桑色素分子印跡傳感器的制備與應(yīng)用

劉蓉龍立平雷存喜吳朝陽劉煜李思佳(湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，益陽43000)(湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，長沙4008)

桑色素分子印跡傳感器的制備與應(yīng)用

劉蓉1，2龍立平*1雷存喜1吳朝陽2劉煜1李思佳1
1(湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，益陽413000)2(湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，長沙410082)

以鄰氨基酚(o-AP)為功能單體，桑色素為模板分子，基于分子間的相互作用力，在金電極表面電聚合制備具有特異性識別孔穴的桑色素分子印跡傳感器膜。采用循環(huán)伏安法(CV)、差分脈沖伏安法(DPV)等研究了分子印跡膜的性能和分子印跡效應(yīng)。探索了聚合膜配比及聚合掃描圈數(shù)對傳感器性能的影響，優(yōu)化了洗脫時間和印跡時間。比較了此傳感器對其結(jié)構(gòu)相似物的選擇性響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其對桑色素檢測具有良好的選擇性。在最佳實驗條件下，此傳感器對桑色素濃度定量測定范圍為0．05～1．70μmol/L，線性方程為I(μA)= 1．0800lg c(mol/L)+9．3599，R=0．9934，檢出限為0．01μmol/L。用此傳感器測定黑茶樣品中桑色素的含量，加標回收率為104．0%～108．0%。

分子印跡;桑色素;電化學(xué)傳感器;電聚合

1　引言

安化黑茶［1］產(chǎn)于湖南省益陽市安化縣，含有豐富的黃酮類物質(zhì)——桑色素。桑色素不僅具有抗癌、抗炎和抗氧化等藥理作用［2］，還是一種應(yīng)用廣泛的顯色劑［3，4］。測定黑茶中桑色素的含量具有重要的實際意義。

目前，測定桑色素的方法并不多，賈小燕等［5］用反相高效液相色譜同時測定復(fù)方魚腥草片中的桑色素與槲皮素，楊莉等［6］用熒光法同時測定絞股藍中桑色素的含量。但是這些方法使用的儀器價格較高。電化學(xué)分析具有快速、簡便、靈敏的特點，而被廣泛應(yīng)用。張君才等［7］建立了通過流動注射雙安培法直接檢測桑色素的電化學(xué)新方法，黃菲等［8］用L-半胱氨酸自組裝膜修金電極對桑色素的電化學(xué)行為進行了初步研究。Liu等［9］用石墨烯修玻碳電極測定桑色素含量。近年來，具有特異選擇性的分子印跡膜的應(yīng)用越來越廣泛［10，11］，Behzad等［12］采用多壁碳納米管電極修分子印跡膜測定了黃酮類物質(zhì)蘆丁的含量。Sun等［13］通過氧化石墨烯修分子印跡膜測定了黃酮類物質(zhì)槲皮素。本研究組［14，15］利用分子印跡傳感器測定了氯丙嗪和菊酯。目前，利用鄰氨基酚分子印跡膜測定桑色素尚未見文獻報道。

本研究以鄰氨基酚為功能單體，桑色素為模板分子，在金電極表面電聚合制備具有特異性識別孔穴的桑色素分子印跡膜。采用循環(huán)伏安法，差分脈沖伏安法等研究分子印跡膜的性能，分子印跡效應(yīng)。優(yōu)化制備分子印跡膜的各種條件，繪制測定桑色素分子傳感器的標準曲線圖，考察與其相似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的干擾情況。結(jié)果表明，制備的傳感器具有較好的選擇性與靈敏性。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司);三電極系統(tǒng)(分子印跡膜電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為對電極);pHS-3E型精密pH計(上海日島科學(xué)儀器有限公司);FA2004型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器和SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器(金壇市節(jié)能分析儀器廠)。

桑色素(98%)、槲皮素(98%)、蘆丁(95%)均購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;鄰氨基酚(分析純，湖南匯虹試劑有限公司);無水乙醇、K3Fe(CN)6、K4Fe(CN)6、KCl、HClO4和HNO3均為分析純試劑，且不再提純;實驗用水為二次蒸餾水。黑茶(800 g茯磚，湖南益陽茶廠有限公司)。

