植物冷信號傳導機制研究進展

霍晨敏湯文強

（1. 河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024；2. 河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院，石家莊 050061）

植物冷信號傳導機制研究進展

霍晨敏1，2湯文強1

（1. 河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024；2. 河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院，石家莊 050061）

低溫脅迫能限制植物地理分布并影響作物產(chǎn)量，但是在適宜的低溫條件下處理一段時間后植物就可以獲得更強的抗冷和抗凍能力，這個過程稱為冷馴化。在冷馴化的過程中，植物感知環(huán)境低溫，通過一系列信號傳導事件調(diào)節(jié)耐冷相關基因的表達，提高植物的耐冷性。介紹了目前冷信號傳導機制研究的一些新進展：包括新發(fā)現(xiàn)的冷信號傳導途徑的上游組分CHILLINGTOLERANCE DIVERGENCE 1（COLD1）和OPEN STOMATA1（OST1）；對冷信號途徑中關鍵轉(zhuǎn)錄因子C-REPEAT BINDING FACTORS（CBFs）進行CRISPR/Cas9敲除后的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果以及短時間冷脅迫處理的蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果等。并且根據(jù)這些研究進展，總結(jié)了一個冷信號傳導途徑的模式圖。

低溫脅迫；冷馴化；信號傳導；轉(zhuǎn)錄組；蛋白質(zhì)組

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.008

環(huán)境低溫，尤其凍害是主要的環(huán)境非生物脅迫之一，不但影響植物的地理分布，還對水稻等作物的產(chǎn)量有著重要的影響。我國每年因自然災害造成的經(jīng)濟損失巨大［1］。隨著人口的增長和耕地面積的不斷減少，提高作物對惡劣環(huán)境的抵抗能力，減少低溫對作物的影響，提高作物的產(chǎn)量，對于21世紀糧食安全有著非常重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過非冰凍低溫處理的植物可以獲得對冰凍低溫的抵抗能力，這個過程稱為冷馴化（cold acclimation）。植物的冷馴化過程包括低溫條件下多種細胞內(nèi)生理和生化過程的改變，其中變化最顯著的包括鈣離子的瞬時上升［2］，生長停止，組織的含水量降低，ABA含量升高，磷脂組成的變化［3］，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖的積累等［4］。冷馴化產(chǎn)生的分子機制是非冰凍低溫能誘導植物表達一系列冷響應蛋白（COLD REGULATED GENES，簡稱CORs），幫助植物抵抗冰凍低溫。冷馴化現(xiàn)象也說明，在非冰凍低溫下，植物能夠感受環(huán)境溫度的變化并且通過一系列信號傳導機制改變自身的基因表達模式，從而適應改變的環(huán)境［5，6］。隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用模式植物擬南芥為研究材料，人們找到了許多參與冷信號傳導途徑的信號組分，并且也已經(jīng)將這些組分組裝成一個基本清晰的冷信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。近年來，隨著基因組學和蛋白組學的興起，其研究結(jié)果也在不斷地豐富和補充人們對于冷信號轉(zhuǎn)導調(diào)控網(wǎng)絡的認知。因此在本文中，我們將介紹冷信號傳導機制研究的一些新進展，尤其是來自轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學的研究成果。

1　冷信號的感知

植物能夠感知環(huán)境溫度的變化并通過改變基因表達模式來提高植物對冰凍低溫的抵抗能力。但是一直以來，植物感知低溫的分子機制都不是非常的清楚。TRP通道蛋白（TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL CHANNELS）是動物中的溫度感受器［7］。環(huán)境溫度發(fā)生改變可以激活TRP通道，改變跨膜的離子（包括鈣離子）運輸，起始內(nèi)吞或外排等細胞過程，調(diào)節(jié)基因的表達。雖然在植物中沒有TRP通道的同源基因，但是植物中是否存在類似于TRP通道的受低溫激活的離子通道？最近種康課題組［8］發(fā)現(xiàn)水稻質(zhì)膜上一個具有9次跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白COLD1（CHILLING-TOLERANCE DIVERGENCE 1）發(fā)生突變后可顯著影響水稻對冷的抵抗能力。COLD1可能能夠通過三亞基G蛋白來調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的變化來調(diào)節(jié)植物的耐冷性。目前還不太清楚COLD1是否本身具備離子通道的活性，以及低溫是如何調(diào)節(jié)COLD1活性的，因此對于COLD1是否能夠作為一個低溫受體來調(diào)節(jié)植物的耐冷性還有待進一步的研究。

