋洗效果。當B所占比例為15%時,IAA和SA的響應峰面積下降明顯;當B所占比例為10%和0時,質(zhì)譜響應峰面積差別較小(圖3),說明目標化合物的損失較小,最終淋洗液中B的比例選擇10%。
圖3 不同淋洗有機相比例的比較Fig.3 Comparison of different percentage of organic solution for six phytohormones
3.2.3洗脫時間的優(yōu)化C18HD SPE柱和分析色譜柱都基于反相作用機理保留和分離化合物。IAA最先被洗脫,JA最后被洗脫。梯度洗脫時間太短(小于6 min),洗脫回收率較低;洗脫時間太長,在分析植物樣品時會轉(zhuǎn)移更多的雜質(zhì)至分析色譜柱。最終洗脫時間選擇7 min(圖4)。
圖4 洗脫時間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of elution time for six phytohormones
3.3方法學考察
方法的線性回歸方程的相關系數(shù)R2>0.99。方法的檢出限范圍為0.1~0.8μg/kg(表2),定量限范圍為0.4~2.5μg/kg(表2)。6種植物激素的回收率的為71.2%~126.0%,RSD為2.4%~12.8%(表3)。
表2 線性方程、線性范圍和方法回收率(n=6)Table 2 Linear relationships and spiked recoveries(n=6)
表3 方法的日內(nèi)精密度(RSD,%,n=5)、日間精密度(RSD,%,n=5)、檢出限和定量限Table 3 Intraday precision(n=5),interday precisions(n=5),LODs and LOQs
3.4方法的驗證與應用
目前植物學領域普遍使用的植物激素定量分析數(shù)據(jù)是由樣品經(jīng)離線SPE前處理后,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析得到的[8,15]。分別用離線SPE分析方法[8]和本研究建立的在線SPE方法分析水稻幼穗中內(nèi)源性植物激素的含量,結果見表4。兩種方法定量分析結果相近,該結果驗證了本方法的準確性。在線SPE-LC-MS/MS方法可檢測到的目標化合物的色譜圖如圖5所示,IPA和IBA由于含量低,在樣品中未檢出。
表4 在線固相萃取方法和離線方法分析水稻幼穗6種內(nèi)源性植物激素(n=3)Table 4 Quantitative results of six phytohormones concentrations in young panicles of rice with on-line SPE-LC-MS/MSand off-line SPE-LC-MS/MS(n=3)
圖5 在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析水稻幼穗中植物激素色譜圖Fig.5 Chromatograms of phytohormones in young panicles of rice with on-line SPE-LC-MS/MS
為進一步驗證方法的可靠性,考察了水稻幼苗葉片受傷后內(nèi)源性植物激素含量的變化,結果見圖6。IAA的含量變化較小,在(3.9±0.9)μg/kg和(8.3±0.8)μg/kg之間(圖6A),沒有明顯的證據(jù)表明IAA參與植物的傷害反應。ABA是植物應對干旱、鹽脅迫等環(huán)境壓力的激素[16]。從圖6B可見,內(nèi)源的ABA含量在30 min后明顯上升,很可能是因為植物葉片失水后,ABA作為信號分子會使保衛(wèi)細胞的氣孔縮小,減少植物葉片的失水。在圖6C中,SA的含量變化較小,在(337.5±81.6)μg/kg和(528.5± 69.0)μg/kg之間,對外界傷害的反應不明顯,符合SA調(diào)控抗性的機理研究,即SA介導的抗性主要是針對細菌、病毒、真菌和卵菌等一系列病原菌的入侵[17]。生物學研究表明,JA是植物應對傷害反應重要的信號分子,植物受傷后JA的含量會顯著上升[8]。當葉片沒有受到傷害時,JA的含量在定量限以下,含量低于0.4μg/kg;在受傷后60 min時,受傷葉片的JA含量達到最高,為(91.9±2.3)μg/kg;之后JA的含量開始下降,360 min時為(30.4±5.9)μg/kg。JA的濃度先升高后降低,再升高最后又降低的趨勢,在圖6D中表現(xiàn)為雙峰現(xiàn)象,這一變化趨勢與文獻[5]完全符合。
建立了在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術定量檢測水稻中6種內(nèi)源性植物激素的方法。在線固相萃取方法簡化了植物激素分析的樣品前處理流程,使得分析速度與操作的簡便性大大提高。本方法與植物研究領域內(nèi)公認方法所得到的定量分析結果基本一致,并通過分析受傷葉片植物激素含量的變化,進一步驗證了方法的準確性和可靠性。本方法能同時分析多種內(nèi)源性植物激素,將非常有助于水稻以及其它植物材料中內(nèi)源性植物激素的互作研究。
圖6 水稻幼苗葉片受傷后內(nèi)源植物激素IAA(A)、ABA(B)、SA(C)和JA(D)濃度變化(n=3)Fig.6 Concentration change of IAA,ABA,SA and JA in wounded leaves of rice seedlings(n=3)
References
1Davies P J.Plant Hormones:Biosynthesis,Signal Transduction,Action.Springer,2010
2WU Qian,WANG Lu,WU Da-Peng,DUAN Chun-Feng,GUAN Ya-Feng.Chinese Journal of Chromatography,2014,32(4):319-329吳倩,王璐,吳大朋,段春鳳,關亞風.色譜,2014,32(4):319-329
3CHEN Xia-Di,LU Qiao-Mei,CHENG Jin-Tian,ZHANG Lan.Chinese J.Anal.Chem.,2015,43(1):127-131陳嚇俤,盧巧梅,程錦添,張?zhí)m.分析化學,2015,43(1):127-131
4ZHONG Dong-Lian,DING Ming,TANG Fu-Bin,MO Run-Hong,TENG Ying.Chinese J.Anal.Chem.,2013,41(11): 1739-1743鐘冬蓮,丁明,湯富彬,莫潤宏,滕瑩.分析化學,2013,41(11):1739-1743
5CAO Zhao-Yun,MA You-Ning,CHEN Ming-Xue,MOU Ren-Xiang,HU Xiu-Fang.J.Instrum.Anal.,2011,30(12): 1419-1424曹趙云,馬有寧,陳銘學,牟仁祥,胡秀芳.分析測試學報,2011,30(12):1419-1424
6Pan X Q,Welti R,Wang X M.Nat.Protocols,2010,5(6):986-992
