解淀粉芽孢桿菌LJ02抑菌氣體分析

郝象瑢，盧志軍，王婧，李娟，王遠(yuǎn)宏,通信作者

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解淀粉芽孢桿菌LJ02抑菌氣體分析

郝象瑢1，盧志軍2，王婧1，李娟1，王遠(yuǎn)宏1,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津300384；2. 北京市植物保護站，北京100029）

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）探討解淀粉芽孢桿菌（）LJ02菌株在LB固體培養(yǎng)中產(chǎn)生揮發(fā)性氣體的種類，并以5種病原真菌為指示菌，用平板對扣法和分格平板法檢測LJ02菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體的抑菌活性，確定對黑腐皮殼菌（）抑制作用的有效氣體成分。結(jié)果表明：解淀粉芽孢桿菌LJ02產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對多種果類致病菌，特別是對黑腐皮殼菌（）、草莓灰霉病菌（）、棗漿胞病菌（spp.）有顯著抑制效果，抑菌率在50%以上。LJ02菌株在代謝過程中可產(chǎn)生多種揮發(fā)性氣體，其中4-乙基苯酚、2-丙基環(huán)己酮2種氣體對黑腐皮殼菌（）有強烈的抑制效果。

解淀粉芽孢桿菌；揮發(fā)性氣體；氣質(zhì)聯(lián)用

生物防治因其具有專一性強、不易產(chǎn)生抗藥性、無毒、無污染等優(yōu)點，成為重要的病害防治手段。目前用于病害防治的生防菌主要包括直接篩選的真菌、細(xì)菌以及通過自然突變或誘發(fā)突變的無致病力菌株。解淀粉芽孢桿菌作為重要的生防細(xì)菌資源已被廣泛應(yīng)用于果樹病害和水果采后病害的防治。如解淀粉芽孢桿菌X-23能有效控制梨果腐爛菌[1]；解淀粉芽孢桿菌TS-1203可以抑制蘋果腐爛病[2]。微生物在生長代謝過程產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體（volatile organic compounds，VOCs）也是重要的生防因子[3]。Fernando等人最先報道了假單孢屬（）的14種細(xì)菌VOCs的生防能力，其中包括苯并噻唑、環(huán)己醇、正癸、二甲基三硫、2-乙基-1-己醇和壬醛等物質(zhì)，這些氣體可以抑制真菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)[4]；解淀粉芽孢桿菌PPCB004菌株也能夠產(chǎn)生抑制青霉菌的羥基丁酮氣體[5]及防治多種采后病害、維護果實品質(zhì)的甲基環(huán)丙烯氣體[6]；解淀粉芽孢桿菌NJN-6菌株產(chǎn)生的11種VOCs可以完全抑制香蕉枯萎病菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)[7]。

20世紀(jì)80年代中期，國外學(xué)者將拮抗菌用于水果采后保鮮的半商業(yè)化試驗。利用微生物產(chǎn)生的抗生素、細(xì)菌素、溶菌酶、蛋白酶、過氧化氫和有機酸等次級代謝產(chǎn)物抑制或殺死果蔬中的病原菌；或通過拮抗菌與病原微生物爭奪競爭位點，來阻止水果儲存期間中VC、糖含量以及SOD活力的下降[8]。研究表明，VOCs還可用于水果保鮮，目前廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的VOCs多數(shù)為植物精油提取物，如肉桂精油[9]、丁香提取物[10]等。

本文對本實驗室于2008年從黃瓜根際土壤中分離出的一株解淀粉芽孢桿菌——LJ02菌株進(jìn)行研究，通過試驗驗證LJ02菌株代謝產(chǎn)生的VOCs對病原真菌的抑制作用、VOCs的組成成分及其各組分的抑菌能力，以期為開發(fā)生物農(nóng)藥、水果生物保鮮劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水果腐爛病原真菌：黑腐皮殼菌（、草莓灰霉（）、棗漿胞病（spp.）、棗黑點病菌（）、草莓根腐病菌（）均保存于天津農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室。

