小兒肺炎患者尿液的代謝組學(xué)初步研究

李靜劉曉蕾趙旭李巍戴雨霖*越皓*(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春00)　(長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長春07)(吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，長春00)　(深圳市第三人民醫(yī)院，深圳58)

小兒肺炎患者尿液的代謝組學(xué)初步研究

李靜1劉曉蕾2趙旭3李巍4戴雨霖*2越皓*2
1(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春130021)2(長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長春130117)3(吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，長春130021)4(深圳市第三人民醫(yī)院，深圳518112)

利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對小兒肺炎(Childhood pneumonia，CP)患者和健康兒童(Healthy control)的尿液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小兒肺炎患者尿液中的潛在標(biāo)記物，為其發(fā)病機(jī)制及早期篩查提供科學(xué)依據(jù)。篩選10例小兒肺炎患者(age 47．72±2．35 months)及10例健康兒童(age 46．65±1．97 months)尿液樣本，采用快速高分辨液相色譜四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(RRLC-Q TOF/MS)技術(shù)對其尿液代謝物進(jìn)行分析，通過主成分分析方法(PCA)對兩組代謝物進(jìn)行分類，并發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)記物。RRLC-Q TOF/MS檢測表明，CP組和Healthy Control組尿液代謝物圖譜能得到很好的區(qū)分，并鑒定了5種生物標(biāo)記物，提示嘌呤代謝、氨基酸代謝可能在小兒肺炎發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

小兒肺炎;快速高分辨液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用;尿酸;代謝組學(xué)

1　引言

小兒肺炎(Childhood pneumonia)是臨床常見疾病，春冬季節(jié)更是高發(fā)，是我國嬰幼兒死亡的三大因素之一，近年來發(fā)病率有明顯上升趨勢［1］。一般小兒肺炎是通過臨床癥狀熱咳喘，肺部體征干濕性啰音，并結(jié)合胸片X線的檢查來診斷［2］，但人為因素常影響準(zhǔn)確診斷。目前，臨床上采用血常規(guī)、降鈣素原［3］、C反應(yīng)蛋白［4］診斷小兒肺炎，用于鑒別細(xì)菌性肺炎、支原體肺炎和病毒性肺炎及早期診斷，但是，對于兒童采血困難，血培養(yǎng)結(jié)果需要較長時間，以及臨床有一部分病人患病初期在以上檢測指標(biāo)為陰性結(jié)果，以上幾種因素制約了此類方法的應(yīng)用。本研究建立一種創(chuàng)傷性小的小兒肺炎的早期診斷方法。

代謝組學(xué)(Metabonomics)［5，6］是研究生物體系受刺激或擾動后，其代謝產(chǎn)物-內(nèi)源性代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)，其研究對象主要是生物體液，如尿液、血液、唾液等［7，8］。代謝成分變化可以通過包括核磁共振、納米復(fù)合材料、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)［9］進(jìn)行分析及應(yīng)用，并通過計量學(xué)的手段對這些信息進(jìn)行提取，認(rèn)識人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病或藥物作用下的變化規(guī)律。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上［10］，采用快速高分辨液相色譜與四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-Q TOF/MS)檢測小兒肺炎患者尿液中代謝物的變化，通過主成分分析方法尋找潛在生物標(biāo)記物，結(jié)合血液生化指標(biāo)研究小兒肺炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為早期篩查和臨床治療提供依據(jù)。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

Agilent 1200快速分離液相色譜系統(tǒng)、Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀，配有電噴霧ESI離子源(美國Agilent Technologies公司);5804 R型高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

甲酸，乙腈(HPLC級，美國TEDIA試劑公司)。實驗用超純水通過MILLI-Q系統(tǒng)獲得。

2．2樣本來源

小兒肺炎患者尿樣和健康兒童尿樣由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。研究經(jīng)過長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者都簽署了知情同意書。患者通過血常規(guī)及血液C反應(yīng)蛋白檢查確診為細(xì)菌型小兒肺炎，清晨空腹采取尿樣。健康對照組在清晨空腹采取尿樣;兩組樣品3000 r/min離心10 min，除去雜質(zhì)，于-80℃儲存?zhèn)溆?。主要指?biāo)篩選10例小兒肺炎患者(47．72±2．35月齡)及10例健康兒童(46．65±1．97月齡)尿液樣品進(jìn)行分析。

2．3樣品處理

采用離心沉降后四倍稀釋法［11］，將樣品室溫下溶解，在4℃以12000 r/min離心5 min，取50μL上清液，用水稀釋至200μL，渦旋，0．45μm濾膜過濾，待測。

2．4LC-MS的代謝組學(xué)分析條件

色譜條件:采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2．1 mm，3．5μm，Agilent公司);柱溫: 35℃;流動相A:超純水(0．1%甲酸);流動相B:乙腈;梯度洗脫條件:0～5min，5%～20%B;5～10 min，20%～35%B;10～15 min，35%～98%B;15～17 min，98%～100%B。流速:0．3 mL/min。

