高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜法快速篩查中成藥和保健食品中非法添加的42種化學(xué)藥物

劉蕓　丁濤廖雪晴沈崇鈺姜珊呂辰桂茜雯柳菡費曉慶吳斌張睿王艷　季美泉王栩璐　黃志強(江蘇出入境檢驗檢疫局，南京000)　(中國藥科大學(xué)，南京000)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海006)　(湖南出入境檢驗檢疫局，長沙000)

高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜法快速篩查中成藥和保健食品中非法添加的42種化學(xué)藥物

劉蕓丁濤*1廖雪晴2沈崇鈺1姜珊1呂辰3桂茜雯1柳菡1費曉慶1吳斌1張睿1王艷1季美泉1王栩璐1黃志強4
1(江蘇出入境檢驗檢疫局，南京210001)2(中國藥科大學(xué)，南京210001)3(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海201206)4(湖南出入境檢驗檢疫局，長沙410004)

建立了高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜法快速篩查中成藥和保健品中非法添加化學(xué)藥物的方法。中成藥和保健品樣品，經(jīng)提取溶劑提取，以12000 r/min離心后進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用Phenomenex C18色譜柱(100mm×4．6 mm，2．6μm)進(jìn)行分離，以乙腈和0．1%甲酸溶液作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜采用正離子和負(fù)離子同時掃描，F(xiàn)ullms-dd-MS2模式進(jìn)行分析。在所建立的色譜條件下，42種化學(xué)藥物能夠得到較好分離，在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于 0．99。通過加標(biāo)驗證，在 20，50和100 ng/g加標(biāo)水平下，所有分析物的平均回收率為69．3%～105．2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于8．9%。運用本方法對31種保健品和中成藥進(jìn)行快速篩查，發(fā)現(xiàn)其中3種添加了鹽酸二甲雙胍，1種添加了西地那非，1種添加了羥基莫豪西地那非。本方法樣品處理過程簡單，分析時間短，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高。適用于中成藥和保健品中非法添加化學(xué)藥品的定性與定量檢測，可用于非法添加藥物的篩查。

保健食品;化學(xué)藥物;非法添加;高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜;高分辨率質(zhì)譜

1　引言

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和生活條件改善，人們對保健食品及中成藥的需求日益增長。聲稱緩解體力疲勞(抗疲勞類)、輔助降血壓類、輔助降血糖類、改善睡眠功能類的保健食品也成為暢銷消費品。然而，中成藥及保健食品中非法添加化學(xué)藥物的現(xiàn)象也時有發(fā)生，個別不法商家為了增加療效、牟取暴力，在該類產(chǎn)品中添加了可促進(jìn)療效的化學(xué)藥物，這種現(xiàn)象危害嚴(yán)重，可能使中成藥原有的藥效發(fā)生改變，消費者在不知情的情況下服用這些含有非法添加化學(xué)成分的藥物可能會造成巨大的健康隱患［1，2］。因此，建立保健食品和中成藥中非法添加化學(xué)藥品的快速測定方法，對保障人民健康和打擊不法行為具有重要意義。

保健品中通常含有多種天然藥物成分，基質(zhì)非常復(fù)雜，非法添加的化學(xué)品具有很強的隱蔽性，不易被檢出［3］。2012年12月14日，國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)發(fā)布了保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單(第一批)，列出了聲稱緩解體力疲勞(抗疲勞類)、輔助降血壓類、輔助降血糖類、改善睡眠功能類中成藥和保健食品中可能添加的化學(xué)藥物，并公布了相應(yīng)的檢測依據(jù)。目前的檢測方法或文獻(xiàn)方法只針對某一類保健品進(jìn)行檢測，易造成漏檢。常用檢測方法有薄層色譜法［4］、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)［5］、HPLC法［6～8］、GC-MS法［9，10］、HPLC-MS/MS法［11～14］等，這些方法存在篩查不全面、檢測周期長、成本高等不足，難以對市場進(jìn)行有效監(jiān)管。因此，有必要建立能夠高通量、簡單、快速、高靈敏度和高準(zhǔn)確度的方法篩查多種類保健食品中違法添加化學(xué)成分的檢測方法。

