掌葉半夏凝集素基因PPA2抗蚜功能分析

劉玎陳勁劉志朱生偉

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所植物分子與生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

掌葉半夏凝集素基因PPA2抗蚜功能分析

劉玎1，2陳勁1，2劉志1朱生偉2

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所植物分子與生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

掌葉半夏凝集素（Pinellia pedatisecta Agglutinin，PPA）基因?qū)儆趩巫尤~甘露糖結(jié)合凝集素家族，具有抗蟲活性。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)從掌葉半夏幼葉中克隆到1個(gè)新的凝集素基因，命名為PPA2，其開放閱讀框長(zhǎng)408 bp，編碼135個(gè)氨基酸，有一個(gè)甘露糖保守結(jié)合域，包含3個(gè)甘露糖專一結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建了由35S啟動(dòng)子和韌皮部特異性啟動(dòng)子AtPP2驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草后，經(jīng)鑒定獲得了單拷貝插入高表達(dá)量的純合轉(zhuǎn)基因煙草株系。通過Western-blot分析，將獲得的轉(zhuǎn)基因純合株系按蛋白表達(dá)水平分成高、中、低3類并進(jìn)行抗蚜試驗(yàn)，結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)基因煙草均具有明顯抗蚜效果，35S-PPA2轉(zhuǎn)基因植株平均抑蚜率極高，而3種蛋白表達(dá)類型的AtPP2-PPA2轉(zhuǎn)基因植株普遍低于35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)基因植株。PPA2可以作為高效抗蚜候選基因，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

掌葉半夏凝集素；基因克?。晦D(zhuǎn)基因煙草；抗蚜基因

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.022

蚜蟲，又稱為膩蟲或蜜蟲等，隸屬于半翅目（原為同翅目），是農(nóng)林業(yè)危害最大的害蟲之一。蚜蟲為刺吸式昆蟲，以刺吸式口器從植物莖、葉和幼穗部位吸取汁液，大量吸收植物的營(yíng)養(yǎng)成分導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受到抑制［1］；其排泄的蜜露覆蓋在植物葉片表面，影響植物的呼吸和光合作用并且引起病菌滋生，傳播多種疾病［2，3］。

植物凝集素（lectin）是一種特異性識(shí)別并可逆地與糖類化合物糖基相結(jié)合，但不改變與其相結(jié)合糖基共價(jià)結(jié)構(gòu)的一類非免疫球蛋白，能夠凝集細(xì)胞和沉淀糖蛋白，廣泛存在于植物中［4］，在各個(gè)組織中均有分布［5，6］。根據(jù)結(jié)合糖的特異性，可將植物凝集素分為葫蘆科韌皮部凝集素家族、2-型核糖體失活蛋白家族、豆科類凝集素家族、木菠蘿（Jacalin）凝集素家族、莧菜凝集素家族、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素家族、單子葉結(jié)合甘露糖凝集素家族［7］等7個(gè)蛋白質(zhì)家族，其中單子葉甘露糖結(jié)合凝集素因?qū)Υ涛胶οx如褐飛虱、桃蚜等同翅目害蟲及線蟲有毒殺作用，同時(shí)對(duì)鞘翅目和鱗翅目害蟲也有一定毒性而受到研究者們的廣泛關(guān)注［8］。

雪花蓮凝集素（Galanthus nivalis agglutinin GNA）是單子葉甘露糖凝集素家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的凝集素，能專一識(shí)別α-1，3和α-1，6甘露糖［9，10］。含有該基因的轉(zhuǎn)基因小麥和國(guó)槐，對(duì)蚜蟲具有一定的抗性［11，12］；轉(zhuǎn)AalT/GNA基因的煙草對(duì)咀嚼式和刺吸式昆蟲均有抗性［13］；褐飛虱若蟲會(huì)避開轉(zhuǎn)GNA基因植株而選擇未轉(zhuǎn)化植株［14］；將GNA基因?qū)朊藁?，獲得了3個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，在抗蚜實(shí)驗(yàn)中3個(gè)品系對(duì)棉蚜均表現(xiàn)出了高抗水平［15］。半夏凝集素（Pinellia ternate agglutinin，PTA）屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素，由于其能特異性結(jié)合昆蟲消化道內(nèi)的甘露糖殘基，而哺乳動(dòng)物消化道內(nèi)甘露糖殘基很少，所以對(duì)人和哺乳動(dòng)物的毒性極低，因此具有較高的應(yīng)用價(jià)值。將從三葉半夏花中克隆到的PTA基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草較對(duì)照的蚜口密度顯著下降［16］，構(gòu)建cry Ia和PTA的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入小麥，蚜蟲存活率減少至54%和78%［17］，轉(zhuǎn)PTA煙草抑蚜率達(dá)到77.02%［18］；將半夏凝集素基因在煙草葉綠體中表達(dá)，對(duì)蚜蟲、飛虱、鱗翅目昆蟲等都有較高抗性［19］。Qi等［20］將半夏凝集素基因?qū)胨緝?nèi)生枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)對(duì)白背飛虱有很強(qiáng)的抗性，均表明PTA有較強(qiáng)的抗蟲活性。

