南瓜硒多糖的制備表征及活性分析

商龍臣，吳少魏，張　馳，廖紅華，劉信平，*

（1.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

南瓜硒多糖的制備表征及活性分析

商龍臣1，吳少魏1，張馳2，廖紅華2，劉信平1，*

（1.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

對(duì)南瓜多糖進(jìn)行硒化修飾，并對(duì)南瓜硒多糖的體外抗氧化和抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)等活性進(jìn)行研究。以提取、分離、純化的南瓜多糖為前體物，用Na2SeO3硒化修飾制備南瓜硒多糖，并用紫外光譜、紅外光譜、原子熒光光譜、熱重分析對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，采用鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法、四甲基偶氮唑藍(lán)比色法測(cè)定其清除超氧陰離子自由基（O2-?）、羥自由基（?OH）的能力以及對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明：制備產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中含有Se=O鍵和Se—C鍵，即實(shí)現(xiàn)了南瓜多糖的硒化。南瓜硒多糖對(duì)O2-·、·OH的清除作用顯著強(qiáng)于南瓜多糖，與樣品量呈正相關(guān)；南瓜硒多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)有抑制作用，比南瓜多糖具有更好的抑制效果。

南瓜硒多糖；制備；表征；活性Abstract: Objective: To investigate selenium modification of pumpkin polysaccharide and to evaluate the in vitro antioxidant activity and antitumor effect against human breast cancer MDA-MB-231 cells of the modifi ed polysaccharide. Methods: Pumpkin polysaccharide was prepared and purified and it was modified by reaction with Na2SeO3to obtain selenium-containing polysaccharide. Furthermore， the structure of the modifi ed polysaccharide was characterized through UV， IR， atomic fluorescence spectroscopies and thermogravimetric analysis. Finally， its scavenging effect onand ·OH as well as growth inhibitory effect on breast cancer cells were tested by using pyrogallol autoxidation， salicylic acid method and methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric assay. Results: Se=O and Se-C bonds were observed in the structure of the target product， thus successfully achieving the selenium modification of pumpkin polysaccharide. The selenium-containing pumpkin polysaccharide had signifi cantly stronger scavenging effects onand ·OH than ordinary pumpkin polysaccharide， which were concentration-dependent. Meanwhile， the modifi ed polysaccharide also inhibited the growth of human breast cancer cells in a dose-dependent manner more signifi cantly than did the unmodifi ed one.

元素硒（Se）以其顯著的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等多種生理活性功能，特別是有機(jī)硒化物能有效避免無(wú)機(jī)硒易引起中毒的缺點(diǎn)，備受醫(yī)藥、食品保健等諸多領(lǐng)域普遍關(guān)注。目前，溶解性好、低毒、具有良好抗瘤活性的硒多糖已成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，對(duì)硒多糖的研究已取得了一定進(jìn)展［1-4］，但因天然硒多糖資源緊缺，制約了其開(kāi)發(fā)應(yīng)用，對(duì)植物多糖進(jìn)行硒化修飾是解決該問(wèn)題的有效途徑，當(dāng)前這項(xiàng)研究正處于起步階段，已成功合成了百合、大蒜、黃芪、刺槐、靈芝、枸杞等植物多糖硒酸酯［5-9］。

我國(guó)各地富產(chǎn)南瓜，主供人畜食用，量多、價(jià)低，但也造成了浪費(fèi)量大，經(jīng)濟(jì)利用率低的結(jié)果。目前已有研究證實(shí)南瓜多糖具有抗氧化、降血糖、調(diào)血脂等生理活性［10］。目前針對(duì)南瓜多糖的提取、純化、活性研究較多［11］，如孔倩［12］、孫婕［13］等分別研究了南瓜多糖的硫酸酯化衍生物和磷酸酯化衍生物的制備及抗氧化活性，但對(duì)南瓜多糖的硒化修飾目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)課題組前期研究的優(yōu)化結(jié)果［14-15］，將硒與多糖有機(jī)結(jié)合，以南瓜多糖為前體物，亞硒酸鈉（Na2SeO3）為硒化試劑制備南瓜硒多糖，利用紫外光譜、紅外光譜、熱重分析手段表征目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，并對(duì)其體外抗氧化及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等活性進(jìn)行初步研究，旨在探討硒化修飾對(duì)南瓜多糖活性功能的影響，為進(jìn)一步研究南瓜硒多糖作為抗氧化能力較強(qiáng)的保健食品和抗腫瘤藥品的應(yīng)用奠定必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)促進(jìn)南瓜資源合理深加工，提高其利用效能。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用南瓜為恩施本地產(chǎn)南瓜（Cucurbita moschata Duch.）。