四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀具有優(yōu)秀的定量分析能力和高分辨率、或獲得精確質(zhì)量的特點，對化合物的分辨率可達(dá)100000，相對質(zhì)量偏差在0．1～1×10-6之間［15］，目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、中藥安全控制、代謝組學(xué)、和食品安全領(lǐng)域中小分子和大分子的研究［16～19］，但同時測定保健品中的多種非法添加物的研究還未見報道。本研究利用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜的高靈敏度和強抗干擾能力的特點，實現(xiàn)了中藥及保健品中非法添加的化學(xué)藥物快速定性與定量測定，可在10 min內(nèi)同時準(zhǔn)確檢測出聲稱緩解體力疲勞(抗疲勞類)、輔助降血壓類、輔助降血糖類、改善睡眠功能類共4類42種非法添加的化學(xué)藥物。本方法具有前處理過程簡便、分析時間短、結(jié)果準(zhǔn)確等特點，可以用于中成藥及保健食品中非法添加藥物的篩查。

2　實驗部分

2．1儀器和試劑

四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive，ThermoFisher Scientific公司)，配備有HESI-Ⅱ源;液相色譜系統(tǒng)為Dionex Ultimate 3000高壓液相色譜(美國Dionex公司)。實驗用水均來自Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國);XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

實驗用42種藥物標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于99．9%，購自美國Cerilliant公司;乙腈(色譜純，德國Merck公司);甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)。

2．2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量固體標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇溶解，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封，于4℃保存。分別準(zhǔn)確移取上述42種單標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用乙腈-水(1∶1，V/V)稀釋成5個標(biāo)準(zhǔn)濃度的工作溶液，于4℃貯存。

2．3樣品處理方法

中成藥和保健品供試品膠囊樣品的內(nèi)容物、丸劑以及片劑各取適量，分別置于研缽中碾磨均勻成粉末狀。分別準(zhǔn)確稱取粉末1．0 g，加入甲醇-水(60∶40，V/V)，20℃超聲15min，于12000 r/min離心5 min。取適量溶液，經(jīng)0．22μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，供高效液相-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀測定。

2．4實驗條件

色譜條件:Phenomenex C18色譜柱(100 mm×4．6 mm，2．6μm);流動相由0．1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)組成，梯度洗脫程序:0～2 min，20%B;2～4 min，20%～90%B;4～8 min，90%B;8～9 min，90%～20%B;9～10 min，20%B。流速:0．50 mL/min;進(jìn)樣量10μL;樣品室溫度:20℃。

質(zhì)譜條件:可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ);毛細(xì)管溫度為350℃，加熱溫度為320℃，鞘氣(N2)流速50 L/min，輔助氣(N2)流速6 L/min，吹掃氣(N2)流速3 L/min;噴霧電壓為3 kV，透鏡電壓為50 V;采用正離子、負(fù)離子同時掃描的Full MS-data dependent MS2(dd-MS2)模式;全掃描的分辨率R=35000，掃描范圍m/z 150～1000，dd-MS2掃描中分辨率R=17500;AGC target:2×105;最大駐留時間:100ms;分離窗口:m/z2．0;強度閾值:4×104。具體分析物質(zhì)的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)及碎片離子、碰撞能、保留時間、分離模式如表1所示。

表1　42種分析物的信息表Table 1　Information table of 42 compounds

續(xù)表1　(Continued to Table 1)

3　結(jié)果和討論

3．1液相色譜條件的優(yōu)化

為了獲得較好的分離效果，考察了流動相水中增加0．1%～0．5%范圍內(nèi)的甲酸和乙酸的影響，發(fā)現(xiàn)0．1%甲酸溶液能夠改善大部分分析物峰形，且能夠使靶標(biāo)物質(zhì)離子化強度增大，從而增強色譜峰強度。其次，比較了甲醇和乙腈的差異，發(fā)現(xiàn)分析物在色譜柱上的保留較強，乙腈洗脫能力強，能夠?qū)袠?biāo)物質(zhì)較快洗脫下來，且得到較好分離。因此本研究選用0．1%甲酸-乙腈為流動相。對于42種化合物的分離，選擇梯度洗脫程序，在10 min內(nèi)所有化合物都能夠得到較好的分離。圖1為改善睡眠類藥物和降血壓類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖。