質(zhì)譜條件:分別采用電噴霧正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)對樣品進(jìn)行檢測;質(zhì)量掃描范圍m/z100～1100;干燥氣流量(N2)為9 L/min;干燥氣溫度為350℃;霧化電壓為40 psi;毛細(xì)管電壓為3．5 kV;碎裂電壓為150 V;錐孔電壓為65 V。

2．5數(shù)據(jù)處理

樣品用LC-MS進(jìn)行檢測，得到樣品的總離子流圖(Total ion current，TIC)，經(jīng)過峰校準(zhǔn)、背景扣除、面積歸一化等處理，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物的保留時間和質(zhì)荷比信息的CEF格式文件。將文件導(dǎo)入Mass profiler professional(MPP，Agilent公司)軟件，進(jìn)行濾噪和歸一化，并進(jìn)行主成分分析，將多維的數(shù)據(jù)壓縮成幾個主要的主成分(PCs)來描述數(shù)據(jù)內(nèi)部的特征。通過樣品的得分圖(Score plot)和火山圖(Volcano plot)發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)記物的化合物，最后找出潛在的生物標(biāo)記物并進(jìn)行鑒定。

3　結(jié)果與討論

3．1小兒肺炎患者和健康兒童尿液LC-MS總離子流圖

尿液樣品經(jīng)RRLC-Q TOF/MS分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測分析。分別隨機(jī)選取小兒肺炎患者和健康兒童的尿液各1個，其總離子流圖見圖1。從圖1可見，在正負(fù)離子模式下，小兒肺炎患者尿液的色譜峰個數(shù)明顯多于健康兒童尿液，健康組的基線較平穩(wěn)，色譜峰的峰高和峰面積都相對較小，而小兒肺炎組則出現(xiàn)較多峰，推測二者尿液代謝產(chǎn)物中存在著一些濃度差異的物質(zhì)，這些色譜峰是否與小兒肺炎的發(fā)病有關(guān)，需要進(jìn)一步統(tǒng)計學(xué)的分析和驗證。

3．2數(shù)據(jù)分析結(jié)果

3．2．1主成分分析(PCA)采用主成分分析統(tǒng)計小兒肺炎患者和健康兒童尿樣代謝物變化趨勢。如圖2所示，正離子模式和負(fù)離子模式下的PCA得分圖能夠?qū)⒍吆芎玫貐^(qū)分。圖中每個點代表一個樣品，每個樣品的位置由其成分決定，處于相同生理病理狀態(tài)的樣本通常具有相似的代謝物組成，因此在得分圖上也處于相似的位置。相反，彼此之間距離越遠(yuǎn)，表示其生理病理的狀態(tài)相差越大。本實驗研究細(xì)菌型感染的小兒肺炎，得分圖中代表患病組的點較為分散，可能是患者治愈期不同導(dǎo)致。即距離健康組十分近的患病組的幾個點，可能是即將治愈的患者。

3．2．2差量變異研究基于小兒肺炎患者和健康兒童的PCA分析結(jié)果，確定兩組之間存在代謝差異。圖3為兩組的火山圖，每個點代表樣品中代謝物相關(guān)信息，距離原點越遠(yuǎn)的點對兩組間區(qū)分度貢獻(xiàn)越大，即是兩組中差異較大的代謝物，可作為潛在生物標(biāo)記物。根據(jù)統(tǒng)計軟件給出的獨立t檢驗的p值，9種化合物被認(rèn)為是小兒肺炎人群發(fā)病的潛在標(biāo)記物。

3．2．3潛在標(biāo)志物鑒定潛在標(biāo)記物的鑒定是根據(jù)它們的精確分子量和串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果以及與數(shù)據(jù)庫或標(biāo)準(zhǔn)品的比較進(jìn)行的。實驗以負(fù)離子模式下的離子m/z 167．0184為例，說明生物標(biāo)記物的鑒定過程。負(fù)離子模式下，此化合物的提取離子流圖和在保留時間1．272 min時的質(zhì)譜圖如圖4A和4B所示。將計算結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中化合物進(jìn)行比對，初步鑒定此化合物為尿酸。如圖4C所示，與標(biāo)準(zhǔn)品的串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果比對，兩者完全一致，進(jìn)一步確認(rèn)了此結(jié)論。根據(jù)以上信息，這個生物標(biāo)記物鑒定為尿酸。其余化合物的鑒定方法類似，但是一些化合物未能完全鑒定。

表2列出了潛在生物標(biāo)記物的鑒定結(jié)果。分析軟件給出了健康對照組和CP組的標(biāo)記物變化趨勢。

圖1　小兒肺炎患者和健康兒童的LC-MS總離子流圖Fig．1　LC-MS total ion current chromatograms of urine samples deriving from childhood pneumonia(CP) patients and healthy persons負(fù)離子模式下:A健康兒童尿樣，B小兒肺炎患者尿樣;正離子模式下:C健康兒童尿樣;D小兒肺炎患者尿樣。ESI-:(A)healthy persons，(B)CP patients;ESI+:(C)healthy persons，(D)CP patients．

圖2　區(qū)分小兒肺炎組和對照組的PCA得分圖(正離子模式)。(■對照組;▲小兒肺炎組)Fig．2　PCA scores plot of urine sample．ESI+(■healthy control，▲CP patient)