1.2 供試材料

PDA培養(yǎng)基：用于真菌培養(yǎng)及抑菌活性檢測；LB培養(yǎng)基：用于解淀粉芽孢桿菌LJ02的培養(yǎng)與保存；11種VOCs標(biāo)品（均能很好的溶于乙醇）購于上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 LJ02菌株產(chǎn)VOCs的抑菌活性評價

抑菌活性測定采用平板對扣法[11]。在PDA培養(yǎng)基中接入各類病原菌餅（Φ＝5 mm），取100 μL LJ02發(fā)酵液均勻涂布于LB平板，將其倒扣于病菌培養(yǎng)皿上，并用透明膠帶密封，置于26 ℃培養(yǎng)5 d，十字法測量病原菌菌落直徑，計算解淀粉芽孢桿菌TJ02揮發(fā)性氣體對病原真菌的抑菌率。以不接LJ02的LB平板為對照。

抑菌率＝（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.4 氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析LJ02菌株VOCs成分

將SPME萃取頭（50/30 μm，DVB/CAR/ POMS，美國Supelco公司）在40 ℃下平衡15 min后，插入頂空萃取瓶中，拔出纖維頭，使其置于樣品瓶頂空部位的中間部位。吸附40 min后，收回纖維頭，將萃取頭立即插入GC色譜儀的進(jìn)樣口中，在250 ℃下解吸附5 min后，進(jìn)行GC-MS分析。

氣質(zhì)聯(lián)用儀型號：Agilent 7890A/5975C。用HP-5MS型毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）分離VOCs，進(jìn)樣口溫度：250 ℃，載氣：氮氣。柱流速1.2 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL，不分流進(jìn)樣。升溫程序：40 ℃維持3 min，再以3 ℃/min的速率升溫至160 ℃保持2 min，再以8 ℃/min升至220 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；電子轟擊EI源，電子能量70 eV，全掃描質(zhì)譜范圍（m/z）為：20～420 u（atomic mass unit，原子質(zhì)量單位）。數(shù)據(jù)分析與處理采用計算機自動譜庫NIST08自動檢索，將對照組檢測到的峰圖進(jìn)行扣除，對氣體成分進(jìn)行分析。

1.5 LJ02菌株產(chǎn)生的VOCs抑菌機制

1.5.1 LJ02菌株產(chǎn)生的VOCs主要成分抑菌檢測

對LJ02菌株產(chǎn)生的VOCs進(jìn)行分析，選擇11種氣體標(biāo)品（正辛烷、苯乙烯、2-戊基呋喃、3，5，5-三甲基乙酸己酯、6-甲基-2-庚酮、2-丙基環(huán)己酮、癸醚、4-乙基苯酚、二丁基羥基甲苯、2-戊基噻吩、甲苯）進(jìn)行抑菌活性測定。具體操作如下：在PDA平板中央接種黑腐皮殼菌餅（Φ＝5 mm），距離菌餅15 mm處放置滅菌硬幣（1角），其上有滅菌濾紙片（Φ＝8 mm），在濾紙片上加入50 μL氣體標(biāo)品（標(biāo)品濃度），對照組取50 μL乙醇。在26 ℃條件中培養(yǎng)5 d后，測量菌落的直徑，判定這11種氣體對黑腐皮殼菌是否有抑制作用，計算抑菌率。

1.5.2 主要抑菌氣體的作用濃度檢測

采用分格平板法檢測。分格培養(yǎng)皿左側(cè)鋪滿PDA培養(yǎng)基，中央接種黑腐皮殼菌菌餅（Φ＝ 5 mm），右側(cè)放置滅菌的濾紙片，將對黑腐皮殼菌有明顯抑制作用的2種氣體標(biāo)品，設(shè)置不同梯度各取50 μL加到濾紙片上。其中，4-乙基苯酚的濃度梯度為1.3、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL；2-乙基環(huán)己酮濃度梯度為1、200、400、600、800 μL/mL；對照組加入50 μL乙醇。放置于24 ℃下培養(yǎng)，3 d后測量病原菌的直徑，計算抑制率。