2　冷馴化對基因表達的調(diào)控

低溫對轉(zhuǎn)錄因子CBFs（C-REPEAT BINDING FACTORS）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)被認為在植物冷馴化過程中發(fā)揮著極其重要的作用。在擬南芥中，參與冷響應的CBF家族轉(zhuǎn)錄因子主要有CBF1、CBF2和CBF3。如果通過CRISPR/Cas9技術將擬南芥中3個CBFs都敲除，發(fā)現(xiàn)突變體的基礎耐凍性和野生型相比沒有區(qū)別或者僅有細微差異，但是突變體獲得的耐凍性顯著降低，說明CBFs的確在植物的冷馴化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［9，10］；過表達CBF1-3可以組成型地激活COR 基因，且提高植物的基礎抗凍性［11，12］。但是由組成型強啟動子驅(qū)動CBF的表達會誘導COR基因在正常條件下的表達，導致植物正常條件下生長緩慢，植株變矮?。?1，12］。如果用RD29A（也稱為COR78）的啟動子啟動CBF1的表達既可以有效地提高植物的抗凍性，又不改變植物的生長表型［12］。

CBFs通過作用于核心序列為“RCCGAC”的CRT/DRE（C-REPEAT/DEHYDRATION- RESPONSIVE ELEMENT）順式元件上調(diào)節(jié)下游COR基因的表達，從而增強植物對低溫的耐受能力［13-15］。如受CBFs調(diào)節(jié)的COR15A［16-18］、COR78［19］、COR47［20］和COR6.6［20］所編碼的蛋白高度親水［21］。這些蛋白可以使生物膜在凍害時保持穩(wěn)定，減少滲漏，并且在復蘇時增加膜的可伸展性［21，22］。此外CBFs調(diào)節(jié)的其它COR蛋白還參與低溫條件下細胞的解毒作用、抗氧化反應、光合作用、木質(zhì)素代謝，次級代謝、細胞多糖重塑、淀粉代謝、甾醇類激素合成和寡聚糖合成等冷響應過程［23］。因此找到受CBF直接調(diào)節(jié)的COR基因?qū)τ谖覀兘馕隼漶Z化的作用機理具有非常重要的意義。由于CBF1、CBF2和CBF3在擬南芥四號染色體上緊密連鎖，難以獲得T-DNA插入突變體的雙重或者三重突變體。一直以來，科學家們基本都是利用CBF單突變體，CBF的反義抑制或者CBF的過表達轉(zhuǎn)基因植物來研究受CBF調(diào)節(jié)的COR基因［24-28］。

最近楊淑華課題組［9］和朱健康課題組［10］分別利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了將CBF1、CBF2和CBF3同時敲除的突變體，并結(jié)合RNAseq的方法，使人們對于冷脅迫條件下受CBFs調(diào)節(jié)的基因有了一個更加清晰的認識。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥野生型中約有3 346［9］或4 087［10］個基因的表達水平在冷處理后有2倍以上的變化。同樣的處理條件，發(fā)現(xiàn)在cbf123三突變體中，約有3 134［9］或者3 659［10］個基因的表達水平受冷脅迫調(diào)節(jié)。以上兩個課題組都發(fā)現(xiàn)，只有7%［9］或10%［10］左右的COR基因受CBFs的調(diào)節(jié)。對cbf123三突變體的基礎耐凍性和獲得耐凍性的比較也發(fā)現(xiàn)，雖然冷馴化后的cbf123三突變體的耐凍能力低于野生型，但要高于沒有經(jīng)過冷馴化的三突變體，說明擬南芥CBF1、CBF2和CBF3缺失的情況下，植物仍然可以感受冷信號，調(diào)節(jié)COR的表達，提高植物的耐凍性，充分證明CBF之外可能還存在其它的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)COR基因的表達，調(diào)節(jié)植物冷馴化過程。通過對cbf123突變體與野生型植物冷響應基因的比較，朱健康課題組［10］發(fā)現(xiàn)有3種冷信號快速響應的轉(zhuǎn)錄因子HSFC1（HEAT SHOCK TRANSCRIPTION FACTOR C1）、ZAT12（ZINC FINGER OF ARABIDOPSIS THALIANA 12）和CZF1（CCCH DOMAIN CONTAINING ZINC FINGER 1）沒有受到CBFs敲除的影響，可能是獨立于CBFs之外的冷脅迫相關轉(zhuǎn)錄因子，而這3種轉(zhuǎn)錄因子分別過表達后都能夠像CBFs的過表達植物一樣，可以上調(diào)COR基因的表達［29］。