3．2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究充分利用Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢，采用Fullms-dd-MS2模式進(jìn)行分析。首先通過設(shè)置四極桿質(zhì)量分析器的分離窗口，進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析;再通過設(shè)置碰撞能量，由Orbitrap質(zhì)量分析器檢測碎片離子。為了得到分析物的最高儀器響應(yīng)值，進(jìn)行了所有質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。在全掃描模式中，質(zhì)譜分辨率對靶標(biāo)物質(zhì)的選擇性和靈敏度至關(guān)重要。當(dāng)分辨率增大時，質(zhì)譜能夠準(zhǔn)確提取分析物的準(zhǔn)確分子質(zhì)量，致使靈敏度提高，反之，分辨率降低時，可能提取出與靶標(biāo)物質(zhì)具有相同碎片的干擾物，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果。但分辨率增高時，質(zhì)譜掃描速率下降，導(dǎo)致色譜峰形變差，影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性。因此需要基于所分析物質(zhì)的色譜峰形，選擇最佳分辨率。多次實驗結(jié)果表明，在質(zhì)量窗口設(shè)置為5×10-6內(nèi)，分辨率R=70000為最佳的分析條件。

對于dd-MS2掃描，質(zhì)譜的分辨率R=175000，C-trap中存儲的離子數(shù)(AGC)設(shè)為2×105。C-trap中存儲的離子數(shù)較多時，可潛在提高分析物的靈敏度。通過流動注射直接進(jìn)入質(zhì)譜，以分析優(yōu)化每種物質(zhì)的碰撞能量。表1列舉了每種分析物的碰撞能、理論質(zhì)量數(shù)和實際質(zhì)量數(shù)，除了3種物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子為［M-H］+外，其它物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子均為［M+H］+。質(zhì)量偏差都小于5×10-6，表明Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜在理論質(zhì)量數(shù)和實驗質(zhì)量數(shù)之間可以提供高的可信度。

在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，42種分析物在10 min內(nèi)都得到較好分離。盡管有些化合物的保留時間較接近，但由于m/z的差異，使得它們很容易區(qū)分開，如甲苯磺丁脲和瑞格列奈、那紅地那非和紅地那非、馬來酸羅格列酮和伐地那非。也有些物質(zhì)有相同的分子式和準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，但是保留時間有差異，如偽伐地那非和那莫西地那非、羥基莫豪西地那非和硫代艾地那非。通過保留時間和二級碎片的差異，所有化合物都可以準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量分析。

圖1　改善睡眠類藥物和降血壓類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖Fig．1　Extracted chromatograms ofmental drugs and antihypertensive drugs

3．3方法學(xué)的考察

3．3．1線性范圍及檢出限采用Orbitrap高分辨質(zhì)譜對42中非法添加的化學(xué)藥物進(jìn)行定量分析，用乙腈-水(60∶40，V/V)稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，得到合適濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以目標(biāo)物特征離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)y，以目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有化合物在合適的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)都大于0．99。在空白功能飲料樣品中添加低濃度的目標(biāo)化合物，以信噪比S/N=3時對應(yīng)的濃度為方法的檢出限，信噪比S/N=10時對應(yīng)的濃度為方法的定量限，見表2。

3．3．2回收率與精密度采用在空白蜂膠膠囊和功能飲料樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行添加回收率測定。分別添加聲稱緩解體力疲勞(抗疲勞類)、輔助降血壓類、輔助降血糖類、改善睡眠功能共42種化學(xué)藥物進(jìn)行3個添加水平(20，50和100 ng/g，每個水平重復(fù)測定5次)的加標(biāo)回收實驗，測得42種化學(xué)藥物的加標(biāo)回收率為69．3%～105．2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)均小于8．9%。說明本方法對能夠滿足不同劑型樣品的分析要求，可用于日常分析的檢測。

3．4實際中成藥和保健品樣品中42種非法添加化學(xué)藥物的檢測

利用本方法測定了實驗室平時送檢和抽檢的31種樣品，包括蜂膠膠囊、功能飲料、褪黑素、魚油膠囊、大豆磷脂膠囊、瑪卡膠囊等。按照本方法對樣品進(jìn)行處理，每個樣品做3個平行測定。在4種保健品中發(fā)現(xiàn)了非法添加的化學(xué)藥物，其中3種保健品(褪黑素、促睡眠膠囊、中成藥)添加了鹽酸二甲雙胍，添加量分別為165．9、11．3和3．6 ng/g;1種螺旋藻中添加了西地那非，添加量為83．3 ng/g;1種瑪咖膠囊添加了羥基莫豪西地那非，添加量為12．6 ng/g;其中陽性樣品的檢出率為12．9%，可見非法添加現(xiàn)象普遍存在。