Na2SeO3、VC、鄰苯三酚、苯酚、水楊酸、RPMI-1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國(guó)Sigma公司；系列葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231由湖北民族學(xué)院附屬醫(yī)院提供。所有藥品或試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純。

1.2儀器與設(shè)備

傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)Bruker Optics公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；AFS-9760雙道原子熒光光度計(jì) 北京海光公司；MARS6 全自動(dòng)微波消解儀 美國(guó)CEM公司；HP1100型高壓液相色譜儀 上?；萜展?；DE-6300型綜合熱分析儀 上海弗安公司；MB-Ⅲ型酶標(biāo)儀 上海匯松公司。

1.3方法

1.3.1南瓜硒多糖的制備

前體物的制備［16-18］：以恩施本地產(chǎn)普通南瓜為原材料，通過(guò)提取、分離、脫色、純化等系列工藝得到南瓜多糖。采用苯酚-硫酸法測(cè)得前體物含糖量為61.4%，高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖相對(duì)分子質(zhì)量Mr為15 800，經(jīng)紙層析分析表明其是由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、木糖和D-葡萄糖醛酸（物質(zhì)的量比為0.181∶0.084∶0.071∶0.021∶0.179）組成的酸性雜多糖。

依據(jù)課題組前期研究的優(yōu)化結(jié)果［14-15］進(jìn)行南瓜硒多糖的合成：稱(chēng)取5 g南瓜多糖于500 mL圓底燒瓶，加入250 mL體積分?jǐn)?shù)0.8% HNO3溶解，加入4.0 g Na2SeO3、7.0 g BaCl2，70 ℃磁力攪拌加熱反應(yīng)8 h，冷卻。加入適量無(wú)水Na2SO4，靜置，3 000 r/min 離心15 min，取上清液用Na2SO4檢測(cè)直到無(wú)BaSO4沉淀為止，除去反應(yīng)中的催化劑BaCl2；用無(wú)水Na2CO3調(diào)上清液pH值為7，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，透析至使抗壞血酸不變紅為止，除凈未反應(yīng)完的SeO32-。將產(chǎn)物用4 倍體積的95%乙醇沉淀，冰箱靜置過(guò)夜，過(guò)濾，冷凍干燥，即得到南瓜硒多糖。

1.3.2南瓜硒多糖含量的測(cè)定及結(jié)構(gòu)表征

以紫外光譜、紅外光譜和熱重分析法對(duì)南瓜硒多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，雙道原子熒光光譜測(cè)定產(chǎn)物的硒含量。并且在將目標(biāo)產(chǎn)物放置3 個(gè)月后，重復(fù)紫外光譜、紅外光譜和原子熒光光譜掃描，考察其穩(wěn)定性。

紫外光譜掃描：稱(chēng)取0.1 g樣品，微波消解，冷卻定容至25 mL，參比用Na2SeO3質(zhì)量濃度為0.1 g/L。在5 mL消化液和Na2SeO3中分別加入加8 mL 0.1 g/L鄰苯二胺溶液，陰暗處?kù)o置反應(yīng)50 min，各加入10 mL甲苯萃取，振蕩3 min靜置。取甲苯萃取后的上層溶液，以甲苯為參比，用石英比色皿在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

紅外光譜掃描：用KBr壓片法測(cè)定樣品的紅外光譜。

原子熒光光譜掃描：取0.1 g樣品，微波消解，用雙道原子熒光光譜掃描測(cè)定硒含量。

熱重分析：采用熱分析儀，在氧化鋁坩鍋中裝入樣品3.00 mg，程序升溫速率10 ℃/min，掃描溫度范圍：50～800 ℃，靜態(tài)空氣氛圍，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.3南瓜硒多糖體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

