急性飲酒對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)鋒電位的影響*

俞荷娟，張雅檬，張言，錢志余，陶玲，李韙韜

（南京航空航天大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院，南京210006）

1 引 言

酒精（乙醇）是一種親神經(jīng)的麻醉劑，慢性酗酒和暴飲性飲酒均可引起腦損傷，過去幾十年有關(guān)酒精導(dǎo)致腦損傷的研究[1-3]多集中在慢性酗酒引起酒精中毒，比如酒精濫用和酒精依賴等。Oscar等認(rèn)為[4-5]酒精在細(xì)胞水平上以各種方式直接影響神經(jīng)系統(tǒng)尤其是大腦的功能，一次大量飲酒導(dǎo)致急性酒精中毒導(dǎo)致的急性腦損傷具有獨(dú)特的生物化學(xué)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化[6-7]。海馬是人類與哺乳動(dòng)物大腦都存在的重要腦區(qū)，長(zhǎng)期研究結(jié)果表明，海馬腦區(qū)與學(xué)習(xí)、記憶、空間定位等功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一次性大量飲酒可以導(dǎo)致小鼠大腦氧自由基相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物水平的變化，表現(xiàn)為降低降解自由基酶的活力和升高氧自由基的水平，從而可能造成腦損傷[8-9]。

鋒電位（Spike）是細(xì)胞外記錄到的神經(jīng)元單細(xì)胞動(dòng)作電位。神經(jīng)元是神經(jīng)活動(dòng)的最基本單位，且大多數(shù)神經(jīng)元之間通過鋒電位的發(fā)放進(jìn)行信息的交流和傳遞[10]。神經(jīng)系統(tǒng)中，由于動(dòng)作電位（即鋒電位）的發(fā)放有或無、傳輸無衰減的數(shù)字信號(hào)特性，神經(jīng)元通過對(duì)鋒電位進(jìn)行編碼來表征信息，如發(fā)放速率，發(fā)放間隔等。在腦功能（知覺，運(yùn)動(dòng)）方面，鋒電位的發(fā)放模式與行為密切相關(guān)。此外，鋒電位的發(fā)放紊亂也會(huì)導(dǎo)致腦部的一些疾?。òd癇，抑郁癥等）。因此，研究神經(jīng)元的鋒電位發(fā)放是研究神經(jīng)系統(tǒng)信息處理機(jī)制的關(guān)鍵。

隨著人們對(duì)大腦的認(rèn)識(shí)越來越深入，各種研究方式和手段也在不斷的進(jìn)步。其中電生理技術(shù)的應(yīng)用，便為許多腦神經(jīng)活動(dòng)的研究提供了重要的依據(jù)。為了獲取信息在神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中的時(shí)間空間響應(yīng)模式，必須要使用高分辨率的檢測(cè)技術(shù)。胞外記錄是目前從活體動(dòng)物的神經(jīng)組織中獲得這種精確信息的最好工具[11]。通過置于神經(jīng)元細(xì)胞體附近的電極，可以獲得時(shí)間分辨率為毫秒精度的動(dòng)作電位發(fā)放信息，具有高時(shí)間空間分辨率的特點(diǎn)。此外，通過植入大量電極，在不對(duì)組織造成很大傷害的情況下，還能夠獲得一定空間范圍內(nèi)數(shù)百個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)變化規(guī)律。

本研究通過在麻醉狀態(tài)下的小鼠海馬CA1區(qū)植入記錄電極，穩(wěn)定采集并記錄到較長(zhǎng)時(shí)間、較為穩(wěn)定的微幅級(jí)鋒電位信號(hào)，并使用神經(jīng)電信號(hào)分析軟件對(duì)急性飲酒前和急性飲酒后的鋒電位進(jìn)行了放電頻率、鋒電位發(fā)放時(shí)間間隔等多項(xiàng)指標(biāo)的分析。本研究觀察小鼠急性飲酒前及急性飲酒后神經(jīng)元在放電頻率、峰間期（ISI）等方面的變化，描述并分析此變化過程中小鼠海馬區(qū)神經(jīng)電信號(hào)的特征差異。

2 材料與方法

2.1 材料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：16只ICR小鼠，體質(zhì)量25～35 g，清潔級(jí)，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：微電極；多通道神經(jīng)信號(hào)采集系統(tǒng)（Cerebus，Blackrock公司），包括前置放大器（headstage）、Front-end放大器模塊、信號(hào)處理器及操作計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)與信號(hào)處理器間通過網(wǎng)絡(luò)相互通訊；腦立體定位儀（ZH-藍(lán)星B，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；5%水合氯醛。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）動(dòng)物手術(shù)：利用ICR小鼠16只，隨機(jī)分成2組（n＝8）：急性飲酒組（P組）和生理鹽水組（C組）。將小鼠稱重，按45 mg／（100 g體重）計(jì)量腹腔注射復(fù)合麻醉劑，待完全麻醉后臥姿固定四肢及頭部在小鼠腦立體定位儀上，切開頭部皮膚，除去部分顱骨。將記錄電極經(jīng)大腦皮層插入海馬CA1區(qū)，定位是前囟后1.8 mm，旁開1.5 mm，由大腦皮層表面向下約2 mm，放好參考電極和接地電極。上下微調(diào)記錄電極的位置，直到記錄到明顯的鋒電位信號(hào)為止。