3　冷信號傳導途徑

擬南芥CBFs的表達水平在低溫下處理15 min就會迅速上升，在冷處理1-2 h后表達水平達到最高［30］，說明CBFs的轉(zhuǎn)錄水平還受到其它轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。研究表明，有一系列的轉(zhuǎn)錄因子可以直接與CBF的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)CBF的表達［31-34］。在這些轉(zhuǎn)錄因子中研究得最為清楚的是轉(zhuǎn)錄因子ICE1（INDUCER OF CBF EXPRESSION 1）對CBF的調(diào)節(jié)。ICE1是一種bHLH類的轉(zhuǎn)錄因子，與MYC-2類的順式元件（CACATG）的結(jié)合能力要強于其他類型的MYC元件［31］。在CBF3編碼框的上游1 kb以內(nèi)的序列中含有5個MYC結(jié)合位點，而CBF1和CBF2的啟動子區(qū)各只有一個MYC元件。ICE1功能缺失后能抑制低溫促進的CBF3的表達，而對低溫促進的CBF1和CBF2的表達基本沒有影響［31］。因此人們認為ICE1主要參與冷脅迫對CBF3的表達水平的調(diào)節(jié)。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，ICE1的同源蛋白ICE2可以參與低溫條件下對CBF1的表達調(diào)控［35］。

ICE1過表達后只有在低溫下才能促進CBFs的表達，說明ICE1的轉(zhuǎn)錄活性是受低溫調(diào)節(jié)的［31］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)低溫能夠調(diào)節(jié)ICE1蛋白的穩(wěn)定性。在冷處理的早期（1 h以內(nèi)）ICE1蛋白比較穩(wěn)定，但隨著冷處理的時間延長（1 h以后），ICE1的穩(wěn)定性下降，被蛋白酶體降解［36］。目前發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)ICE1蛋白的冷信號組分有HOS1（HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENE 1）［36，37］、SIZ1（SAP AND MIZ1）［38］和OST1（OPEN STOMATA 1）［39］。HOS1是ICE1的E3泛素連接酶，在冷馴化的晚期（0℃處理15 h）能介導ICE1的泛素化從而使ICE1被26S蛋白酶體降解［36］。SIZ1是一種SUMO（SMALL UBIQUITIINLIKE MODIFIER）蛋白的E3連接酶，在冷處理時，SIZ1可以介導ICE1的SUMO化。被SUMO化后的ICE1與HOS1相互作用降低，泛素化程度減弱［38］。因此SIZ1是ICE1的正向調(diào)節(jié)因子，在冷信號的早期起著穩(wěn)定ICE1蛋白的作用。但是目前還不是非常清楚冷處理的晚期，ICE1穩(wěn)定性的降低是因為SIZ1的作用受到抑制還是HOS1的作用得到了增強，或者還是有其它的調(diào)控機制參與了ICE1的降解。蛋白激酶OST1是植物激素ABA信號途徑中的一個重要組分。在正常情況下，OST1激酶和PP2C（PROTEIN PHOSPHATASE 2C）蛋白磷酸酶結(jié)合，活性受到抑制。ABA和受體PYR（PYRABATIN RESISTANCE）結(jié)合后［40，41］，ABA/PYR復合體和PP2C結(jié)合，解除PP2C對OST1的抑制，OST1被激活，磷酸化下游AREBs/ABFs（ABRE-binding proteins/factors）家族轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)一系列脅迫相關的基因的表達［42］。最近的研究發(fā)現(xiàn)：4℃處理30 min就可以顯著提高OST1的激酶活性。OST1可以和HOS1競爭性地與ICE1結(jié)合，磷酸化ICE1。一方面提高ICE1蛋白的穩(wěn)定性，另一方面促進ICE1的轉(zhuǎn)錄活性，從而激活冷信號的ICE1-CBF-COR通路［39］。Ding［39］的研究還發(fā)現(xiàn)冷處理30 min的情況下，植物體內(nèi)ABA的含量略有減少，說明在該處理時間段內(nèi)，OST1激酶活性的增加可能與ABA信號無關。PP2C磷酸酶突變體abi1-1是一個顯性突變，在該突變體中突變的abi1蛋白和OST1結(jié)合非常緊密，不再受ABA/PYR受體復合物的調(diào)節(jié)［42］。在abi1-1突變體中，冷處理后OST1激酶活性不再增加，說明低溫誘導OST1活性的增加同樣依賴于PP2C蛋白磷酸酶對OST1抑制作用的解除［39］。目前我們對于低溫脅迫如何解除PP2C對OST1的抑制作用還不太清楚，還有待于后續(xù)的研究。相信對該抑制解除機制的解析不但有助于人們理解冷信號早期的感知和啟動機制，還有助于理解長時間處理后ICE1-CBF-COR冷信號途徑被關閉的分子調(diào)節(jié)機制。