1.5.3 人工混合抑菌氣體的作用濃度檢測

將有抑制作用的2種揮發(fā)性氣體按照GC-MS測定出來的峰面積比，進(jìn)行人工合成混合性抑菌氣體（4-乙基苯酚∶2-乙基環(huán)己酮＝1∶32）。在二分格培養(yǎng)皿的左側(cè)鋪滿PDA 培養(yǎng)基，中央接種黑腐皮殼菌菌餅（Φ＝5 mm），右側(cè)放置滅菌的濾紙片，分別加入50 μL混合性揮發(fā)性物質(zhì)，體積濃度梯度分別為0、50、100、150、200、250、300 μL/mL，放置在26 ℃下培養(yǎng)觀察。3 d后測量菌落的直徑，計算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 LJ02菌株產(chǎn)生VOCs抑菌能力檢測結(jié)果

LJ02菌株產(chǎn)生VOCs對5種病原真菌均有抑制效果，對黑腐皮殼菌、草莓灰霉病菌、棗漿胞病抑制效果顯著，抑菌率在50%以上（表1）。

表1 LJ02產(chǎn)生VOCs對病原真菌的抑制作用

2.2 GC-MS對LJ02菌株產(chǎn)生VOCs的鑒定

由LJ02菌株產(chǎn)生VOCs的總離子流圖（圖1）表明，該菌株可產(chǎn)生34種揮發(fā)性物質(zhì)（峰面積＞1），主要有：苯類、烷類、烯類、呋喃類、醇類、酸類、酮類、酯類等。從每一類物質(zhì)中選取可能具有抑制作用的11種氣體進(jìn)行后續(xù)抑菌能力檢測，這11種氣體種類及出峰時間如下：甲苯（2.998 min）、正辛烷（4.586 min）、苯乙烯（8.741 min）、2-戊基呋喃（12.719 min）、6-甲基-2-庚酮（11.352 min）、2-乙基環(huán)己酮（16.663 min）、4-乙基苯酚（17.562 min）、乙酸-3，5，5-三甲基己酯（18.496 min）、癸醚（23.651 min）、2-戊基噻吩（25.839 min）、二丁基羥基甲苯（27.728 min）。

2.3 各種揮發(fā)性氣體的抑菌活性

通過對上述11種揮發(fā)性成分的抑菌效果測定，發(fā)現(xiàn)正辛烷、苯乙烯、2-戊基呋喃、3，5，5-三甲基乙酸己酯、6-甲基-2-庚酮、癸醚、2-戊基噻吩、二丁基羥基甲苯和甲苯9種氣體均不能有效抑制黑腐皮殼菌（的生長；4-乙基苯酚、2-丙基環(huán)己酮2種氣體對黑腐皮殼菌（有強烈的抑制效果，其對黑腐皮殼菌的抑菌活性如表2和表3所示。由表2可知，4-乙基苯酚用量為10 mg時，抑菌率可達(dá)92.58%。由表3可知，當(dāng)?shù)渭?00 μL 800 μL/mL的2-丙基環(huán)己酮時，抑菌率可達(dá)94.39%。

表2 4-乙基苯酚對黑腐皮殼菌的抑制作用

注：不同字母代表差異顯著（＜0.05），下同

表3 2-丙基環(huán)己酮對黑腐皮殼菌的抑制作用

2.4 人工合成的混合揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性

黑腐皮殼菌正常生長時，菌絲細(xì)長，透明，節(jié)點明顯。當(dāng)有抑菌物質(zhì)產(chǎn)生作用時，菌絲彎曲，淺棕色，節(jié)點模糊，節(jié)間距離增長（圖2）。將4-乙基苯酚、2-丙基環(huán)己酮2種物質(zhì)按照GC-MS測定的峰面積比例（1:32）混合，用不同濃度處理黑腐皮殼菌，26 ℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果如表4所示。當(dāng)濃度為450 μL/mL時，能完全抑制黑腐皮殼菌菌絲的生長。