以未修飾的南瓜多糖作對(duì)比，VC作陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定南瓜硒多糖的抗氧化活性。南瓜多糖、南瓜硒多糖、VC陽(yáng)性對(duì)照液均配制為1 mg/mL，對(duì)照實(shí)驗(yàn)樣液為1 μg/mL Na2SeO3與1 mg/mL南瓜多糖體積比1∶1的混合液，冰箱冷藏，用時(shí)稀釋。

1.3.3.1超氧陰離子自由基（O2-?）清除率測(cè)定

以鄰苯三酚自氧化法測(cè)定樣品清除O2-?的能力［19-20］：取4 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），加入1.5 mL超純水，混勻，25 ℃水浴保溫20 min，分別依次加入1、2、3、4、5 mL的南瓜多糖溶液、南瓜硒多糖溶液、Na2SeO3與南瓜多糖混合液及VC溶液，迅速加入已于25 ℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，搖勻，于420 nm波長(zhǎng)處每隔30 s測(cè)定其吸光度（A420nm）。平行測(cè)定3 次，按照式（1）計(jì)算O2-?清除率。

式中：A為未加樣品的空白組吸光度；A1為加入不同樣品反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.3.2羥自由基（?OH）清除率測(cè)定

以水楊酸法測(cè)定樣品清除?OH的能力［20-21］：以超純水為空白，在試管中依次加入0.5 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液，1、2、3、4、5 mL的南瓜多糖溶液、南瓜硒多溶糖液、Na2SeO3與南瓜多糖混合液及VC液，0.5 mL 5 mmol/L的H2O2，搖勻，靜置10 min，再加入2 mL 10 mmol/L水楊酸溶液，定容搖勻，10 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按照式（2）計(jì)算?OH清除率。

式中：Ai為加入不同樣品反應(yīng)體系的吸光度；A0為未加樣品的空白組吸光度。

1.3.4南瓜硒多糖體外抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)活性測(cè)定

以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為溶劑，配制0.1 mol/L的南瓜多糖溶液、南瓜硒多糖溶液、MTT溶液、Na2SeO3溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存待用，使用前用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋。將0.25 g胰蛋白酶加入到100 mL PBS（pH 7.2）中，攪拌（避免出現(xiàn)泡沫）混勻，過(guò)濾除菌，備用。

以MTT比色法對(duì)南瓜硒多糖進(jìn)行抗腫瘤活性研究［22-23］：在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，以RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%的滅活胎牛血清、100 μg/mL的青鏈霉素）傳代培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，每2～3 d傳代一次，細(xì)胞生長(zhǎng)至占瓶底面積80%時(shí)，消化調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/mL并分裝入25 mL的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，以RPMI-1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中（200 μL/孔），培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含有樣品的培養(yǎng)基200 μL，南瓜多糖、南瓜硒多糖和Na2SeO3均設(shè)置質(zhì)量濃度60、90、120 μg/mL 3組，每試樣設(shè)復(fù)孔3 個(gè)，同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液調(diào)零孔，以未加藥的細(xì)胞組為空白對(duì)照組，0.1 μg/mL紫杉醇為陽(yáng)性對(duì)照組。于37 ℃、50% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。棄去上清液，每孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基120 μL、5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，小心吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜200 μL，37 ℃搖床輕搖30 min，使結(jié)晶溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD570nm）值。各實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次，按照式（3）計(jì)算各樣品對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的抑制率。

1.4數(shù)據(jù)處理

以SPSS 10統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1南瓜硒多糖的結(jié)構(gòu)表征

用AFS-9760雙道原子熒光光度計(jì)測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物南瓜硒多糖中硒含量為215.7 μg/g，將產(chǎn)物放置3 個(gè)月后再次測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光譜、硒含量和未放置前基本一致，即目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)本身及其含硒量均無(wú)明顯的變化，說(shuō)明南瓜硒多糖具有較好的穩(wěn)定性。南瓜硒多糖的紫外光譜、紅外光譜和熱重分析結(jié)果見(jiàn)圖1～4。

