谷氨酰胺在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中對(duì)鯉免疫力影響的研究

雷五長(zhǎng)，李錦，孫穎，曲木，李靜輝，程鎮(zhèn)燕

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谷氨酰胺在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中對(duì)鯉免疫力影響的研究

雷五長(zhǎng)，李錦，孫穎，曲木，李靜輝，程鎮(zhèn)燕通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

以鯉的中腎白細(xì)胞作為研究對(duì)象，研究了谷氨酰胺對(duì)鯉免疫細(xì)胞免疫力的影響。在培養(yǎng)基中分別添加濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的谷氨酰胺，在細(xì)胞培養(yǎng)2、6、12、24 h后，分別測(cè)定白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加谷氨酰胺后，鯉腎臟白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力得到了明顯提高（＜0.05），且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，呼吸爆發(fā)活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在培養(yǎng)12 h后的2.0 mmol/L谷氨酰胺組。在鯉腎臟白細(xì)胞培養(yǎng)12、24 h后，測(cè)定鯉腎臟白細(xì)胞的吞噬活力，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞吞噬活力變化趨勢(shì)和呼吸爆發(fā)活力相似，其最高值出現(xiàn)在1.5 mmol/L谷氨酰胺細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的添加組，鯉腎臟白細(xì)胞對(duì)遲鈍愛(ài)德華氏菌殺菌率變化趨勢(shì)與吞噬活力相符，添加谷氨酰胺后的各組殺菌率最高值發(fā)生在1.5 mmol/L谷氨酰胺組，與1.0、2.0 mmol/L谷氨酰胺組之間差異均不顯著（＞0.05），但均顯著高于對(duì)照組及0.5 mmol/L谷氨酰胺組（＜0.05）。將平均體重37 g的鯉魚分為5組，每組30條，體內(nèi)注射0、50、100、150、200 mg/kg魚體重的谷氨酰胺溶液，商業(yè)飼料投喂2周后分離中腎獲取鯉腎臟白細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力和增殖活力隨谷氨酰胺濃度的增加而呈現(xiàn)先顯著上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)（＜0.05），而吞噬活力則一直顯著升高（＜0.05），最高值均出現(xiàn)在200 mg/kg谷氨酰胺注射組。綜合結(jié)果表明，谷氨酰胺是鯉有效的免疫增強(qiáng)劑。

鯉；谷氨酰胺；吞噬；呼吸爆發(fā)；增殖

谷氨酰胺是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，是快速分裂的細(xì)胞包括活化淋巴細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞重要的能量供體，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的有絲分裂和分化增殖，增加細(xì)胞因子TNF、IL-1等的產(chǎn)生和磷脂的mRNA合成[1]。在病理狀態(tài)下，補(bǔ)充谷氨酰胺可以促進(jìn)病變或損傷組織（如肝臟或者腸道）的修復(fù)和加速患者的恢復(fù)[2]。研究表明，谷氨酰胺能增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能[3-4]和抗病力[5]，當(dāng)培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺時(shí)，被激活的斑點(diǎn)叉尾鮰巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO量的增加，進(jìn)一步說(shuō)明了谷氨酰胺作為魚類免疫系統(tǒng)的細(xì)胞代謝燃料的必要性[6]。此外，有研究表明，飼料中補(bǔ)充谷氨酰胺能提高幼年雜交鱘血漿補(bǔ)體蛋白C3和C4[7]，以及美國(guó)紅魚嗜中性粒細(xì)胞的氧化自由基（NBT）和巨噬細(xì)胞超氧陰離子的產(chǎn)生[8]。

近幾年，隨著鯉的集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，致使病害頻繁發(fā)生，給漁業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而大量使用抗生素、消毒劑等化學(xué)藥物防治疾病不僅增加了生產(chǎn)成本，破壞了水域環(huán)境生態(tài)，而且導(dǎo)致水產(chǎn)品中藥物殘留，危害人類健康，因此，尋求病害防治新方法迫在眉睫。研究谷氨酰胺對(duì)鯉體細(xì)胞免疫力的影響，探討谷氨酰胺調(diào)節(jié)鯉免疫力的機(jī)理具有重要的學(xué)術(shù)意義，同時(shí)也為生產(chǎn)上提高鯉的免疫力、抗病力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