表2　42種化合物的檢出限、定量限和線性范圍Table 2　LOD，LOQ and linear ranges of 42 compounds

4　結(jié)論

本研究針對目前中成藥和保健品檢測方法存在篩查不全面、檢測周期長、難以對市場進(jìn)行有效監(jiān)管的問題，建立了高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，可以同時測定中成藥和保健品中聲稱緩解體力疲勞(抗疲勞類)、輔助降血壓類、輔助降血糖類、改善睡眠功能類共四大類42種非法添加的化學(xué)藥物。樣品經(jīng)提取溶劑提取后直接進(jìn)樣測定，避免了復(fù)雜的前處理過程，應(yīng)用本方法可在10 min內(nèi)完成整個檢測分析過程，大大提高了檢測效率。本方法具有前處理過程簡便、分析時間短、測定結(jié)果準(zhǔn)確、通量高等特點，已經(jīng)用于日常檢測中。根據(jù)保留時間和母離子、子離子的精確質(zhì)量數(shù)，可定性和定量地確定所檢出的非法添加化學(xué)藥物，為控制保健品質(zhì)量、打擊保健品行業(yè)非法添加行為提供有效依據(jù)。

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This work was supported by the Science and Technology Program of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau(No．2015KJ29)and the National Science and Technology Support Program(No．2012BAK08B01)．

Direct Determination of 42 Chem ical Drugs Illegally Added in Herbal M edicines and Dietary Supplement by High Performance Liquid Chromatography-Quadrurpole/Electrostatic Field Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

LIU Yun1，DING Tao*1，LIAO Xue-Qing2，SHEN Chong-Yu1，JIANG Shan1，LChen3，GUIQian-Wen1，LIU Han1，F(xiàn)EIXiao-Qing1，WU Bin1，ZHANG Rui1，WANG Yan1，JIMei-Quan1，WANG Xu-Lu1，HUANG Zhi-Qiang4
1(Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China)2(China Pharmaceutical University，Nanjing 210001，China)3(Thermol Fisher Scientific，Shanghai201206，China)4(Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha 410004，China)

A method of high performance liquid chromatography-quadrurpole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry(HPLC-Q/Qrbitrap MS)was developed to determine 42 chemical drugs illegally added in herbal medicines and dietary supplements．The samples were pretreated based on the ultrasonicassisted extraction by the solvent of methanol-water(6∶4，V/V)，and centrifuged under 12000 r/min．Subsequently，the solution was filtered by a polytetrafluoroethylene(PTFE)membrane with pore size of 0．22μm．The analyteswere separated on a Phenomenex C18(100 mm×4．6 mm，2．6μm)column through gradient elution with acetonitrile and 0．1%formic acid aqueous solution．Themass spectrometer was operated under Full MS/dd-MS2 experiment using positive and negative mode，respectively．Under the optimal conditions，42 chemical drugs were well separated．Good linearity was obtained in their respective linear rangeswith correlation coefficients higher than 0．99．The average recoveries at three spiked levels(20，50 and 100 ng/g)were in the range of 69．3%－105．2%and the relative standard deviations(RSDs)lower than 8．9%．Based on the above method，31 kinds of herbalmedicines and dietary supplements were analyzed，in which metformin was found in three samples while sildenafil and hydroxyhomosildenafil were found in one sample，respectively．The proposedmethod is simple，time saving，high accuracy and sensitive．Themethod is suitable for confirmation and quantification of 42 chemical drugs in herbalmedicines and dietary supplements．The research provides an effective method to control the quality and illegal addition for herbalmedical and dietary supplements．

Dietary supplements;Chemical drug;Illegal add;High performance liquid chromatographyquadrurpole/electrostatic field orbitrap mass spectrometry;High resolution mass spectrometry

14 September 2015;accepted 16 November 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150726

2015-09-14收稿;2015-11-16接受

本文系江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃(No．2015KJ29)、國家科技支撐計劃課題(No．2012BAK08B01)基金資助項目

*E-mail:dingt@jsciq．gov．cn