葡萄WRKY家族蛋白在非生物脅迫中的功能探討

朱丹 馬倩 郝杰 劉新

（青島農業(yè)大學生命科學學院 山東省高校植物生物技術重點實驗室，青島 266109）

葡萄WRKY家族蛋白在非生物脅迫中的功能探討

朱丹 馬倩 郝杰 劉新

（青島農業(yè)大學生命科學學院 山東省高校植物生物技術重點實驗室，青島 266109）

干旱、鹽和冷害等非生物脅迫嚴重限制著葡萄產業(yè)的發(fā)展。WRKY作為一大類轉錄調控因子，在多種信號轉導途徑中發(fā)揮著重要的作用。隨著高通量測序技術及各種研究技術的進步，越來越多的WRKY家族蛋白在非生物脅迫中的功能和作用機制得到驗證，為葡萄耐逆機理研究和分子育種篩選優(yōu)良品種奠定理論基礎和提供豐富的候選基因資源。從葡萄WRKY家族蛋白的挖掘和分類、參與植物干旱、鹽和冷脅迫非生物脅迫應答機制等方面展開詳細論述。

葡萄WRKY；非生物脅迫；功能探討

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.006

近些年，葡萄因具有較高的營養(yǎng)價值和經濟價值，其產業(yè)發(fā)展迅速，其中鮮食葡萄產量居世界第一位，釀酒葡萄居世界第五位。我國很多地區(qū)，如山東的煙臺和青島、新疆瑪納斯、寧夏賀蘭等，均具有種植葡萄得天獨厚的自然條件，但日趨嚴重的干旱、土壤鹽漬化、冷害等非生物脅迫逆境嚴重限制了這些地區(qū)的葡萄產業(yè)發(fā)展。在自然進化和人工雜交馴化育種過程中，為了個體的生長發(fā)育，也為了后代穩(wěn)定的延續(xù)，篩選出許多具有多種脅迫耐性的品種來抵抗和適應其生長的逆境。如中國東北的野生山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）具有較強的耐寒性，能耐受零下40℃-50℃的嚴寒，且冬季無需埋土就可以過冬［1］。北美葡萄種群河岸葡萄（Vitis riparia Michaux）和沙地葡萄（Vitis rupestris Scheele）具有較好的抗旱性。1616C、貝達等砧木品種具有很好的耐鹽性。這些抗性品種自身在結構、生理和分子等水平上表現(xiàn)出對脅迫的耐受性和適應性，如誘導脅迫耐性基因或者脅迫應答基因的表達，這種誘導又來源于對逆境因子的感知、一系列信號分子的轉導和信號通路的傳遞［2］。轉錄因子能與不同的非生物脅迫相關的響應基因的啟動子相互結合，從而轉錄調控基因表達［3］，誘導產生相應的生理和分子調節(jié)機制以應對脅迫。因此，轉錄因子在植物應對非生物脅迫中發(fā)揮的作用受到越來越多的關注。

WRKY轉錄因子是植物體內一類成員龐大的基因家族，在參與調控植物抗旱、耐鹽、耐冷等非生物脅迫中的功能和作用機制受到科學研究者們越來越多的關注［4］。1994年Ishiguro等［5］從甘薯中分離得到第一個WRKY基因SPF1，Rushton等［6］從歐芹中分離得到WRKY1、WRKY2和WRKY3，發(fā)現(xiàn)這些基因N-端都含有7個保守的氨基酸殘基WRKYGQR，因此將此類轉錄因子命名為WRKY。研究表明，七肽序列和鋅指結構基序對于WRKY轉錄因子結合下游基因啟動子上的W-box（TTGAC）來說是至關重要的［4］。WRKY轉錄因子根據(jù)WRKY結構域的數(shù)量和鋅指結構基序的特征分為3個亞家族。第一個亞家族有2個WRKY結構域；第二個亞家族含有和第一個亞家族類似的Cys2-His2模式的鋅指基序C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H，同時含有一個WRKY結構域如PcWRKY3、AfABF2；第三亞家族含有一個不同于上述兩個亞家族的Cys2-His/Cys Cys2-His2模式的鋅指基序C-X7-C-X23-H-X1-C，并且有一個WRKY結構域［7，8］。目前研究發(fā)現(xiàn)WRKY家族成員在模式植物擬南芥中有74個［9］，黃瓜中有55個［10］，水稻中有109個［11］，高粱中有68個［12］，大豆中有197個［13］，葡萄中有59個［14］。