2．2金電極的預(yù)處理

將金電極(Gold electrode，GE)依次用1．0，0．3和0．05μm氧化鋁粉拋光，并依次于HNO3、無水乙醇、純水中泡洗5 min，取出后超聲洗滌5 min。在0．5mol/L H2SO4中于-0．2～1．5 V進行循環(huán)伏安(CV)處理，直到得到穩(wěn)定的伏安響應(yīng)曲線。

2．3分子印跡電聚合膜電極的制備

將預(yù)處理好的金電極置于含0．1 mmol/L桑色素和1．33 mmol/L鄰氨基酚(o-AP)電聚合液(pH 5．5)中，在掃描速度為50 mV/s，掃描范圍-0．1～0．8 V條件下，用循環(huán)伏安法掃描30圈，得到含桑色素模板分子的不導(dǎo)電聚合膜電極，再在無水乙醇中浸泡14 min，完全除去在聚合膜中的桑色素分子，得到了桑色素印跡的聚鄰氨基酚印跡聚合物傳感器。

2．4實驗方法

循環(huán)伏安法(CV)的電壓測量范圍為-0．1～0．5 V，速率為0．05 V/s;差分脈沖伏安法(DPV)的電壓檢測范圍為-0．1～0．5 V，電位增量0．004 V，振幅0．05 V，脈沖周期0．5 s，脈沖寬度0．2 s，采樣寬度0．0167 s，靜置時間2 s。本實驗均以0．5 mol/L KCl為電解質(zhì)在5．0 mmol/L溶液中進行電化學(xué)表征。

3　結(jié)果與討論

3．1電聚合分子印跡膜

圖1為電聚合分子印跡電聚合膜電極的制備過程的CV圖。從圖1可知，氧化峰的峰電流(Ip)強度隨著掃描圈數(shù)的增加而逐漸減少，表明功能單體(鄰氨基酚)和模板分子(桑色素)在金電極表面上的電化學(xué)聚合過程是單向不可逆的，且電聚合膜不具有導(dǎo)電性。當掃描30圈時，Ip幾乎為零，金電極表面被電聚合膜覆蓋，阻斷了電子的傳輸，從而得到了以桑色素為模板分子的非導(dǎo)電電聚合膜。

圖1　電聚合分子印跡膜的CV圖Fig．1　Cyclic voltammogram of molecular imprinted membrane based on electropolymerization

圖2　不同電極的循環(huán)伏安圖Fig．2　Cyclic voltammograms of different electrodes (a)GE，(b)MIP/GE，(c)移去模板分子的 MIP/GE，(d)重新印跡桑色素的MIP/GE。(a)GE，(b)MIP/GE，(c)MIP/GE after template removal，(d)MIP/GE after rebindingmorin．

3．2分子印跡膜的表征

3．2．1循環(huán)伏安法圖2為循環(huán)伏安法表征桑色素分子印跡膜的CV圖，裸金電極(曲線a)表面在電聚合溶液中形成了非導(dǎo)電分子印跡聚合膜(曲線b)后，使探針的無法進入到金電極的表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，Ip快速降低，幾乎為零;當非導(dǎo)電分子印跡電聚合膜浸入無水乙醇中洗脫14min后，形成了帶有特異性識別孔穴的電聚合膜(曲線c)，可以通過孔穴進入到金電極表面，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，Ip急劇增加;當帶有孔穴的印跡電聚合膜再次對1．0μmol/L桑色素進行特異性識別16 min后，聚合膜上部分孔穴被桑色素占據(jù)，供探針離子進入金電極表面的通道再次被堵塞，形成了非導(dǎo)電印跡聚合膜(曲線d)，Ip再次明顯降低。