圖1　Na 1 Na2SeOSeO3、南瓜硒多糖的紫外光譜Fig.1　UV absorption spectra of Na2SeO3and selenium-containing pumpkin polysaccharide

如圖1所示，在紫外光區(qū)190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)Na2SeO3溶液和南瓜硒多糖溶液進(jìn)行掃描，分析純波長(zhǎng)處出現(xiàn)最大峰，這是的Se=O特征吸收峰；南瓜硒多糖在288、334 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)兩雙峰，334 nm波長(zhǎng)處的吸收峰與文獻(xiàn)［24］報(bào)道在335 nm波長(zhǎng)處存在的Se=O特征吸收峰相吻合，288 nm波長(zhǎng)處吸收峰是南瓜硒多糖中Se—O鍵的吸收峰，與Na2SeO3相比，目標(biāo)產(chǎn)物南瓜硒多糖中的Se=O吸收峰由于受產(chǎn)物中其他官能團(tuán)的影響而發(fā)生了明顯的紅移現(xiàn)象。

圖2　Na 2 Na2SeOSeO3、南瓜多糖和南瓜硒多糖的紅外光譜Fig.2　IR spectra of sodium selenite， pumpkin polysaccharide and selenium-containing pumpkin polysaccharide

由圖2可知，南瓜多糖紅外光譜具有典型的多糖特征吸收峰（3 341、2 930、1 637、1 556、1 382、1 158、1 075、1 023、1 138、1 017、831、716 cm-1）。3 341 cm-1處出現(xiàn)的寬峰是O—H的伸縮振動(dòng)，2 930 cm-1為C—H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 637 cm-1是羧基C=O的伸縮振動(dòng)，1 556 cm-1是羧基C—O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 382 cm-1吸收峰是O—H彎曲振動(dòng)，1 158 cm-1吸收峰是C—H彎曲振動(dòng)，1 138 cm-1處的峰是糖類(lèi)分子呋喃環(huán)的環(huán)伸縮振動(dòng)特征峰，1 017 cm-1處為吡喃環(huán)伸縮振動(dòng)特征峰，831 cm-1的吸收峰是呋喃環(huán)中C—H變角振動(dòng)峰，716 cm-1處是吡喃糖環(huán)C—O—C振動(dòng)吸收峰。與南瓜多糖相比，南瓜硒多糖紅外光譜中多糖的一些特征吸收峰依然明顯，只是在一些官能團(tuán)特征峰的峰形、吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)了一定的紅移和藍(lán)移。O—H伸縮振動(dòng)峰變得更寬，而彎曲振動(dòng)峰顯著減小，這說(shuō)明硒化發(fā)生在羥基位置，使得—OH減少，C—H伸縮峰略有增大，而彎曲峰變化不大，C=O伸縮峰稍有增寬，C—O伸縮峰藍(lán)移（1 449 cm-1），兩個(gè)環(huán)的特征峰出現(xiàn)譜線紅移，呋喃環(huán)峰形變小，而吡喃環(huán)相反增大，因此硒化對(duì)南瓜多糖的主要結(jié)構(gòu)沒(méi)有大的改變。從Na2SeO3紅外光譜可看出860 cm-1附近的是亞硒酸Se=O伸縮振動(dòng)吸收峰，附近的是的O—Se—O對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，520 cm-1處是O—Se—O彎曲變角振動(dòng)峰，而南瓜硒多糖中硒官能團(tuán)的特征吸收峰相對(duì)來(lái)說(shuō)出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象，在756 cm-1附近的是亞硒酸Se=O伸縮振動(dòng)峰，1 028 cm-1處是亞硒酸酯中O—Se—O伸縮振動(dòng)峰，756 cm-1附近的是Se—C的伸縮振動(dòng)峰。

圖3　南瓜多糖、南瓜硒多糖的熱重曲線Fig.3　Thermal gravity curves of pumpkin polysaccharide and selenium-containing pumpkin polysaccharide

圖4　南瓜多糖、南瓜硒多糖的微分熱重曲線Fig.4　Differential thermal gravity curves of pumpkin polysaccharide and selenium-containing pumpkin polysaccharide