掌葉半夏凝集素（Pinellia pedatisecta agglutinin，PPA）也屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族，能夠可逆地和甘露糖或甘露聚糖結(jié)合。Wu等［21］將掌葉半夏球莖中的凝集素基因在煙草中表達(dá)，能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)桃蚜的抗性，T0代植株平均抑制率為90.28%，其中有兩個(gè)株系致死率為100%。可見掌葉半夏凝集素具有較強(qiáng)的殺蟲效果。本研究利用NCBI公布的半夏凝集素保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，從掌葉半夏幼葉中克隆出一個(gè)新的凝集素基因PPA2，分別構(gòu)建35S-PPA2過表達(dá)載體和AtPP2-PPA2韌皮部特異性表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因煙草純合植株并進(jìn)行抗蚜性試驗(yàn)，旨在鑒定新的抗蚜基因，并為抗蚜基因的高效表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

掌葉半夏由河北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV101、植物表達(dá)載體pEarleyGate 101等主要菌株和載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等主要試劑盒都購(gòu)于天根生化科技有限公司，phusion DNA 聚合酶、Taq DNA聚合酶等主要酶購(gòu)自Sigma公司，其他化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)試劑公司。

1.2方法

1.2.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 掌葉半夏總RNA提取采用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行，具體步驟參考試劑盒內(nèi)提供的實(shí)驗(yàn)流程。采用天根公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將獲得的cDNA第一條鏈作為后續(xù)的載體構(gòu)建及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）的反應(yīng)模板。

1.2.2PPA2基因的克隆 在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTN檢索，根據(jù)已公布的半夏凝集素甘露糖結(jié)合保守序列，利用Primer 5.0 引物軟件設(shè)計(jì)基因特異引物658-F'和658-R'（表1），由上海Life公司合成。利用引物擴(kuò)增到一條序列，將序列連在測(cè)序載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性菌落測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)其屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族，且為新序列。

1.2.3生物信息學(xué)分析 用在線軟件Compute pI/ Mwtool，ExPASy（http：//expasy.org/tools/pi_tool.html）預(yù)測(cè)PPA2蛋白的分子量和等電點(diǎn)，在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi中分析PPA2蛋白的保守序列，使用DNAMAN軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

表1　本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.4植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 參照試劑盒說明書，使用Gateway（Invitrogen）系統(tǒng)，構(gòu)建35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PPA2超表達(dá)載體，載體為pEarley Gate 101，大腸桿菌（Escherichia coli）菌株為DH5α，農(nóng)桿菌菌株為GV3101。采用CTAB法提取擬南芥DNA，根據(jù)NCBI中公布的擬南芥韌皮部蛋白特異性啟動(dòng)子區(qū)序列，然后采用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出韌皮部蛋白啟動(dòng)子特異性AtPP2，將其與pEarley Gate TW1連接后，同樣采用Gateway系統(tǒng)構(gòu)建AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體。