本文將主要從葡萄WRKY家族蛋白介紹、葡萄WRKY轉錄因子分別在干旱、鹽、冷脅迫中的功能研究進展和耐逆機制探討等方面進行闡述，旨在解析WRKY轉錄因子調控葡萄應對非生物脅迫的分子機制，為葡萄耐逆境培育提供理論指導。

1　葡萄WRKY家族蛋白的種類和研究進展

人們對葡萄WRKY家族基因的亞家族分類、主要表達部位和參與的功能等進行研究（表1）。最早對葡萄WRKY家族蛋白進行生物信息學分析來自于北京大學生命科學學院羅靜初研究團隊和Velasco等［15，16］，他們通過構建和更新植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB 2.0，從49個物種中挖掘了53 319個轉錄因子基因家族，并對所有家族轉錄因子的基本信息、結構特征、進化分類和表達模式等進行了詳細注釋，其數(shù)據(jù)庫收集到葡萄的WRKY轉錄因子有98個成員。2010年遼寧師范大學侯和勝研究團隊［17］在全基因組測序的基礎上，對葡萄基因組的WRKY家族蛋白進行分析，同時去掉冗余序列，得到56條葡萄WRKY蛋白，通過電子表達譜分析表明葡萄WRKY基因在很多組織中，如芽、培養(yǎng)的細胞、花瓣、果實、花序、葉、花梗、根和蓮中都有表達，并且不同的葡萄基因表達部位不同，表達量也各不相同。2014年河南農業(yè)大學馮建燦研究團隊［18］分析發(fā)現(xiàn)葡萄中有80個WRKY，其中16個參與水楊酸SA介導的葡萄白腐病抵御過程。2014年中科院植物研究所李紹華研究團隊［19］以歐亞種葡萄（Vitis vinifera L.）‘黑比諾’基因組序列為基礎，根據(jù)擬南芥中基因編碼的氨基酸序列和同源比對，重新對WRKY基因家族進行鑒定得到59個WRKY家族成員，這些成員不均勻地分布在葡萄染色體上。根據(jù)結構域和系統(tǒng)進化分析將這59個WRKY蛋白分成了4組，第Ⅰ組有12個成員，均含有兩個WRKY結構域；第II組有39個成員，又分出5個亞群；第III組有6個成員，含有一個WRKY結構域，且鋅指結構以HXC結尾；第IV組成員最少，只有2個，缺少完整的鋅指結構。另外，他們對歐亞種葡萄‘玫瑰香’（V. vinifera cv‘Muscat Hamburg’）的幼葉、成熟葉、卷須、莖尖、幼果、成果和根共7種組織中的WRKY家族基因進行了轉錄水平的檢測，發(fā)現(xiàn)WRKY家族成員廣泛參與多種生物和非生物脅迫應答過程，表明WRKY基因可能在葡萄整個生命周期以及各種脅迫應答過程都起著重要作用。同年，西北農林科技大學王西平研究團隊［20］也對葡萄WRKY家族蛋白進行了系統(tǒng)分析，確定出59個WRKY成員，并將其分成了3組。轉錄表達特性分析發(fā)現(xiàn)有4個WRKY基因在葡萄根或葉中有大量的表達，有55個WRKY不同水平上在至少響應一種非生物脅迫，有38個響應霜霉病侵染，大部分基因在脫落酸（abscisic acid，ABA）和水楊酸（salicylic acid，SA）的處理后下調表達。