由圖3、4可知，南瓜多糖在215.8 ℃開(kāi)始分解，此時(shí)剩余質(zhì)量為樣品總質(zhì)量的91.8%，312.6 ℃時(shí)質(zhì)量損失速率最大，達(dá)到411.6 μg/min，到600 ℃基本達(dá)到恒質(zhì)量，剩余質(zhì)量為樣品總質(zhì)量的27.0%。而南瓜硒多糖在206.8 ℃開(kāi)始分解，剩余質(zhì)量為樣品總質(zhì)量的90.3%，312.6 ℃質(zhì)量損失速率最大，為453.5 μg/min，600 ℃基本達(dá)到恒質(zhì)量，剩余質(zhì)量為樣品總質(zhì)量的22.4%。由此可知，由于南瓜硒多糖的生成，使得其開(kāi)始分解的溫度略低于未硒化的南瓜多糖，312.6 ℃時(shí)質(zhì)量損失速率相對(duì)增大，且600 ℃基本恒質(zhì)量時(shí)的剩余質(zhì)量相應(yīng)減少，即證明南瓜多糖中的羥基與SeO32-結(jié)合生成了南瓜硒多糖，使其熱穩(wěn)定性降低。

2.2對(duì)O2-?的清除作用

在pH 7.8條件下，鄰苯三酚自氧化，生成O2-?和中間體，該中間體在420 nm波長(zhǎng)處有一特征吸收峰，當(dāng)加入O2-?清除劑時(shí)，O2-?的生成受抑制，鄰苯三酚自氧化過(guò)程受阻，溶液在420 nm波長(zhǎng)處吸收減弱。通過(guò)測(cè)定某物質(zhì)對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制作用，便可表征其對(duì)O2-?的清除能力。由圖5可知，南瓜多糖、南瓜硒多糖、Na2SeO3和南瓜多糖混合液及VC對(duì)O2-?都有清除作用，清除能力由強(qiáng)到弱為：VC＞Na2SeO3和南瓜多糖混合液＞南瓜硒多糖＞南瓜多糖，在60～180 s內(nèi)，O2-?清除能力與樣品量呈一定的正相關(guān)，隨樣品加入量的增大而增強(qiáng)，VC、Na2SeO3和南瓜多糖混合液增長(zhǎng)的幅度較大，而南瓜多糖及南瓜硒多糖對(duì)O2-?的清除能力提高幅度相對(duì)平緩。

圖5　樣品對(duì)??的清除能力比較Fig.5　Scavenging capacity of different polysaccharide samples against superoxide anion radical

2.3對(duì)?OH的清除作用

H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生高活性?OH，?OH存活時(shí)間短，若在其中加入水楊酸，可有效捕捉?OH，并生成有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收。在反應(yīng)體系中加入具有清除?OH能力的物質(zhì)，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)?OH，使有色物質(zhì)生成量減少。采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在同體積的反應(yīng)體系中加入不同量的被測(cè)物，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，就能測(cè)定物質(zhì)對(duì)?OH的清除作用。如圖6所示，南瓜多糖、南瓜硒多糖、Na2SeO3和南瓜多糖混合液、VC對(duì)?OH具有較強(qiáng)的清除作用，且清除能力與樣品加入量成正比，但相同質(zhì)量濃度的南瓜硒多糖對(duì)?OH的清除能力顯著強(qiáng)于南瓜多糖，而弱于VC及Na2SeO3和南瓜多糖混合液。

圖6　樣品對(duì)?OH的清除能力比較Fig.6　Scavenging capacity of different polysaccharide samples against hydroxyl radical

2.4對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制作用

以南瓜多糖、南瓜硒多糖、Na2SeO3作用于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 24、48、72 h后，經(jīng)MTT法測(cè)定（72 h后影響作用接近72 h的效果，故數(shù)據(jù)分析只取到72 h），以0.1 μg/mL紫杉醇為陽(yáng)性對(duì)照組，不加樣品的細(xì)胞為空白對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率如表1所示。