1.2.5轉(zhuǎn)基因煙草T3代純合植株的獲得 使用75%乙醇和1% NaClO對(duì)野生型煙草W38種子表面消毒后種于1/2 MS培養(yǎng)基中，制備無菌苗；將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，通過Basta抗性篩選，組織培養(yǎng)侵染的煙草葉片經(jīng)脫分化-再分化途徑，獲得轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，然后經(jīng)煉苗后移栽至花盆中于溫室生長(zhǎng)。在T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株中，根據(jù)孟德爾遺傳定律，通過Basta抗性篩選，將分離比為3∶1的株系進(jìn)一步通過PCR和Western-blot鑒定，獲得單基因位點(diǎn)插入的基因植株，套袋自交并留種；將單基因插入的煙草種子種下，進(jìn)行抗性篩選，獲得T3代不分離的純合株系。然后，采用CTAB法提取煙草葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定，提取煙草葉片蛋白，進(jìn)行Western-blot鑒定。植物表達(dá)載體上帶有YFP標(biāo)簽，以YFP抗體為探針，通過分析YFP含量從而確定緊密連鎖的目的基因的表達(dá)量，并根據(jù)目的蛋白表達(dá)量的多少，分別將含有35S啟動(dòng)子和AtPP2的轉(zhuǎn)基因煙草植株分為高、中、低3類，每類各3株。

1.2.6轉(zhuǎn)基因煙草純合植株的抗蚜性試驗(yàn) 當(dāng)煙草長(zhǎng)出第8片真葉時(shí)，與長(zhǎng)勢(shì)一致的野生植株一起采用搭葉法接種一齡桃蚜20頭進(jìn)行抗蚜試驗(yàn)，每隔3d統(tǒng)計(jì)一次煙葉上的蚜蟲數(shù)量，共統(tǒng)計(jì)5次。根據(jù)以下公式計(jì)算各植株的抗蚜效率，比較35S啟動(dòng)子和AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)基因純合株系的抗蚜性：

抑蚜率（%）=［（對(duì)照組蚜蟲數(shù)目-測(cè)試組蚜蟲數(shù)目）/ 對(duì)照組蚜蟲數(shù)目］×100%

2　結(jié)果

2.1PPA2基因克隆及序列分析

根據(jù)NCBI中已公布的半夏凝集素保守序列，采用Primer5.0設(shè)計(jì)了特異性引物：658-F和658-R（表1）。提取掌葉半夏RNA（圖1-A），通過RT-PCR法從掌葉半夏幼葉中擴(kuò)增到一條大小為408 bp的cDNA片段（圖1-B），經(jīng)克隆測(cè)序后命名為PPA2。生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)該基因分子量為14.7 kD，pI為4.98，編碼135個(gè)氨基酸，具有一個(gè)信號(hào)肽的前體蛋白，切割位點(diǎn)在21和22個(gè)氨基酸之間；含有一個(gè)甘露糖保守結(jié)構(gòu)域包括3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族（圖2-A），定位于細(xì)胞質(zhì)中。通過Blast比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2-C），發(fā)現(xiàn)PPA2與天南星科天南星凝集素、石半夏凝集素等同源性較高，與天南星科其他凝集素序列相似性在64%-75%之間（圖2-B），因而該基因?yàn)橐粋€(gè)新的凝集素基因。

圖1　PPA2基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2PPA2基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

圖2　PPA2蛋白生物信息學(xué)分析

為了分析不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)條件下PPA2基因的表達(dá)情況，分別構(gòu)建含組成型CaMV 35S啟動(dòng)子（圖3-A）和擬南芥韌皮部特異性啟動(dòng)子AtPP2的植物表達(dá)載體（圖3-B）。通過NCBI查到AtPP2啟動(dòng)子大小為975 bp，而實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增大小為1 000 bp左右（圖4-A），測(cè)序后發(fā)現(xiàn)完全匹配。利用Gateway系統(tǒng)，通過重疊PCR反應(yīng)將啟動(dòng)子與PPA2基因重疊后連接到入門載體，使用啟動(dòng)子上游引物和基因下游引物擴(kuò)增到一大小為1 500 bp左右的片段（圖4-B），測(cè)序后發(fā)現(xiàn)連接成功。通過LR反應(yīng)將重疊后的AtPP2-PPA2基因轉(zhuǎn)入pEarleyGate-TW1植物表達(dá)載體，將PPA2基因轉(zhuǎn)入pEarleyGate-101植物表達(dá)載體，進(jìn)行菌落PCR鑒定（圖4-C，D），挑取陽性菌落進(jìn)一步測(cè)序確證成功構(gòu)建了含AtPP2和CaMV 35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。