圖3　區(qū)分小兒肺炎組和對照組的火山圖Fig．3　The volcano plot from PCA for common components(ESI+)

3．3小兒肺炎潛在生物標(biāo)志物分析

采用LC-MS方法對小兒肺炎患者和健康兒童群尿液進(jìn)行檢測，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算9種生物標(biāo)志物及變化趨勢，并鑒定出尿酸和甜菜堿等5種化合物可能與小兒肺炎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

在人體內(nèi)，嘌呤是核酸的代謝產(chǎn)物，而尿酸(Uric acid)是嘌呤的代謝最終產(chǎn)物，尿酸是細(xì)胞分解的最終產(chǎn)物之一，尿酸測定在肺炎并抗利尿激素分泌異常綜合征中有重要意義［11］，而且代謝紊亂也可導(dǎo)致尿酸增高。近年的研究表明，尿酸含量變化提示肺炎發(fā)展過程，而血尿酸濃度與小兒肺炎程度密切相關(guān)，是炎癥類疾病的危險因素［12］。顏萍等［13］報道，小兒肺炎患者血清尿酸的變化與肺炎導(dǎo)致的心力衰竭關(guān)系呈正比。Ogihara等［14］報道，在幼兒階段，尿酸及其氧化產(chǎn)物可以作為體內(nèi)自由基生成的標(biāo)志。

甜菜堿(Betaine，BET)又名三甲胺乙內(nèi)酯。可提供3個不穩(wěn)定的甲基，為多種物質(zhì)合成提供原料，如肉堿、肌酸、嘌呤及蛋氨酸等。同時，經(jīng)去甲基作用生成甘氨酸，進(jìn)入氨基酸代謝池。由于甜菜堿可提供甲基和氨基酸，它可參與機(jī)體氨基酸代謝、脂肪代謝及DNA甲基化等過程［15］。尿液中甜菜堿的濃度較低時，可引發(fā)脂類代謝紊亂及相關(guān)炎癥，甘露醇和氨基馬尿酸在尿液中的含量變化也是反映機(jī)體炎癥的代謝標(biāo)志物［16］，以上檢測到的代謝產(chǎn)物可能是小兒肺炎發(fā)病的獨立危險因子。

表2　小兒肺炎組與健康組的差異生物標(biāo)記物Table 2　List of identified differentialmetabolites between CP patients and controls

圖4　潛在標(biāo)記物尿酸的鑒定Fig．4　Identification of potentialmaker-uric acid (A)負(fù)離子模式下尿酸的提取離子色譜圖;(B)相應(yīng)的質(zhì)譜圖;(C)串聯(lián)質(zhì)譜圖，碰撞能量為25 eV。(A)Extract ion chromatography(EIC)，(B)Mass spectra of the ion at m/z167．0184，(C)MS/MSof themaker(25 eV)．

小兒肺炎患病率高，是重大呼吸道疾病的病理生理基礎(chǔ)。小兒肺炎早期無痛苦篩查和診斷尤為重要。本實驗篩選出小兒肺炎患者與健康兒童各10名，觀察其尿液的代謝組學(xué)變化。經(jīng)多元統(tǒng)計分析，健康對照組與小兒肺炎組得到很好的區(qū)分。發(fā)現(xiàn)并鑒定了5種潛在生物標(biāo)記物，其變化反映了核酸代謝及氨基酸代謝在小兒肺炎早期發(fā)生發(fā)展中的作用，對于臨床上早期診斷、預(yù)防及治療小兒肺炎有參考意義。

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A Metabonom ics Study of Childhood Pneumonia by Rapid Resolution Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry

LI Jing1，LIU Xiao-Lei2，ZHAO Xu3，LIWei4，DAIYu-Lin*2，YUE Hao*2
1(Hospital Affiliated to Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021，China)2(JiLin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China)3(The First Hosital of Jilin University，Changchun 130021，China)4(Shenzhen Third People's Hospital，Shenzhen 518112，China)

In this study，the rapid resolution liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry(RRLC-QTOF/MS)was used to profile the metabolites of urine samples from Childhood Pneumonia(CP)patients and healthy controls and find the potential biomarkers which can support evidence to early diagnose and cure the disease．Choose 10 CP patients(age 47．72±2．35 months)and 10 healthy controls(age 46．65±1．97 months)．The urine samples were analyzed by RRLC-QTOF/MS and then the resulting data matrices were analyzed by principal components analysis(PCA)to find the potential biomarkers．Urine samples of CP patientswere successfully distinguished from those of healthy controls．A total of two significantly changed metabolites have been found and identified as potential biomarkers．It is suggested that the disorder of purinemetabolism and amino acidmetabolism may play an important role in themechanism of CP．

Childhood Pneumonia;Rapid resolution liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry;Uric acid;Metabonomics

1 November 2015;accepted 23 November 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150872

2015-11-01收稿;2015-11-23接受

本文系公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(No．20130311106)資助

*E-mail:cmw-duncan@163．com;yuehao@sohu．com