表1　葡萄WRKY家族蛋白分析

目前葡萄中對WRKY家族的研究主要停留在基因挖掘和轉錄表達模式分析上，克隆和功能分析的VvWRKY基因僅有14個，且對其功能研究主要集中在葡萄生長發(fā)育和生物脅迫方面。如Terrier 等［21］2005年進行了葡萄漿果生長過程基因表達的研究，初步推測轉錄因子WRKY家族在這其中發(fā)揮重要作用 。劉新研究團隊［22］發(fā)現(xiàn)WRKY71參與了硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）介導的葡萄抗霜霉病過程。異源表達VpWRKY3則能提高煙草對茄科雷爾式菌抵抗力［23］，而葡萄WRKY在非生物脅迫應答方面的功能研究仍比較少。

2　葡萄WRKY家族蛋白與干旱脅迫

植物受到干旱脅迫時，其細胞膜系統(tǒng)通常最先受到傷害，體內活性氧代謝失衡，胞內物質如電解質、滲透調節(jié)物質外滲，導致細胞失水，最終導致植物脫水死亡。WRKY家族蛋白參與植物抗旱的分子機制主要有：（1）作為轉錄因子通過調控干旱脅迫應答基因、植物抗旱信號通路基因和自身基因的表達來啟動植物對干旱脅迫的應答。如水稻OsWRKY47能夠與鈣結合蛋白CaBP和富含半胱氨酸分泌蛋白CRRSP基因啟動子區(qū)的順式作用元件（G/T）TTGACT結合來啟動干旱脅迫信號傳遞通路，正向調控水稻抗旱［24］；金桔的FcWRKY70通過與精氨酸脫氫酶FcADC啟動子區(qū)的W-Box結合，以提高植物抗旱性［25］。（2）與其他蛋白互作調控自身活性來控制干旱脅迫應答網絡。水稻OsWRKY30能與MAPKs互作并被其磷酸化，參與調控抗旱過程［26］。（3）通過調控ABA信號途徑參與抗旱。如擬南芥AtWRKY1能夠與ABA信號通路中基因MYB2、ABCG40、DREB1A和ABI5的啟動子W-Box結合調控氣孔運動，從而抗旱［27］；菊花中的CmWRKY1通過下調PP2C、ABI1和 ABI2，上調 PYL2、SnRK2.2、ABF4、MYB2、RAB18和DREB1A這些ABA信號通路中的基因，參與菊花耐旱［28］。

葡萄WRKY家族蛋白參與對干旱的響應，如葡萄輔酶因子蛋白VvVQ能與多個VvWRKYs結合響應干旱脅迫［25，29］；2011年Liu等［30］從‘北峰’葡萄品種中克隆得到一個大小為1 255 bp 的WRKY11轉錄因子VvWRKY11，能夠與AtRD29A 和AtRD29B啟動子的W-box結合，從而提高擬南芥抵御甘露醇誘導的干旱脅迫能力。2013年劉新研究團隊［31］從‘左優(yōu)紅’葡萄品種中克隆到兩個受干旱脅迫強烈誘導表達基因VvWRKY18和VvWRKY45，其中VvWRKY18大小為954 bp，屬于第II類WRKY家族蛋白，在花、花芽和葉中的表達量較高；VvWRKY45大小為2 514 bp，啟動子含有響應ABA、赤霉素（gibberellic acid，GA）、茉莉酸（jasmonate acid，JA）順式作用元件，在干旱脅迫6 h時表達量上調10倍。2016年本研究室又從抗性葡萄品種‘Vidal Blanc’（Vidal256）中克隆到一個大小為1 095 bp的多種逆境脅迫誘導表達基因VvWRKY30，該基因的表達能夠增強大腸桿菌對干旱的耐受性，且異源表達擬南芥植株發(fā)現(xiàn)VvWRKY30能通過減少氣孔開度，減少地上部分的水分散失，同時提高滲透調節(jié)物質脯氨酸（proline，Pro）和可溶性糖含量維持自身的滲透平衡；通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性來清除細胞內的活性氧，提高植株的耐旱性［32］。