圖2 混合氣體對黑腐皮殼菌菌絲的抑制

（注：左圖為對照組，右圖為處理組）

表4 人工合成的揮發(fā)性氣體對黑腐皮殼菌的抑制作用

3 討論

隨著收集方法、檢測手段的完善以及物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究水平的提高，芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的生防功能愈加明確。利用GC-MS是研究檢測揮發(fā)性油脂和生物代謝產(chǎn)生VOCs最常用的方法，該方法具有高度的靈敏性和抗干擾能力，可以快速直接鑒定混合氣體中已知化合物的種類和結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測、環(huán)境和生物分析中[12]。本文通過GC-MS分析得出，解淀粉芽孢桿菌LJ02菌株在代謝過程中可產(chǎn)生34種VOCs。

芽孢桿菌次級代謝過程中產(chǎn)生的VOCs具有顯著的抑菌能力。Chaurasia發(fā)現(xiàn)一株拮抗枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的VOCs能導(dǎo)致病原真菌菌絲和孢子的畸形[13]；枯草芽孢桿菌JA菌株產(chǎn)生的VOCs對灰霉病原菌孢子及菌絲生長有明顯抑制作用[14]；CL-8芽孢桿菌產(chǎn)生的VOCs對立枯絲核菌（）有抑制作用[15]。本文通過平板倒扣法得出，LJ02菌株產(chǎn)生的VOCs對5種病原真菌均有抑制作用，特別是對黑腐皮殼菌、草莓灰霉病菌、棗漿胞病的抑制效果顯著，抑菌率在50%以上；由對峙培養(yǎng)結(jié)果分析，4-乙基苯酚、2-丙基環(huán)己酮這2種成分可能是菌株LJ02抑菌活性最重要的抑菌氣體成分，其他成分雖然沒有直接的抑菌能力，但不排除其具有對靶標(biāo)菌抑菌能力的協(xié)同增效作用，具體情況還需進(jìn)行后續(xù)試驗研究。

另外，將抑菌氣體用于水果保鮮是一種新型的保鮮機制。采后水果仍在繼續(xù)生命代謝活動，產(chǎn)生的乙烯會加速果實的后熟與腐爛，縮短保質(zhì)期[16]。因此，抑制其呼吸作用將利于貯藏期水果的新鮮度[17]。氣調(diào)保鮮包裝通過改變包裝盒內(nèi)的氣體組成來抑制果蔬的新陳代謝速度和微生物的生長，從而延長果實的貯藏期[18]。其中，Almenar等人發(fā)現(xiàn)，將不同濃度的2-壬酮充入氣調(diào)袋中可以明顯抑制灰霉菌的生長[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，LJ02菌株在代謝過程中產(chǎn)生的4-乙基苯酚、2-丙基環(huán)己酮兩種揮發(fā)性氣體均對黑腐皮殼菌有抑制效果，且混合型氣體按照峰面積比例混合后，僅需450 μL/mL便可完全抑制該病原的生長。未來可利用該混合氣體的抑菌特性，將這兩種氣體與不同的氧氣、二氧化碳和氮氣混合充入調(diào)節(jié)包裝內(nèi)進(jìn)行氣調(diào)保鮮，從而抑制采后水果保藏期間致病微生物的生長。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅萍. 梨儲藏期病害生防菌及防腐保鮮的研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2]陳臻. 兩株生防菌株對蘋果樹腐爛病菌拮抗作用的研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[3] 張鵬鵬. 幾株植物根際促生細(xì)菌釋放的揮發(fā)性物質(zhì)對擬南芥及病原菌的影響[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[4] Fernando W G D，Ramarathnam R，Krishnamoorthy A S，et al. Identification and use of potential bacterial organic antifungal volatiles in biocontrol[J].，2005，37（5）：955-964.

[5] Arrebola E，Jacobs R，Korsten L. Iturin A is the principal inhibitor in the biocontrol activity of，PPCB004 against postharvest fungal pathogens[J].，2010，108（2）：386-395.