近年來蛋白質(zhì)組學的興起，為植物信號傳導機制的研究帶來了新的手段。與轉(zhuǎn)錄組學研究不同，蛋白組學的研究對象是生物功能的直接執(zhí)行者——蛋白質(zhì)，因此可以做到實時觀測樣品處理后蛋白豐度的變化過程。此外蛋白質(zhì)組學研究還有一個優(yōu)點就是能夠?qū)Φ鞍椎姆g后修飾進行檢測，從而對目的蛋白參與某個生物學過程的調(diào)控機制進行預測。利用2D-DIGE的蛋白組學方法，湯文強課題組［43］從水稻中找到26個豐度在冷處理5 min后就發(fā)生顯著變化的冷快速響應蛋白。這些蛋白涉及到細胞代謝、脅迫響應、蛋白折疊、骨架重排和磷脂代謝等生物學過程。從這些蛋白中發(fā)現(xiàn)磷酯酶OsPLDα1的蛋白含量在冷處理5 min后能上升4倍左右。功能研究表明，OsPLDα1是水稻冷信號傳導早期的重要組分之一，可能通過CBF途徑調(diào)節(jié)COR基因的表達［43］。OsPLDα1能水解磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine）產(chǎn)生磷脂酸分子（Phosphatidic acid，簡稱PA）。PA可以與冷信號傳導上游的ABI1［44］、MPK6［43，45］、SIZ1［43］等結(jié)合，可能通過調(diào)節(jié)這些蛋白的亞細胞定位或者蛋白的活性來調(diào)節(jié)CBF的表達，從而調(diào)節(jié)植物的冷馴化過程。根據(jù)該研究成果和最近植物冷馴化機制的研究進展，我們總結(jié)整理了一個植物冷信號傳導途徑的模式圖（圖1）。

4　ICE1-CBF-COR不依賴的冷馴化途徑

如上所述，雖然ICE1-CBF-COR信號通路的主要元件都已被克隆和進行功能驗證，但是冷信號傳導通路并不是單線傳導的方式。朱健康課題組［46］此前的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，只有約40%的COR基因的表達水平在ice1突變體中發(fā)生了改變，說明ICE1-CBF-COR途徑之外還存在其它的冷信號傳導途徑。此外，人們還發(fā)現(xiàn)許多其它的轉(zhuǎn)錄因子包括CAMTA3（CALMODULIN BINDING TRANSCRIPTION ACTIVATOR 3）［33］、ZAT12［47］和MYB15（MYB DOMAIN PROTEIN 15）［32］等都能夠調(diào)節(jié)CBFs的表達。其中CAMTA3是一種受鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子。由于冷脅迫處理能夠快速誘導植物胞內(nèi)鈣離子的升高［2］。升高的鈣離子可以激活鈣調(diào)素，通過調(diào)節(jié)CAMTA3的轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)節(jié)CBF1和CBF2的表達［33］。此外，CBF的表達水平以及ICE1的轉(zhuǎn)錄活性還可以受EIN3（ETHYLENE INSENSITIVE 3）［34］和JAZ1/4（JASMONATE ZIM DOMAIN PROTEIN 1/4）［48］等植物激素信號傳導組分的調(diào)節(jié)，說明ICE1-CBF調(diào)控模塊不僅是冷信號傳導的重要組分，還是其他脅迫信號及植物生長發(fā)育信號調(diào)節(jié)植物冷脅迫反應的核心元件。