體外試驗(yàn)：將平均體重約37 g的鯉放養(yǎng)在水溫（23±0.2）℃的水族箱中暫養(yǎng)，投喂商業(yè)飼料，暫養(yǎng)2周后取出6尾鯉，小心切除頭腎和中腎并放置于經(jīng)過(guò)預(yù)先消毒處理過(guò)的培養(yǎng)基中，收集切除下來(lái)的頭腎和中腎，使其形成一個(gè)復(fù)合樣品用于下一步試驗(yàn)中的白細(xì)胞分離。向RPMI-1640培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的谷氨酰胺（Amresco公司），得到濃度不同的5種培養(yǎng)基，用于白細(xì)胞的培養(yǎng)。用兩個(gè)獨(dú)立的復(fù)合樣品（每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)）進(jìn)行免疫學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

體內(nèi)試驗(yàn)：將平均體重約37 g的鯉放養(yǎng)在水族箱中，保持水溫（23±0.2）℃，暫養(yǎng)1周后，將魚隨機(jī)分成5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)水族箱放10尾魚，向腹腔中分別注射 0、50、100、150、200 mg/kg魚體重的谷氨酰胺溶液。之后繼續(xù)投喂商業(yè)飼料，養(yǎng)殖2周后取樣，取頭腎放于生理鹽水中清洗表面血污，然后放在配制好的培養(yǎng)液中，待測(cè)。

1.2 樣品制備與測(cè)定

在尼龍網(wǎng)（100 μm）上，用研磨棒仔細(xì)研磨過(guò)濾上述用剪刀剪碎處理好的鯉中腎樣品，然后不斷用新的RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗正在研磨的鯉中腎樣品（由2%的小牛血清、10 u/mL的肝素和100 u/mL青霉素/鏈霉素配置成此RPMI-1640培養(yǎng)基）。放在不連續(xù)的34%/51%的珀可溶液中，并在4 ℃下400 g離心25 min。收集位于交界處的細(xì)胞帶，然后將細(xì)胞懸浮物重新懸浮于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度至2×107個(gè)細(xì)胞/ mL，并用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定活力，要求活力均大于95%。

白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力、吞噬活力、增殖能力的測(cè)定均參考王慶奎[9]的方法進(jìn)行，將分離的腎白細(xì)胞懸液用HBSS調(diào)整濃度為 5×106個(gè)細(xì)胞/ mL，用于測(cè)定呼吸爆發(fā)活力。呼吸爆發(fā)系數(shù)（Respiratory Burst Index，）＝刺激孔690-未刺激孔690。將分離的腎白細(xì)胞懸液用HBSS調(diào)整濃度為 5×107個(gè)細(xì)胞/mL，用于測(cè)定白細(xì)胞的吞噬活力，吞噬活力＝試驗(yàn)孔608-對(duì)照孔608。將腎白細(xì)胞用RPMI-1640增殖液（含5% 胎牛血清、2% 熱滅活鯉魚血清、100 IU/mL 氨芐青霉素和0.1 mg/mL硫酸鏈霉素）重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL，測(cè)定白細(xì)胞的增殖能力。刺激指數(shù)（Stimulation Index，）＝（受刺激細(xì)胞的平均550/未受刺激細(xì)胞的平均550）-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用平均值表示，使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件做單因素方差分析（One-way ANOVA），若差異達(dá)到顯著（＜0.05），則進(jìn)行Ducan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中補(bǔ)充谷氨酰胺對(duì)鯉腎臟白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的影響

由圖1看出，在培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，且分別培養(yǎng)2、6、12、24 h后，鯉腎臟白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力與沒(méi)有添加谷氨酰胺的對(duì)照組相比顯著提高。培養(yǎng)2 h后，添加谷氨酰胺組顯著高于對(duì)照組（＜0.05），其余各組間差異不顯著（＞0.05）；培養(yǎng)6 h后，添加谷氨酰胺的各組呼吸爆發(fā)活力均高于對(duì)照組，但各組間均沒(méi)有顯著差異（＞0.05）；培養(yǎng)12 h后，0.5 mmol/L組與對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異，均顯著低于1.0、1.5、 2.0 mmol/L添加組（＜0.05）；培養(yǎng)24 h后，呼吸爆發(fā)活力與12 h相比，有所下降，0.5 mmol/L組與對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異，添加谷氨酰胺的各組間也沒(méi)有顯著差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，呼吸爆發(fā)活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段，呼吸爆發(fā)活力的最高值均出現(xiàn)在 2.0 mmol/L谷氨酰胺添加組。