3．2．2差分脈沖伏安法采用了DPV法對分子印跡電聚合膜電極進行表征(圖3)。在K3Fe(CN)6、K4Fe(CN)6表征溶液中，探針離子直接與裸金電極表面發(fā)生了電化學(xué)氧化還原反應(yīng)，Ip為-54．97μA(曲線a);在電聚合液中鍍膜后，裸金電極表面形成了一層致密的非導(dǎo)電電聚合膜，阻礙了探針離子進入裸金電極，無法發(fā)生氧化還原反應(yīng)，峰電流急劇降低，Ip減小至-2．00μA(曲線b);而用無水乙醇洗脫后的電聚合膜，形成了帶有特異性孔穴的分子電聚合膜，探針離子可以通過孔穴進入裸金電極，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，Ip逐漸增大至-40．10μA(曲線c)，但是Ip明顯小于裸金電極(曲線a)的Ip，很明顯，電極表面仍留存有鄰氨基酚形成的非導(dǎo)電聚合膜;當帶有特異性孔穴的電聚合膜再次吸附模板分子后，電聚合膜上的孔穴完全被模板分子(桑色素)占據(jù)，探針離子無法與裸金電極反應(yīng)，Ip又減小至-9．35μA(曲線d)。帶有特異性孔穴后的電聚合膜(曲線c)與裸金電極(曲線a)的Ip存在明顯差別，說明帶有孔穴的電聚合膜中只有孔穴是探針離子進入裸金電極通道，而電聚合膜是幾乎不導(dǎo)電的致密膜。在電聚合液中鍍膜后形成的非導(dǎo)電電聚合膜(曲線b)和吸附后的分子印跡膜(曲線d)的Ip相差不大，進一步表明電聚合膜的非導(dǎo)電性與致密性。

圖3　裸金電極和不同修電極的差分脈沖伏安圖(曲線a～d同圖2)Fig．3　DPV ofbare gold electrode andmodified electrode (Curves a－d are the same as in Fig．2)

3．3實驗條件的優(yōu)化

3．3．1鄰氨基酚和桑色素摩爾比的優(yōu)化配制鄰氨基酚和桑色素摩爾比分別為16．7∶1，15．0∶1，14．1∶1，13．3∶1，12．5∶1，11．7∶1和10．0∶1的電聚合液;調(diào)節(jié)其pH≈5．5，分別在金電極上用循環(huán)伏安法電聚合(條件見2．3節(jié));得到非導(dǎo)電電聚合膜后，用無水乙醇洗脫模板分子14 min，再用差分脈沖伏安法進行測定，得到洗脫后的峰電流;用相同濃度的桑色素溶液浸泡吸附，得到分子印跡膜，再次用差分脈沖伏安法測定，得到印跡后的Ip。以摩爾比為橫坐標，兩次測定的Ip之差為縱坐標作圖，由圖4可知，Ip越大，說明印跡膜上能夠識別印跡的桑色素分子越多，因此，鄰氨基酚和桑色素的最佳摩爾比為13．3∶1。

圖4　不同比例的鄰氨基酚與桑色素對峰電流差值的影響Fig．4　Effect of different concentration ratio between o-aminophenol and morin to peak current

3．3．2掃描圈數(shù)的優(yōu)化鄰氨基酚與桑色素電聚合液在金電極表面形成的非導(dǎo)電電聚合膜厚度直接影響分子印跡膜的印跡性能和效率。若電聚合膜太薄，形成的孔穴能夠識別的印跡分子的活性位點較少，使帶有特異性孔穴的電聚合膜印跡效率過低;聚合膜太厚，則會影響電子的傳遞和鍍膜后模板分子的洗脫，因此有必要對掃描圈數(shù)進行優(yōu)化。

將預(yù)處理好的金電極置于鄰氨基酚與桑色素的摩爾比為13．3∶1的鄰氨基酚電聚合液中(pH 5．5)，在掃描速率為50mV/s，掃描范圍-0．1～0．8 V的條件下，分別掃描25，30，35，40和45圈。用無水乙醇分別洗脫14 min后，用差分脈沖伏安法測定Ip;用相同濃度的桑色素溶液浸泡吸附，再次測定，得到穩(wěn)定的Ip。以掃描圈數(shù)為橫坐標，以兩次測得的Ip為縱坐標作圖(圖5)。掃描25圈時，印跡桑色素后峰電流較大，導(dǎo)致膜過薄，印跡上去的模板分子太少，影響了印跡效率;掃描圈數(shù)由25圈增加到30圈，洗脫模板分子后的Ip減小，但是印跡效率卻明顯增大，形成了比較穩(wěn)定的帶特異性識別孔穴的電聚合膜;掃描35～45圈，洗脫后的電流太低，模板分子難以被洗脫，電聚合膜過厚，直接影響到了模板分子的洗脫，影響印跡效率。因此，最佳掃描圈數(shù)為30圈。