圖3　載體示意圖

圖4　PPA2基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建

2.3轉(zhuǎn)PPA2基因煙草T0代的獲得與鑒定

圖5　轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

圖6　轉(zhuǎn)基因煙草T0代分子鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法侵染野生型煙草，對(duì)經(jīng)Basta抗性篩選獲得的再生煙草植株（圖5）進(jìn)行PCR鑒定（圖6-A，B），共獲得CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草19株，AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草24株。Western-blot檢測(cè)PPA2基因在經(jīng)PCR鑒定的轉(zhuǎn)基因煙草中均能成功表達(dá)（圖6-C，D）。

2.4轉(zhuǎn)基因煙草T3代純合植株鑒定及抗蚜性分析

篩選獲得CaMV 35S-PPA2轉(zhuǎn)基因純合株系10個(gè)；AtPP2-PPA2轉(zhuǎn)基因純合株系6個(gè)。為研究蛋白表達(dá)水平是否與抗蚜效果呈正相關(guān)，又因AtPP2啟動(dòng)子在韌皮部特異表達(dá)，遂選取轉(zhuǎn)基因煙草各株系葉脈組織進(jìn)行Western-blot檢測(cè)（圖7-A），發(fā)現(xiàn)AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達(dá)量明顯低于CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株，且各啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下不同株系之間，蛋白表達(dá)量存在明顯差異。根據(jù)蛋白表達(dá)量差異，將轉(zhuǎn)基因株系分為高、中、低三類進(jìn)行抗蚜性試驗(yàn)。接種蚜蟲后18 d發(fā)現(xiàn)野生型煙草蚜蟲數(shù)目較多（圖7-B），轉(zhuǎn)AtPP2-PPA2基因煙草葉片上可見一些蚜蟲（圖7-C），而轉(zhuǎn)CaMV 35S-PPA2基因煙草葉片上幾乎沒有蚜蟲（7-D）。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，CaMV 35S（圖7-E）和AtPP2啟動(dòng)子（圖7-F）驅(qū)動(dòng)下的各轉(zhuǎn)基因株系蛋白表達(dá)量高低分別與其抑蚜率強(qiáng)弱基本相符。CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株抑蚜率為99.37%；中等蛋白表達(dá)量的抑蚜率為86.48%；而低蛋白表達(dá)量的抑蚜率僅為68.63%。AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株抑蚜率為59.95%；中等蛋白表達(dá)量的抑蚜率為56.87%；而低蛋白表達(dá)量的抑蚜率僅為44.42%，均低于CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)基因株系。

3　討論

植物凝集素基因由于其抗蟲功能，廣泛應(yīng)用于抗蟲基因工程，其中單子葉甘露糖結(jié)合凝集素基因，由于其對(duì)蚜蟲的抗性和對(duì)人及哺乳動(dòng)物基本無毒性的特性受到關(guān)注，研究廣泛。半夏屬凝集素也屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族，抗蟲效果較好［18，19］。關(guān)于掌葉半夏凝集素（PPA）的相關(guān)研究極少，研究稱將掌葉半夏球莖中的凝集素基因在煙草中表達(dá)，多拷貝插入T0代植株平均抑蚜率為90.28%［21］，暗示掌葉半夏凝集素具有極高抗蚜效果，作為抗蚜候選基因，具有極高應(yīng)用潛力。