表1　樣品對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制率Table1　Percentage inhibition of original and modified pumpkin polysaccharide against the growth of tumor cells %

由表1可知，以不同質(zhì)量濃度的南瓜多糖、南瓜硒多糖和Na2SeO3處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231不同時(shí)間后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果均弱于0.1 μg/mL的紫杉醇。紫杉醇是目前治療乳腺癌等腫瘤的特效藥，但因其水溶性差以及臨床應(yīng)用中出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性、造血抑制、胃消化道黏膜炎等毒副作用［25］，且毒性與其給藥劑量呈正相關(guān)，使得其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用受到限制。南瓜硒多糖雖在藥效上無(wú)法與紫杉醇相比，但其源于對(duì)天然食品南瓜多糖的硒修飾，水溶性強(qiáng)，在應(yīng)用上可作為協(xié)助功能性物質(zhì)以減少紫杉醇用量。90、120 μg/mL的南瓜多糖作用24、48 h后對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)有一定的抑制作用，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），但60 μg/L的南瓜多糖以及各劑量的南瓜多糖作用72 h均對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各質(zhì)量濃度的南瓜硒多糖和Na2SeO3在3 個(gè)處理時(shí)間段都對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制能力，與空白對(duì)照組比較有顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），且在作用48 h時(shí)抑制作用達(dá)到最強(qiáng)，120、90 μg/mL的Na2SeO3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制率分別達(dá)到70.2%、56.2%，120、90 μg/mL的南瓜硒多糖對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的抑制率分別為50.3%、38.2%；在作用72 h時(shí)，Na2SeO3和南瓜硒多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制率均有所降低，120 μg/L的Na2SeO3和南瓜硒多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制率分別為55.4%、43.8%。相比之下，相同質(zhì)量濃度的無(wú)機(jī)Na2SeO3對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于南瓜硒多糖。這也進(jìn)一步說(shuō)明無(wú)機(jī)硒化物中由于硒含量太大，容易在應(yīng)用中引起硒過(guò)量中毒，對(duì)生命體健康造成負(fù)面影響。而有機(jī)南瓜硒多糖對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用雖相對(duì)較弱，但安全性能較高，因此具有更廣泛的應(yīng)用前景。

3　結(jié) 論

本研究通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、熱重分析對(duì)合成的南瓜硒多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以Se=O和Se—C鍵的存在證明合成了南瓜硒多糖。體外抗氧化和抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，南瓜硒多糖對(duì)O2-?、?OH的清除能力以及抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的能力明顯強(qiáng)于南瓜多糖。本實(shí)驗(yàn)表明，將硒和南瓜多糖兩者有機(jī)結(jié)合形成的南瓜硒多糖是更安全、穩(wěn)定的抗氧化劑和抗腫瘤物質(zhì)。本研究結(jié)果為篩選硒多糖類(lèi)藥品和綠色補(bǔ)硒保健產(chǎn)品提供了必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，同時(shí)為促進(jìn)南瓜資源的合理深加工、拓寬利用渠道奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation， Characterization and Activity Analysis of Selenium-Containing Pumpkin Polysaccharide

SHANG Longchen1， WU Shaowei1， ZHANG Chi2， LIAO Honghua2， LIU Xinping1，*
（1. College of Chemistry and Environmental Engineering， Hubei University for Nationalities， Enshi 445000， China；2. College of Biological Science and Technology， Hubei University for Nationalities， Enshi 445000， China）

selenium-containing pumpkin polysaccharide； preparation； characterization； activity

10.7506/spkx1002-6630-201619008

TS201.2

A

1002-6630（2016）19-0048-06

商龍臣， 吳少魏， 張馳， 等. 南瓜硒多糖的制備表征及活性分析［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 48-53. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619008. http：//www.spkx.net.cn

SHANG Longchen， WU Shaowei， ZHANG Chi， et al. Preparation， characterization and activity analysis of selenium-containing pumpkin polysaccharide［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 48-53. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619008. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（21461009；F030304）；湖北省高校應(yīng)用化學(xué)戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目

商龍臣（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：13402703754@163.com

劉信平（1967—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊晃a(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：xingping-liu@163.com