圖5　不同掃描圈數(shù)對峰電流的影響Fig．5　Influence of differentscanning cycles on peak current (a)移去模板分子的MIP/GE，(b)重新印跡桑色素的MIP/ GE。(a)MIP/GE after template removal，(b)MIP/GE after rebindingmorin．

3．3．3洗脫時間的優(yōu)化將制得的電聚合膜在無水乙醇中浸泡以洗脫模板分子，洗脫時間在2～16 min范圍內(nèi)(間隔2 min)，再用DPV測定Ip。由圖6可知，洗脫時間在2～14 min內(nèi)，隨著洗脫時間的延長，Ip逐漸增大;繼續(xù)洗脫到 14～16 min后，Ip不再增加。因此，在14 min已經(jīng)洗脫完全，故最佳洗脫時間選取14 min。

圖6　洗脫時間對峰電流的影響(插圖為洗脫時間及相對應(yīng)的電流圖)Fig．6　The effect of elution time on peak current(Insert is the plot of peak current vs elution time)洗脫時間a～h:2，4，6，8，10，12，14，16 min。Elution time a－h(huán):2，4，6，8，10，12，14，16 min．

3．3．4印跡的最佳pH值的優(yōu)化將除去模板分子的聚合膜，分別放在不同pH值(3．5，4．5，5．0，5．5，6．0，6．5和7．5)的1．0μmol/L桑色素下印跡16 min，再制得其DPV圖。以pH值為橫坐標，洗脫后的Ip與印跡后的Ip之差為縱坐標，制得圖7。由圖7可見，在 pH 3．5～7．5，Ip之差先增大后減少;在pH 5．5時，Ip達到最大，此時印跡效果最佳。因此最佳pH≈5．5。

圖7　不同pH值對相應(yīng)電流的影響Fig．7　Influence of different pH values on response current of the sensor

3．3．5最佳印跡時間的優(yōu)化將洗脫模板分子后的膜放在1．0μmol/L桑色素溶液(pH 5．5)中進行吸附，吸附時間為6～18 min(間隔2 min)，用差分脈沖伏安法測定Ip，從圖8可見，吸附時間在6～16 min范圍內(nèi)，Ip逐漸減小;當吸附時間繼續(xù)延長到 18 min，Ip值變化不大，趨向穩(wěn)定。故吸附時間選取16 min。

3．4桑色素分子印跡膜工作曲線

將制備的電聚合膜在無水乙醇中浸泡14 min后，得到帶有特異識別孔穴的電聚合膜。配制桑色素溶液為0．05，0．10，0．12，0．17，0．25，0．50，1．0，1．2和1．7μmol/L，調(diào)節(jié)pH≈5．5。將帶有特異識別孔穴的電聚合膜分別置于上述溶液中吸附16 min，在表征溶液中用差分脈沖伏安法測定，得到DPV曲線(圖9)。以濃度對數(shù)lg c為橫坐標，Ip為縱坐標，線性回歸方程為I(μA)=1．0800lg c(mol/L)+9．3599，線性相關(guān)系數(shù)R=0．9934，檢出限為0．01μmol/L。

3．5分子印跡傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

在相同的實驗條件下，用印跡后的修電極對1．0μmol/L桑色素溶液進行響應(yīng)電流的測定，重復(fù)測定7次，算得其相對標準偏差為5．3%，說明此電極的分子印跡傳感器有較好的重復(fù)性。將此分子印跡傳感器在4℃保存7天后，在同樣的環(huán)境和實驗條件下，再次測定1．0μmol/L桑色素的Ip，發(fā)現(xiàn)其響應(yīng)值下降到約95．6%(RSD=3．2%);14天后測定，響應(yīng)值下降到約90．2%(RSD=4．1%)，說明此分子印跡傳感器具有很好的穩(wěn)定性和良好的使用壽命。