（注：圖中所給數(shù)據(jù)為平均值，同組不同字母表示差異顯著（＜0.05），下同）

2.2 培養(yǎng)基中補(bǔ)充谷氨酰胺對(duì)鯉腎臟白細(xì)胞吞噬活力的影響

由圖2看出，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)12 h和24 h后，鯉腎臟白細(xì)胞的吞噬活力與沒(méi)有添加谷氨酰胺的對(duì)照組的吞噬活力相比，其吞噬活力有了一定提高。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)12 h后，1.0、1.5、2.0 mmol/L組間無(wú)顯著差異（＞0.05），0.5 mmol/L與對(duì)照組間無(wú)顯著差異（＞0.05），1.0、1.5、2.0 mmol/L組吞噬活力均顯著高于0.5 mmol/L谷氨酰胺組與對(duì)照組。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后，添加 0.5 mmol/L谷氨酰胺組顯著高于對(duì)照組（＜0.05），而1.0、1.5、2.0 mmol/L組間差異不顯著（＞0.05），但均顯著高于對(duì)照組和0.5 mmol/L谷氨酰胺組（＜0.05）。

2.3 培養(yǎng)基中補(bǔ)充谷氨酰胺對(duì)鯉腎臟白細(xì)胞增殖效果的影響

如圖3所示，添加谷氨酰胺培養(yǎng)12 h后， 0.5 mmol/L谷氨酰胺組白細(xì)胞的增殖效果與沒(méi)有添加谷氨酰胺的對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異（＞0.05），添加1.0、1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺的各組間差異不顯著（＞0.05），與對(duì)照組間存在顯著差異（＜0.05），最高值發(fā)生在1.5 mmol/L谷氨酰胺組。培養(yǎng)48 h后，0.5 mmol/L谷氨酰胺組與對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異（＞0.05），1.0、1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺組與對(duì)照組間均存在顯著差異（＜0.05），1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺組間沒(méi)有顯著差異（＞0.05），最高值發(fā)生在2.0 mmol/L谷氨酰胺組。

2.4 谷氨酰胺對(duì)鯉腎臟白細(xì)胞呼吸爆發(fā)、吞噬和增殖活力的影響

從表1可知，注射25、50 mg/kg谷氨酰胺的鯉魚，其呼吸爆發(fā)活力與對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異（＞0.05），注射100、200 mg/kg 谷氨酰胺的鯉魚，其呼吸爆發(fā)活力顯著高于對(duì)照組（＜0.05）。

表1 谷氨酰胺對(duì)鯉魚腎臟白細(xì)胞呼吸爆發(fā)、吞噬和增殖活力的影響

注：表中小寫字母表示＝0.05水平上差異顯著

在吞噬活力中，各組間均存在顯著差異（＜0.05），最高值出現(xiàn)在200 mg/kg組。在增殖活力中，25 mg/kg谷氨酰胺組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（＞0.05），50、100、200 mg/kg谷氨酰胺處理組增殖能力均顯著高于對(duì)照組（＜0.05），最高值出現(xiàn)在200 mg/kg處理組。由表1可以看出，鯉魚腎臟白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力、吞噬和增殖能力均隨注射谷氨酰胺濃度的增高而增高。

3 討論

3.1 谷氨酰胺對(duì)鯉腎臟白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的影響

呼吸爆發(fā)是組織在重新獲得氧供應(yīng)的短時(shí)間內(nèi)，激活的中性粒細(xì)胞耗氧量顯著增加，產(chǎn)生大量氧自由基，是在細(xì)胞發(fā)揮免疫作用中，病原微生物被吞噬后，免疫細(xì)胞的一種氧依賴的殺傷機(jī)制。體外試驗(yàn)表明，添加了谷氨酰胺各個(gè)組鯉腎臟白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力都比未添加谷氨酰胺的對(duì)照組有不同程度的提高，體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果也表明，隨著谷氨酰胺濃度的增加，白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力顯著提高。因此，無(wú)論是在培養(yǎng)基中添加還是體內(nèi)注射谷氨酰胺都有助于鯉白細(xì)胞產(chǎn)生NO，進(jìn)而刺激超氧陰離子的產(chǎn)生，提高呼吸爆發(fā)活力。有研究表明，在飼料中補(bǔ)充適當(dāng)?shù)墓劝滨０纺芴岣呤戎行粤＜?xì)胞的氧化自由基（NBT）和巨噬細(xì)胞超氧陰離子的產(chǎn)生[8]，大量自由基能夠殺死吞入胞內(nèi)的病原，細(xì)胞的吞噬和殺菌能力也增強(qiáng)，從而提高細(xì)胞的免疫力。這一試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相符，相似的結(jié)果也在斑點(diǎn)叉尾鮰[10]上得到驗(yàn)證。