3　葡萄WRKY家族蛋白與鹽脅迫

土壤鹽漬化影響植物的生長和發(fā)育。鹽脅迫下，原有的離子平衡被打破，高濃度的Na+會破壞細胞膜的完整性，從而影響細胞膜的正常生理功能［33］。其次，由于外界環(huán)境中鹽分濃度過高，土壤的水勢下降，造成植物吸水困難，甚至能引起植物體內水分的外滲，導致水分的虧損，從而對植物形成滲透脅迫［34］。植物通過一系列的機制來應對鹽脅迫，如調節(jié)離子平衡、合成滲透調節(jié)物質、激活抗氧化酶系統(tǒng)等。WRKY家族蛋白通常以多個成員一起協(xié)同調控的方式參與這些途徑響應鹽脅迫。如棉花中有109個WRKY，其中有28個響應鹽脅迫，且GhWRKY17、GhWRKY41和GhWRKY104通過降低丙二醛含量、提高抗氧化酶活性來提高植物的耐鹽性［35，36］；利用微陣列分析發(fā)現(xiàn)在擬南芥的根部有18個WRKY受到NaCl誘導［37］，其中過表達AtWRKY25和AtWRKY33后能提高擬南芥的耐鹽性［38］。

目前對葡萄WRKY家族蛋白參與耐鹽脅迫的研究比較少，主要集中在西北農林科技大學王躍進團隊和青島農業(yè)大學劉新團隊。王躍進等［39］從中國野生葡萄品種‘Baihe-35-1’中克隆得到3個WRKY基因，分別命名為VpWRKY1、VpWRKY2和VpWRKY3，大小分別為1 157 bp、1 607 bp和1 280 bp。其中VpWRKY1和VpWRKY2的過表達擬南芥植株具有較好抗鹽性，VpWRKY3能提高轉基因煙草的耐鹽性［23］。劉新等從‘左優(yōu)紅’葡萄品種中篩選到VvWRKY13、VvWRKY18和 VvWRKY45，從‘Vidal Blanc’葡萄品種中篩選到VvWRKY30和VvWRKY54都能受鹽脅迫大量誘導表達［31，40］。其中VvWRKY30的過量表達能夠增強大腸桿菌對鹽的耐受性；鹽脅迫下，VvWRKY30異源表達擬南芥通過提高脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶如SOD、POD和CAT的活性增強其耐鹽性［32］。另外，中國農業(yè)大學盧江研究團隊［41］從葡萄品種‘Noble’中克隆得到MrWRKY30，其基因序列與劉新研究室克隆得到的VvWRKY30相似性為47.3%。MrWRKY30在擬南芥中的超量表達通過ROS途徑提高了植物對鹽脅迫的敏感性。

4　葡萄WRKY家族蛋白與冷脅迫

植物體內WRKY家族蛋白抗寒分子機制的研究主要是通過ABA信號轉導途徑的雙重抑制機制調控對低溫的響應。如茶樹中有50個WRKY家族基因，大部分都受冷脅迫誘導，其中CsWRKY2通過調控ABA信號通路參與植物抗冷［42］。目前葡萄響應冷脅迫的分子機制還不清楚，主要通過雜交育種和越冬埋土技術來提高植物的抗寒性，但該方法耗時費力，無法滿足目前葡萄產業(yè)需求。有報道，WRKY家族蛋白在植物耐冷中發(fā)揮重要作用。2014年，李紹華研究團隊完成了歐亞種葡萄‘玫瑰香’（V. vinifera cv‘Muscat Hamburg’）和山葡萄（V. amurensis Rupr.）整個WRKY家族成員在冷脅迫下的表達變化分析和比較研究，獲得15個冷脅迫相關的WRKY基因，其中過表達WRKY28和WRKY43的轉基因植株耐寒能力增加［19，43］。盧江團隊［41］從葡萄品種‘Noble’中克隆的MrWRKY30通過誘導擬南芥抗寒基因CBF1、CBF3、COR47和ICE1的表達，增強了轉基因擬南芥的耐寒性。此外，從中國野生葡萄中克隆得到的VpWRKY1和VpWRKY2過表達擬南芥植株具有較好抗冷性［39］。