（2）小鼠海馬區(qū)鋒電位（Spike）的采集記錄：設(shè)置信號(hào)采集處理系統(tǒng)Cerebus的各項(xiàng)參數(shù)[12]：以采樣率為30 Khz進(jìn)行原始數(shù)據(jù)采集，調(diào)整采樣率為2 Khz得到LFPs；再選擇250～7 500 Hz帶通濾波，設(shè)定閾值為-5.00 RMS增益，選取信噪比超過1.5的鋒電位認(rèn)定為每個(gè)細(xì)胞外神經(jīng)點(diǎn)位，即為鋒電位Spikes。邊觀察采樣窗口掃描波形，邊適當(dāng)調(diào)整記錄電極尖端深度，直至采樣記錄窗口出現(xiàn)的放電波形大于閾電位、利用采樣記錄軟件可選擇的色標(biāo)，將多種記錄波形以不同顏色加以區(qū)分，同時(shí)在記錄窗口的各子窗口將不同的疊加波形分別顯示。實(shí)時(shí)觀察采樣電信號(hào)的信噪比（signal noise ratio，SNR）大小，當(dāng)SNR值大于1.5且較穩(wěn)定后采集記錄神經(jīng)放電信號(hào)。以時(shí)間長(zhǎng)度每300 s為一采集記錄單位，按照系統(tǒng)設(shè)定的存儲(chǔ)文件格式存檔以作進(jìn)一步離線分析。采用趾的刺激反射（趾蹼反射）和角膜反射判斷大鼠麻醉及復(fù)蘇狀態(tài)，然后分別在小鼠復(fù)蘇后急性飲酒前以及急性飲酒后 0、20、40、60、80 min記錄小鼠海馬區(qū)神經(jīng)電信號(hào)，每次實(shí)驗(yàn)記錄5 min，其中急性飲酒量為1.5 g／（kg體重）。

（3）神經(jīng)電信號(hào)分析：采用信號(hào)分析處理軟件wave clus和NeuroExplorer分析存儲(chǔ)的放電信號(hào)文件，比較急性飲酒前和急性飲酒后 0、20、40、60、80 min小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元鋒電位在放電頻率、ISI等方面的差異。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計(jì)，比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

圖1 （a）電極在海馬區(qū)中的植入位置（b）電極插入照片F(xiàn)ig 1 （a）position of the electrodes implanted in the hippocam pus（b）picture of inserted electrode

4.1 電極擺放的解剖學(xué)位置

海馬CA1區(qū)定位是前囟后1.8 mm，旁開1.5 mm，由大腦皮層表面向下約2 mm。圖1（a）是電極在海馬區(qū)中的植入位置，圖1（b）是實(shí)驗(yàn)中電極插入小鼠海馬區(qū)照片。

4.2 8通道的原始信號(hào)

圖2是記錄到的海馬區(qū)神經(jīng)元鋒電位發(fā)放光柵圖，圖中每條短線代表一次鋒電位發(fā)放。

圖2 海馬區(qū)神經(jīng)元鋒電位發(fā)放原始信號(hào)光柵圖A、B、C、D、E、F分別代表飲酒前、飲酒后0、20、40、60、80 min。Fig 2 Raster p lots of spikes distributed by hippocam pal neuronsA，B，C，D，E，F(xiàn)，respectively，on behalf of the time before drinking，0，20，40，60，80min after drinking

4.3 小鼠蘇醒時(shí)及急性飲酒后神經(jīng)元自發(fā)放電信號(hào)特征差異比較

運(yùn)用神經(jīng)信號(hào)分析軟件Neuro Explorer分析發(fā)現(xiàn)，P組與C組比較，在每個(gè)時(shí)間段，P組平均放電率小于C組平均放電率（P組平均放電率依次為：1±0.32、0.48±0.14、0.13±0.09、0.54±0.17、0.82±0.26、0.93±0.29，C組平均放電率依次為：1±0.3、0.81±0.21、0.86±0.18、0.91±0.15、0.94±0.23、0.96±0.21）；P組小鼠在急性酒精注射后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電減小，20 min左右放電率最低，并且急性飲酒后平均放電率遠(yuǎn)小于急性飲酒前（清醒狀態(tài)）；并且隨著時(shí)間的推移，神經(jīng)元在單位時(shí)間內(nèi)放電在逐漸增加（復(fù)蘇狀態(tài)），1 h后慢慢恢復(fù)，即小鼠急性飲酒前后神經(jīng)元放電頻率存在明顯差異（見圖3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 鋒電位平均放電率曲線圖Fig 3 M ean firing rate of spikes