圖8　吸附時間對峰電流的影響(插圖為吸附時間及相對應(yīng)的電流圖)吸附時間a～g:6，8，10，12，14，16，18 minFig．8　Effect of adsorption time on peak current(Insert is the plot of peak current vs adsorption time)．Adsorption time a－g:6，8，10，12，14，16，18 min

圖9　印跡不同濃度桑色素MIP/GE差分脈沖伏安曲線(插圖為標準曲線)Fig．9　DPV curves of MIP/GE rebinding with morin of different concentration(Insert is the calibration curves of peak current vs morin concentration)

3．6干擾實驗

本實驗選取了與桑色素結(jié)構(gòu)相似的蘆丁和槲皮素分子作為干擾物質(zhì)，研究分子印跡膜對桑色素分子的選擇特異性。將洗脫好的分子印跡膜在1．0μmol/L桑色素溶液中浸泡14 min后，Ip明顯減小，表明桑色素能夠被印跡膜的分子空穴識別;再將此電極先后放入10μmol/L的蘆丁和槲皮素溶液中，Ip基本不再變化，根據(jù)電流誤差為±5%進行計算，10倍槲皮素和50倍蘆丁不干擾測定。表明此傳感器對桑色素具有較高的特異識別性。

3．7樣品分析

稱取3．0 g黑茶3份，分別放置于圓底燒瓶中，加95%無水乙醇100 mL，回流90 min，過濾，離心取上清液，稀釋10倍，調(diào)至pH≈5．5。再按上述條件測定Ip值，通過標準曲線計算出桑色素含量。采用加標回收法測定方法準確度，在3份5 mL黑茶樣品中加入桑色素標準液，按上述操作進行桑色素的回收率的測定，結(jié)果見表1。

表1　樣品測定和加標回收率實驗Table 1　Analysis result of sample and recovery test

4　結(jié)論

利用電化學(xué)聚合的方法制備了對桑色素具有特異性識別的分子印跡膜傳感器。研究結(jié)果表明，此傳感器對桑色素具有響應(yīng)快速、線性范圍較寬(0．05～1．70 mol/L)、靈敏度高、選擇性及重復(fù)性均較好。

References

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15WU Zhao-Yang，LUO Fei-Fei，LUAN Cong-Lin，JIANG Xiao-Hua，MEIQiong-Zhi．Journal of Hunan University(Natural Sciences)，2013，40(10):79－82吳朝陽，羅飛飛，欒崇林，蔣曉華，梅瓊之．湖南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2013，40(10):79－82

Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(No．21545003)

Fabrication and Application of a Molecularly Imprinted Sensor for Morin Detection

LIU Rong1，2，LONG Li-Ping*1，LEICun-Xi1，Wu Zhao-Yang2，LIU Yu1，LISi-Jia1
1(College of Chemistry＆Environmental Engineering，Hunan City University，Yiyang 413000，China)2(State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha 410082，China)

Based on the intermolecular interaction，a molecularly imprinted polymer electrochemical sensor with specific identification of cavity on gold electrode surface was proposed with o-aminophenol as functional monomers and morin as template molecule．The performance and effect of MIP were investigated by cyclic voltammetry(CV)and differential pulse voltammetry(DPV)．Factors affecting the properties of sensor，such as polymeric membrane ratio，scanning cycles，elution time and adsorption time were investigated．Substances which had a similar structure tomorin was used to compared the selective response．The result showed that the sensor had a good selectivity tomorin．Under the optimized experiment conditions，the current response of the imprinted sensorwas linear to the concentration ofmorin in the range of0．05－1．7μmol/Lwith linear equation as follows:I(μA)=1．0800lg c(mol/L)+9．3599(R=0．9934)，and the detection limit of 0．1μmol/L．The sensor was used to determine the contentofmorin in black tea samples，and the recoveries of standard addition were between 104．0%and 108．0%．

Molecularly imprinted;Morin;Electrochemical sensor;Electropolymerization

26 September 2015;accepted 27 November 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150761

2015-09-26收稿;2015-11-27接受

本文系湖南省教育廳高校科研一般項目(No．15C0244)，國家自然科學(xué)基金項目(No．21545003)，湖南省自然科學(xué)基金項目(No．2015JJ2023)，湖南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目(No．2014)207號)資助

*E-mail:llping401@163．com