[6] Osman M S，Sivakumar D，Korsten L. Effect of biocontrol agentand 1-methyl cyclopropene on the control of postharvest disease and maintenance of fruit quality[J].，2011，30（2）：173-178.

[7] Yuan J，Raza W，Shen Q，et al. Antifungal activity of Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 volatile compounds againstf. sp.[J].，2012，78（16）：5942-5944.

[8]勵建榮，朱丹實. 果蔬保鮮新技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報，2012，31（4）：337-347.

[9]薛瓊，劉躍軍，向賢偉，等. 肉桂精油微囊化及其在果蔬保鮮中的應(yīng)用[J]. 包裝工程，2016（5）：50-54.

[10]閆訓(xùn)友，杜洪利，朱愛紅，等. 丁香提取物對鮮切鴨梨保鮮效應(yīng)的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2016（4）：347-350.

[11]Leelasuphakul W，Hemmanee P，Chuenchitt S. Growth inhibitory properties of，strains and their metabolites against the green mold pathogen（Sacc.）of citrus fruit[J].，2008，48（1）：113-121.

[12]陳曉水，侯宏衛(wèi)，邊照陽，等. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 質(zhì)譜學(xué)報，2013，34（5）：308-320.

[13] Chaurasia B，Pandey A，Palni L M，et al. Diffusible and volatile compounds produced by an antagonisticstrain cause structural deformations in pathogenic fungi in-vitro[J].，2005，160（1）：75-81.

[14]陳華，鄭之明，余增亮. 枯草芽孢桿菌JA脂肽類及揮發(fā)性物質(zhì)抑菌效應(yīng)的研究[J]. 微生物學(xué)通報，2008，35（1）：1-4.

[15]吳艷，閆豫君，趙思峰，等. 組合芽孢桿菌抑菌物質(zhì)特性及其抑菌效果研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，16（5）：266-270.

[16] Sisler E C，Serek M. Compounds controlling the ethylene receptor[J].，1999，40（1）：1-7.

[17] Kittur F，Saroja N，Habibunnisa，et al. Polysaccharide- based composite coating formulation for shelf life extension of fresh banana and mango[J].，2001，213（4）：306-311.

[18]李家政. 果蔬自發(fā)氣調(diào)包裝原理與應(yīng)用[J]. 包裝工程，2011（15）：33-38.

[19] Almenar E，Del V V，Catala R，et al. Active package for wild strawberry fruit（L.）[J].，2007，55（6）：2240-2245.

Study on Volatile Organic CompoundsInhibition ofLJ02

HAO Xiang-rong1, LU Zhi-jun2, WANG Jing1, LI Juan1, WANG Yuan-hong1,Corresponding Author

（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Beijing Plant Protection Station, Beijing 100029, China）

The paper used GC-MS to identify the kinds of volatile products in LB solid-state cultivation ofLJ02, and took 5 kinds of pathogenic fungi as indicator bacteria with two-sealed-base-plates method and two compartment plate method to detect the antibacterial activity of volatile gas produced by LJ02 strain and determined which active gas ingredients had inhibitionwith. The results showed that the volatile products in LB solid state cultivation ofLJ02 had significant inhibitory effect on most of the fruit-causing fungus, especially,andspp., the inhibitory rate reaching above 50%.LJ02 in metabolic process can produce a variety of volatile gases, including 4-ethylphenol, 2-propylcyclohexanone have strong inhibitory effect on.

;volatile organic compounds; GC-MS

S432.1

A

1008-5394（2016）03-0023-04

2016-05-03

國家自然科學(xué)基金項目“葡萄根癌病生防菌E26中雙組分雜合組氨酸激酶AvhS的生防功能解析”（31171892）

郝象瑢（1990-），女，山西孝義人，碩士在讀，主要從事植物病害生物防治和生防微生物分子生物學(xué)研究。E-mail：haoxiangrong0505@163.com。

王遠(yuǎn)宏（1974-），男，河南鄭州人，教授，博士，主要從事植物病害生物防治和生防微生物分子生物學(xué)研究。E-mail：wangyh@tjau.edu.cn。