圖7　轉(zhuǎn)基因煙草純合植株蛋白檢測(cè)及抗蚜性分析

本研究從掌葉半夏幼葉中克隆出一個(gè)新的掌葉半夏凝集素基因PPA2，對(duì)PPA2蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其具有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包含3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，屬于甘露糖結(jié)合凝集素。分別構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子和擬南芥韌皮部特異性啟動(dòng)子AtPP2驅(qū)動(dòng)的重組載體，獲得轉(zhuǎn)基因煙草，利用篩選鑒定后得到的轉(zhuǎn)基因煙草純合植株進(jìn)行抗蚜試驗(yàn)。相對(duì)于野生型，轉(zhuǎn)基因植株均有很高的抗蚜性，CaMV 35S和AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的各轉(zhuǎn)基因株系蛋白表達(dá)量高低分別與其抗蚜效率強(qiáng)弱基本相符。CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下轉(zhuǎn)基因植株抗蚜效率為68.63%-99.37%；AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株抗蚜效率為44.42%-59.95%，均低于CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)基因株系。這些結(jié)果表明PPA2雖比其他凝集素基因序列相比缺少一部分相對(duì)保守序列，但從功能上來看，與半夏屬凝集素基因同樣具有抗蚜作用。與前人研究［21］相比，我們獲得的CaMV 35S-PPA2轉(zhuǎn)基因植株抗蚜效率更高，表明PPA2是一個(gè)高效抗蚜基因。蚜蟲為刺吸式昆蟲，以吸取韌皮部汁液為食。AtPP2啟動(dòng)子為韌皮部特異性啟動(dòng)子，在韌皮部特異性表達(dá)，抗蚜效果理應(yīng)高于組成型CaMV 35S啟動(dòng)子，而AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株抗蚜活性明顯低于CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株。為究其原因，選取轉(zhuǎn)基因煙草葉脈為材料進(jìn)行Western-blot鑒定，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)低于CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株，表明抗蚜效果與蛋白水平高低呈正相關(guān)。而蛋白表達(dá)量差異過大可能是由于試驗(yàn)取材部位為植株葉脈，葉脈主要由維管束及其周圍包裹的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，維管束包含木質(zhì)部和韌皮部，韌皮部只占整個(gè)葉脈的一小部分，而AtPP2啟動(dòng)子只在韌皮部特異性表達(dá)，所以從蛋白結(jié)果上來看AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達(dá)量極低，而CaMV 35S啟動(dòng)子為組成型過表達(dá)啟動(dòng)子，在各個(gè)組織表達(dá)量均較高。AtPP2啟動(dòng)子在植物中表達(dá)量低，與許蘭珍［22］研究結(jié)果相似，這也是導(dǎo)致抗蚜性試驗(yàn)中AtPP2啟動(dòng)子抗蚜效率低于CaMV 35S的一個(gè)可能原因，但在蛋白表達(dá)量較低的情況下，AtPP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草仍有較強(qiáng)的抗蚜效果，該結(jié)果為后期研究構(gòu)建韌皮部特異性高效表達(dá)載體，使其在韌皮部特異性高效表達(dá)提供了研究基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

本研究克隆到一個(gè)新的掌葉半夏凝集素基因PPA2，屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族，具有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。分別構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子和擬南芥韌皮部特異性啟動(dòng)子AtPP2驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了分子鑒定，并進(jìn)一步篩選出單拷貝插入的純合植株進(jìn)行抗蚜性檢測(cè)，結(jié)果表明PPA2基因抗蚜性極高。

致謝：

感謝河北省農(nóng)林科學(xué)院吳志明研究員在實(shí)驗(yàn)過程中給予的幫助。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Insect Resistance Analysis of an Agglutinin Gene PPA2 Cloned from Pinellia pedatisecta

LIU Ding1，2CHEN Jin1，2LIU Zhi1ZHU Sheng-wei2
（1. College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128；2. Key laboratory of Plant Molecular Physiology，Insitiute Of Botany，CAS，Beijing 100093）

Pinellia pedatisecta Agglutinin（PPA）belonging to mannose-binding lectin muti-family has insect resistant activity. A new gene，named PPA2，encoding a PPA protein was cloned by RT-PCR from young leaves of pinellia pedatisecta. The PPA2 consists of an ORF of 408 bp coding 135 amino acids（14.7 kD），and contains a mannose conservative domain with three mannose-binding sites. The transgenic tobacco plants mediated by Agrobacterium with leaf disc method were obtained under the control of CaMV 35S promoter and Arabidopsis thaliana phloem promoter AtPP2. A few of homozygotic transgenic plants with single copy insertion and high expression level were indentified in T3 generation，and then these plants were divided into high，middle，and low classes according to the level of expression protein detected by western-blot analysis. The results of aphid bioassay showed that all transgenic plants had obviously insecticidal activity against the tobacco aphids（Myzus nicotianae），and the CaMV 35S-PPA2 transgenic plants had the highest insecticidal activity，while the aphid inhibition was much lower in AtPP2-PPA2 transgenic plants than in CaMV 35S-PPA2 ones. These findings suggest that PPA2 is a suitable candidate gene for high efficient aphid resistance and has important application prospect.

Pinellia pedatisecta Agglutinin（PPA）；gene cloning；transgenic tobacco；aphid-resistant gene

2016-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金-新疆聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1403284）

劉玎，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：dinger5323@163.com

朱生偉，男，博士，研究方向：植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與棉纖維發(fā)育；E-mail：zhusw@ibcas.ac.cn