5　展望

干旱、鹽漬和低溫等非生物脅迫是限制葡萄產業(yè)發(fā)展的重要問題，探究葡萄在非生物脅迫條件下的應答機理，對于篩選和培育抗性優(yōu)良品種，提高葡萄產量具有重要的理論意義。植物對逆境脅迫的響應是一個復雜的信號傳導過程，包括脅迫信號的感知、信號的轉導、不同的生理和代謝反應的激活。作為植物最大的轉錄因子成員之一的WRKY家族，它們在植物應答非生物脅迫中發(fā)揮著至關重要的作用，是逆境脅迫信號轉導通路中控制基因表達的關鍵節(jié)點［44］。WRKY轉錄因子通常與其他蛋白或者順式作用元件結合而發(fā)揮其功能。目前的研究發(fā)現(xiàn)WRKY能夠與MAPKs、CDPKs等蛋白酶結合，從而激活或者抑制其自身的活性，進而調控與脅迫相關基因的啟動子區(qū)W-Box的結合，來參與植物對非生物脅迫的應答。另外，不同的激素如 SA、ABA等及氣體信號物質一氧化氮（nitric oxide，NO）、H2S、H2O2均可作為信號分子參與植物應答逆境脅迫的過程。如干旱、鹽和冷脅迫都能啟動ABA信號通路，響應并傳遞脅迫信號。有研究表明，ABA誘導表達的基因參與非生物脅迫應答也依賴于MAPKs、CDPKs等的活性。因此，對于WRKY家族蛋白參與葡萄耐逆的分子機制研究可以從分析葡萄WRKY結合的伴侶蛋白、調控的下游基因、協(xié)同的信號分子通路等方面著手，綜合探究葡萄WRKY抗逆的調控網絡。此外，近年來WRKY家族蛋白在基因轉錄過程的負調控作用也得到了廣泛關注，如水稻WRKY13作為轉錄抑制子，結合并抑制下游干旱響應基因SNAC1的轉錄，從而使轉基因水稻表現(xiàn)出干旱敏感癥狀［39］；擬南芥WRKY70在防御反應中通過激活水楊酸響應基因，抑制茉莉酸響應基因，從而平衡互相拮抗的信號通路［39］；但是目前尚未有葡萄中發(fā)揮負調控作用相關WRKY蛋白的報道，這可能為進一步豐富并完善葡萄WRKY抗逆調控網絡提供一定思路。

作為功能強大的基因家族，同一個WRKY轉錄因子往往參與多種抗逆過程。如從葡萄品種‘Noble’中克隆的MrWRKY30即增強了轉基因擬南芥的耐寒性，同時提高了轉基因南芥對霜霉菌的抗性［41］；從‘Vidal Blanc’葡萄品種中篩選到的VvWRKY30提高了植物的耐鹽和耐旱能力［32］；從野生葡萄中克隆的VpWRKY2同時提高了植物對鹽脅迫、冷脅迫和霜霉病害的抗性［39］。通過基因工程手段將這些WRKY基因導入葡萄，培育和篩選出同時具有多種脅迫耐受性的新品種，對推動葡萄產業(yè)經濟的發(fā)展具有重要的理論及實踐意義，同時利用生物措施改良土地，對于改善我國土地生態(tài)系統(tǒng)和提高土地資源利用率具有重要意義。

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（責任編輯 李楠）

Function Exploration of Grape WRKY Family Proteins Under Abiotic Stresses

ZHU Dan MA Qian HAO Jie LIU Xin
（Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Life Science College，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）

Abiotic stresses caused by drought，salt and cold restrict the development of grape industry. WRKY，as a large transcriptional regulation factor gene family，plays important role in multiple signal-transduction pathways. With the advances in high throughput sequencing technology and a variety of research techniques，more and more WRKY protein’s function and mechanism in abiotic stresses have been validated，which establish a theoretical basis and provide a rich candidate gene resources for grape abiotic stress resistant mechanism research and screening excellent varieties through molecular breeding. This review will summarize the identification and classification，drought，salt and cold stresses response mechanism of grape WRKY family proteins in detail.

grape WRKY；abiotic stress；function exploration

2016-07-27

國家自然科學基金項目（31572107，31540090，31501331），青島農業(yè)大學高層次人才科研基金項目（6631115032）

朱丹，女，博士，研究方向：植物耐逆分子機理；E-mail：zhudan2014dora@163.com

劉新，女，博士，教授，研究方向：植物逆境信號轉導；E-mail：liuxin6080@126.com