3.2 谷氨酰胺對(duì)鯉腎臟白細(xì)胞吞噬活力的影響

吞噬細(xì)胞的吞噬作用是魚類最重要的非特異性免疫反應(yīng)，在免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用。白細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞起著吞噬細(xì)菌、預(yù)防疾病的作用。有研究表明，谷氨酰胺為哺乳動(dòng)物吞噬細(xì)胞提供能量ATP，為細(xì)胞合成DNA和mRNA提供嘌呤、嘧啶、核苷酸生物合成的前體物質(zhì)，谷氨酰胺還能合成精氨酸，精氨酸的代謝產(chǎn)物NO在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[1]。在本研究中，補(bǔ)充谷氨酰胺后，白細(xì)胞的吞噬活力顯著提高，這一結(jié)論和在斑點(diǎn)叉尾鮰[10]和牙鲆[11]上的研究結(jié)果相同。體外試驗(yàn)中，隨著谷氨酰胺濃度的升高，白細(xì)胞的吞噬活力趨于穩(wěn)定，與在體內(nèi)的研究結(jié)果略有不同，有研究表明，高劑量胞外谷氨酰胺會(huì)干擾內(nèi)皮細(xì)胞和吞噬樣細(xì)胞系NO的產(chǎn)生[12]，所以，隨著谷氨酰胺濃度的進(jìn)一步升高，白細(xì)胞的吞噬、呼吸爆發(fā)活力和增殖能力可能不會(huì)進(jìn)一步提高，反而得到抑制，但仍需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

3.3 谷氨酰胺對(duì)鯉腎臟白細(xì)胞增殖的影響

研究表明，谷氨酰胺可促使哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的有絲分裂和分化增殖[1]。也有研究表明，谷氨酰胺可作為魚類免疫系統(tǒng)細(xì)胞代謝的燃料[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是體外試驗(yàn)還是體內(nèi)試驗(yàn)，添加谷氨酰胺后，白細(xì)胞的增殖效果得到顯著提高，這一結(jié)果與在斑點(diǎn)叉尾鮰[10]、石斑魚[13]、鯉魚[14]上的研究結(jié)果相似，但在虹鱒[15]和鯛魚[16]上的研究中表明，在沒(méi)有谷氨酰胺的情況下，細(xì)胞依然增殖良好。不同的試驗(yàn)結(jié)果與試驗(yàn)動(dòng)物的種類有關(guān)，尤其是谷氨酰胺在水產(chǎn)動(dòng)物上的研究還處于初級(jí)階段，谷氨酰胺作為哺乳動(dòng)物必需的細(xì)胞能量供體，在魚類上是否有類似效果還需進(jìn)行深入探討。

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Effects of Glutamine on Immunity of CarpandExperiments

LEI Wu-chang，LI Jin，SUN Ying，QU Mu，LI Jing-hui，CHENG Zhen-yanCorresponding Author

（Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture，College of Fishery Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

This experiments were conducted to evaluate the effects of glutamine on the immune responses of kidney leukocytes in common carp. Five different groups were formulated by supplementing 0，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L glutamine into the basal culture medium. After the leukocytes were cultured 2，6，12，24 h，the respiratory burst activity of leukocytes were determined，respectively. The results showed that with glutamine supplemented into the culture medium，respiratory burst activity of leukocytes significantly improved and with prolongation of culture time and respiratory burst activity increased firstly（＜0.05），and then decreased. The peak occurred in 2.0 mmol/L glutamine group at 12 h. And then，leukocyte phagocytic activity was determined after cultured for 12 h and 24 h. The phagocytic activity change trend was similar with respiratory burst activity，the highest value occurred in 1.5 mmol/L glutamine group at 24 h. And no significant differences were found in 1.0，1.5， 2.0 mmol/L glutamine group，but the killing ability of leukocytesin these three groups were significantly higher than that in basal group and 0.5 mmol/L glutamine group（＜0.05）.experiment，the average weight 37 g carp were divided into 5 groups. 0，50，100，150，200 mg/kg glutamine were injected to five different group. Then，fish was fed commercial diet for 2 weeks. Results demonstrated that with the increasing concentration of glutamine the kidney leukocyte respiratory burst and phagocytosis activity significantly increased firstly（＜0.05），and then leveled off，while the proliferation activity kept increased significantly（＜0.05）. The results of this experiment indicate that glutamine is the effective immunomodulatory in carp leukocytes.

; glutamine; phagocytosis; respiratory burst; proliferation

S963.71

A

1008-5394（2016）03-0035-04

2015-12-14

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目“研究離體條件下谷氨酰胺對(duì)石斑魚體細(xì)胞免疫力的影響”（11-D-3）

雷五長(zhǎng)（1988-），男，福建三明人，學(xué)士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究。E-mail：leiwuchangnumber@163.com。

程鎮(zhèn)燕（1981-），女，山東泰安人，副教授，博士，研究方向?yàn)轸~類營(yíng)養(yǎng)生理與免疫。E-mail：chengzhenyan2005@126.com。