7Pan X Q,Welti R,Wang X M.Phytochemistry,2008,69(8):1773-1781
8Fu JH,Chu JF,Sun X H,Wang JD,Yan C Y.Anal.Sci.,2012,28(11):1081-1087
9GU Xin,WU Jian-Ping,ZHANG Xin,LI Dan-Ni,YAN Feng,ZHOU Yue-Rong.Chinese J.Anal.Chem.,2014,42(12):1759-1766顧欣,吳劍平,張鑫,李丹妮,嚴鳳,周悅榕.分析化學,2014,42(12):1759-1766
10GUO Jian,YANG Xin-Lei,YE Ming-Li.Chinese J.Anal.Chem.,2011,39(8):1256-1260郭堅,楊新磊,葉明立.分析化學,2011,39(8):1256-1260
11JIA Peng-Yu,ZENGMing-Fei,F(xiàn)ENGNai-Jie,ZHENG Dian-Feng,SUN Fu-Dong,SUNRui,LIZhao-Yang.Chinese J.A-nal.Chem.,2014,42(12):1743-1749賈鵬宇,曾明飛,馮乃杰,鄭殿峰,孫福東,孫蕊,李朝陽.分析化學,2014,42(12):1743-1749
12Zhong Q S,Qiu X X,Lin C Y,Shen L L,Huo Y,Zhan S,Yao JT,Huang TH,Kawano S,Hashi Y,Xiao L T,Zhou T.J.Chromatogr.A,2014,1359:131-139
13A Jia-La-Tie,XUE Da-Wei,LIShi-Gui,QIAN Qian,GUO Long-Biao.China Rice,2006,5:1-3阿加拉鐵,薛大偉,李仕貴,錢前,郭龍彪.中國稻米,2006,5:1-3
14Cai B D,Yin J,Hao Y H,Li Y N,Yuan B F,F(xiàn)eng Y Q.J.Chromatogr.A,2015,1406:78-86
15Wang B,Chu JF,Yu T Y,Xu Q,Sun X H,Yuan J,Xiong G S,Wang G D,Wang Y H,Li JY.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2015,112(15):4821-4826
16Zhang JH,JiaW S,Yang JC,Ismail A M.Field Crops Res.,2006,97(1):111-119
17Boatwright JL,Pajerowska-Mukhtar K.Mol.Plant Pathol.,2013,14(6):623-634
Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.91417314),and the Technique Innovation of Instrumental Function of CASProgram and CASKey Technology Talent Program
An Automated On-line Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometric Method for Six Endogenous Phytohormones Analysis in Rice
XIA Qun1,2,XIN Pei-Yong1,CHU Jin-Fang*1
1(National Centre for Plant Gene Research(Beijing),Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)2(University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)
An automated on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry (on-line SPE-LC-MS/MS)method for the simultaneous quantification of six endogenous phytohormones including abscisic acid(ABA),indole-3-acetic acid(IAA),salicylic acid(SA),jasmonic acid(JA),indole-3-propionic acid(IPA)and indole-3-butyric acid(IBA)in rice tissues was described.Plant samples were extracted withmethanol and on-line SPE procedurewas performed with C18SPE cartridges.Analyteswere eluted to C18analytical column withmobile phase and further analyzed by LC-MS/MS.The performance of the method was fully validated.Linearity showed good correlation(R2≥0.99).Limits of detections(S/N=3) were in the range of 0.1-0.8μg/kg.Recoveries varied between 71.2%and 126%.Themethod was rapid and sensitive to determinemultiple phytohormones in rice young panicles and the resultswere cross-validated with the off-line SPE-LC-MS/MS phytohormone analyticalmethod.Finally,themethod was applied tomonitor the changes of ABA,IAA,SA and JA in wounded rice leaves.The trendswere in accord with plant physiological processes.
Phytohormones;On-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Quantitative analysis;Rice
29 September 2015;accepted 30 December 2015)
10.11895/j.issn.0253-3820.150769
2015-09-29收稿;2015-12-30接受
本文系國家自然科學基金(No.91417314)、中科院儀器設備功能開發(fā)技術創(chuàng)新項目和中科院關鍵技術人才項目資助
*E-mail:jfchu@genetics.a(chǎn)c.cn