5　展望

近年來，人們對于植物冷馴化信號傳導的分子機制有了許多突破性的進展。但是從圖1中可以看出，目前我們對冷馴化信號傳導機制主要還是圍繞著ICE1-CBF-COR途徑進行的。最近的研究結(jié)果表明，CBF和ICE1只參與一小部分COR基因的表達調(diào)控，相信今后對CBF以及ICE不依賴的冷馴化信號傳導機制的研究將會逐漸占據(jù)主導地位，并豐富我們對于植物冷馴化生物學過程的理解。植物對低溫的感受機制以及早期冷信號的傳遞機制也將是今后冷信號傳導研究的熱點問題之一。由于蛋白質(zhì)組學研究方法的優(yōu)點和此前利用蛋白組學找到植物信號傳導新組分的成功案例［49］，相信諸如N15和TMT（Tandem Mass Tag）標記的定量蛋白質(zhì)組學方法的應用能夠為解析早期植物冷信號傳導的分子機制作出重要的貢獻。另外，此前的研究，包括對cbf123三突變體的RNAseq研究，冷脅迫的處理時間都是幾個小時甚至24 h［9，10］。長時間的冷脅迫處理必將導致轉(zhuǎn)錄因子對基因表達的二級或者多級表達調(diào)控，而不能真正顯示受冷信號傳導組分直接調(diào)節(jié)的基因。前期的研究也表明，CBF的表達水平在冷處理15 min后就可以顯著升高［30］；而蛋白質(zhì)組學的研究結(jié)果也顯示，對植物進行5 min的冷處理就足以導致一批早期冷響應蛋白的豐度發(fā)生變化［43］，說明冷信號傳導事件在冷處理15 min就已經(jīng)完成或者部分完成。因此，今后的冷信號傳導機理尤其是早期冷信號傳導途徑的研究需要注意將冷處理的時間縮短到1 h以內(nèi)，甚至15 min以內(nèi)，這樣所得到的研究結(jié)果才能夠真正體現(xiàn)冷信號傳遞發(fā)生的過程，而不是體現(xiàn)一種長時間冷處理后，由轉(zhuǎn)錄因子級聯(lián)調(diào)控導致的差異基因表達的結(jié)果。

圖1　冷信號傳導途徑模式圖

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（責任編輯 馬鑫）

A Review of Plant Cold Signal Transduction Mechanisms

HUO Chen-min1，2TANG Wen-qiang1
（1. College of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024；2. College of Biology Science & Engineering，Hebei University of Economics & Business，Shijiazhuang 050061）

Cold stress is one of the major environmental factors that affect the geological distribution and seasonal growth of the plants. Being exposed to low non-freezing temperature would increase plants’resistance to freezing temperature by a process called cold acclimation. During cold acclimation，plants sense the environmental low temperature，initiate cold signal transduction pathways and change the expression of genes that are critical for plants to survive the freezing temperature. In this review，we focused on recent progresses regarding our understanding of cold signal transduction mechanisms，which including the newly discovered cold signaling components CHILLINGTOLERANCE DIVERGENCE 1（COLD1）and OPEN STOMATA1（OST1）；transcriptomic studies of C-REPEAT BINDING FACTORS（CBFs）triple mutant created by CRISPR/Cas9 technology and proteomic study of early cold regulated proteins etc. Based on these results，a cold signal transduction model is summarized.

cold stress；cold acclimation；signal transduction；transcriptome；proteome

2016-08-24

河北經(jīng)貿(mào)大學校內(nèi)科研基金重點項目（2014ZYO7）

霍晨敏，女，博士，研究方向：植物抗逆與細胞信號轉(zhuǎn)導；E-mail：huochenmin@163.com

湯文強，男，博士，教授，研究方向：信號轉(zhuǎn)導與蛋白質(zhì)組學；E-mail：tangwq@mail.hebtu.edu.cn