急性飲酒前，神經(jīng)元電信號(hào)以串的形式呈有節(jié)律的陣發(fā)性發(fā)放（圖4A，圖4為一只老鼠的ISI變化圖）。隨著飲酒后時(shí)間的增加，小鼠海馬CA1區(qū)自發(fā)放電有越來越多的脈沖出現(xiàn)在串脈沖之外，漸呈彌散性發(fā)放（圖4B、4C），全時(shí)長(zhǎng)的自發(fā)放電頻率均小于飲酒前狀態(tài)。急性飲酒前的小鼠ISI值較為集中（清醒狀態(tài)）（圖4A），急性飲酒后的小鼠ISI值較為分散（圖4B、4C、4D），并隨著時(shí)間的推移，ISI值逐漸變得集中（復(fù)蘇狀態(tài)，見圖4E、4F）。

圖4 急性飲酒前后ISI變化圖A、B、C、D、E、F分別代表飲酒前、飲酒后0、20、40、60、80 minFig 4 Changes of ISI before and after acute alcohol consumptionA，B，C，D，E，F(xiàn) were on behalf of the time before drinking and 0，20，40，60，80 min after drinking

5 討論

有關(guān)酒精導(dǎo)致腦損傷的研究很多都集中在慢性酗酒引起酒精中毒，比如酒精濫用和酒精依賴等。而有關(guān)酒精導(dǎo)致腦損傷在急性飲酒方面的研究大都集中在生理層面[13]，比如進(jìn)行離體腦片和急性飲酒對(duì)鼠腦損傷標(biāo)志物的影響等。本研究著力于從電生理角度在體測(cè)量小鼠腦電信號(hào)，研究急性飲酒前后小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元放電特征差異。

本研究的前期工作已穩(wěn)定地采集記錄到小鼠急性飲酒前后、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的放電信號(hào)，并對(duì)測(cè)得的信號(hào)進(jìn)行了放電頻率等指標(biāo)的分析。為了探索急性飲酒前后小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電特征是否存在差異，本實(shí)驗(yàn)采用單次大量酒精腹腔注射作為急性飲酒的動(dòng)物模型，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。選用該動(dòng)物模型除了操作簡(jiǎn)單易行以外，單次大量酒精腹腔注射更與現(xiàn)實(shí)人們偶爾飲酒過量這種情況相似[14]。大多數(shù)人認(rèn)為偶爾急性飲酒可能對(duì)身體一般機(jī)能有些影響，但不會(huì)對(duì)記憶造成大的影響。這正是本研究要強(qiáng)調(diào)的即使是一次急性飲酒也會(huì)對(duì)大腦記憶能力產(chǎn)生損害[15]。

本研究表明，急性腹腔注射酒精后的小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電減少，20 min左右放電率最低，遠(yuǎn)小于急性飲酒前；并且隨著時(shí)間的推移，神經(jīng)元放電在逐漸增加，一個(gè)小時(shí)之后慢慢恢復(fù)。急性飲酒后，神經(jīng)元電信號(hào)以串的形式呈有節(jié)律的陣發(fā)性發(fā)放；隨著飲酒后時(shí)間的增加，小鼠海馬CA1區(qū)自發(fā)放電有越來越多的脈沖出現(xiàn)在串脈沖之外，漸呈彌散性發(fā)放，全時(shí)長(zhǎng)的自發(fā)放電頻率均小于飲酒前狀態(tài)。此外，急性飲酒前的小鼠ISI值較為集中，急性飲酒后的小鼠ISI值較為分散，并隨著時(shí)間的推移，ISI值逐漸變得集中。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行的行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[16]。

從生理機(jī)制來看，酒精可以快速通過血液屏障進(jìn)入腦組織中進(jìn)行氧化和非氧化代謝因?yàn)榇竽X有很高的氧代謝率，其對(duì)于由酒精引起的氧化應(yīng)激損傷更為敏感。根據(jù)對(duì)小鼠急性飲酒對(duì)小鼠腦損傷生物標(biāo)志物的影響，一次性大量飲酒就會(huì)誘發(fā)腦組織的氧化應(yīng)激性損傷[8，17-18]，這與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究利用神經(jīng)信號(hào)分析軟件對(duì)電信號(hào)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)急性飲酒前后小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電頻率方面存在差異，急性飲酒對(duì)小鼠記憶功能有著抑制作用，為急性飲酒所致的記憶力損傷的預(yù)防和治療提供了有意義的神經(jīng)電生理依據(jù)。

6 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，急性飲酒組小鼠海馬區(qū)放電率明顯變??；急性飲酒后小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電與急性飲酒前相比，在放電頻率、ISI等神經(jīng)信號(hào)的特征方面存在明顯差異。由此可見，急性飲酒可抑制小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元放電，抑制小鼠記憶功能。