飽和氫氣生理鹽水對(duì)大鼠肝移植缺血/再灌注損傷中自噬的調(diào)節(jié)作用

施東婧，杜洪印，喻文立，吳莉，盛明薇，翁亦齊，王永旺，劉文娜，王樹森（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 00070；.天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津 009；.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 009）

缺血/再灌注損傷（IRI）是導(dǎo)致肝移植術(shù)后肝功能衰竭和移植肝原發(fā)性無(wú)功的重要因素之一[1]。肝臟IRI的發(fā)生機(jī)制包括氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥反應(yīng)等。氫氣因其具有選擇性抗氧化作用等特性，對(duì)多臟器和細(xì)胞具有保護(hù)作用，可緩解肝臟IRI[2-5]。適度自噬是細(xì)胞代謝和更新的重要方式，但過(guò)度自噬可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)多死亡和組織器官病理?yè)p傷。研究發(fā)現(xiàn)[6]，自噬相關(guān)肝細(xì)胞死亡可導(dǎo)致移植肝功能衰竭，通過(guò)抑制劑來(lái)抑制自噬可緩解肝臟冷IRI。因此，本研究擬探討氫氣對(duì)大鼠原位肝移植IRI中肝細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)成年健康雄性SD大鼠24只，體重為200～250 g，購(gòu)于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（每組8只實(shí)驗(yàn)大鼠）：假手術(shù)組（Sham組）、原位肝移植組（OLT組）和飽和氫氣生理鹽水處理組（HS組）。Sham組僅進(jìn)行開關(guān)腹操作，OLT組和HS組建立原位肝移植模型。HS組在肝下下腔開放即刻，經(jīng)肝下下腔靜脈注射6 ml/kg 4℃飽和氫氣生理鹽水，OLT組則注射等量4℃生理鹽水。受鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，術(shù)后均恢復(fù)進(jìn)食。

肝移植模型建立：根據(jù)文獻(xiàn)所述[7]，① 供體手術(shù)：大鼠腹腔注射5%水合氯醛6 ml/kg麻醉后，經(jīng)上腹部行縱切口，暴露并游離第一肝門、肝上下腔靜脈及肝下下腔靜脈，分別結(jié)扎右腎上腺靜脈、左膈下靜脈和肝固有動(dòng)脈。游離膽管時(shí)盡量保留周圍組織。在膽總管遠(yuǎn)端的前臂剪一小口，向近端插入膽道支架管（由硬膜外導(dǎo)管制成，長(zhǎng)約4～5 mm），用絲線結(jié)扎固定。在下腔靜脈遠(yuǎn)端注射1 ml肝素生理鹽水（2.5×104U/L）使血液充分肝素化。在左右髂總動(dòng)脈分叉近端結(jié)扎腹主動(dòng)脈并在結(jié)扎線以上向肝側(cè)置管固定，用4℃肝素乳酸林格液（50 U/L）緩慢灌注（4 ml/min）。剪開肝下下腔靜脈和肝上下腔靜脈遠(yuǎn)端，使灌注液順利流出。待肝臟變?yōu)橥咙S色后，緊貼膈肌剪斷肝上下腔靜脈，在剪斷肝下下腔靜脈和門靜脈時(shí)殘端盡量留長(zhǎng)。② 供肝處理：將供肝置于4℃乳酸林格液中。選取管徑合適的套管分別對(duì)門靜脈及肝下下腔靜脈進(jìn)行套管，并用絲線固定。經(jīng)門靜脈緩慢注入4℃乳酸林格液再次進(jìn)行灌注至流出液清亮為止。在肝上下腔靜脈左右側(cè)角各縫吊7-0血管線，以備吻合時(shí)使用。肝臟修整完畢后置于4℃冰箱保存。③ 受體手術(shù)：術(shù)前處理同供體，開腹后游離肝周韌帶、血管及膽總管。阻斷肝下下腔靜脈、門靜脈及肝上下腔靜脈后剪斷血管并取出肝臟。原位放入供肝，連續(xù)外翻縫合肝上下腔靜脈，將供肝門脈套管套入受體門脈中，用絲線固定。開放門脈及肝上下腔靜脈，結(jié)束無(wú)肝期。完成肝下下腔套管后移除止血夾，將供肝膽管支架管套入受體膽管并固定。檢查無(wú)出血及異常后用溫生理鹽水反復(fù)沖洗腹腔，縫合腹壁切口。

1.2 制備飽和氫氣生理鹽水：飽和氫氣生理鹽水根據(jù)文獻(xiàn)[3]所述方法制備，抽空裝有生理鹽水的容器內(nèi)氣體，并充入氫氣，在400 kPa的壓力下維持6 h，用氣相色譜分析儀測(cè)定生理鹽水中氫氣是否達(dá)到飽和，氫氣的濃度需大于0.6 mmol/L，制備完成后于4℃保存并于24 h內(nèi)使用。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 肝功能及氧化應(yīng)激檢測(cè)：各組大鼠于再灌注后6 h，經(jīng)下腔靜脈采集血液標(biāo)本，室溫下靜置后離心，收集血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。取肝臟組織制備組織勻漿，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3.2 病理學(xué)檢測(cè)：取大鼠新鮮肝臟組織，4℃生理鹽水沖洗干凈后用10%中性甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋后制備切片（切片厚度為5 μm），蘇木精-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.3.3 蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）：肝組織蛋白質(zhì)定量、變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺氨凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗滌后加入一抗〔兔抗鼠微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3Ⅱ）、自噬相關(guān)因子Beclin-1及磷酸甘油酸脫氫酶 （GAPDH）〕，于4℃孵育過(guò)夜，洗滌后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，最后洗滌干凈后加入顯色底物顯色曝光，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.3.4 RT-PCR 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算caspase-3和Cyt-c mRNA表達(dá)水平。引物購(gòu)買于北京奧科鼎盛生物工程有限公司，表1為引物序列。循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性30 s；再95℃變性5 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。隨后得融解曲線，使用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算達(dá)到閾值的最低循環(huán)數(shù)（Ct值）。目的基因的mRNA拷貝數(shù)以Ct值計(jì)算，每個(gè)基因均重復(fù)2次，取平均值，相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 引物序列

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組受鼠血清ALT和AST水平的比較 （圖1）：與Sham組相比，OLT組和HS組血清ALT和AST水平均顯著升高（P＜0.05）；與OLT組相比，HS組血清中ALT和AST水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖1 各組受鼠血清ALT和AST水平比較

2.2 各組受鼠肝組織病理改變（圖2）：與Sham組相比，移植術(shù)后6 h，OLT組受鼠肝組織出現(xiàn)明顯損傷，大量肝細(xì)胞水腫，肝竇間隙變窄，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)明顯，大量紅細(xì)胞淤積，肝竇部分區(qū)域還出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死。與OLT組相比，HS組受鼠肝細(xì)胞水腫減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞淤積減少。

2.3 MDA水平和SOD活性比較（表2）：與Sham組比較，OTL組和HS組受鼠，術(shù)后6 h肝組織MDA水平顯著升高而SOD活性明顯降低（P＜0.05）；HS組與OTL組比較肝組織氧化應(yīng)激損傷減輕，MDA水平降低，SOD活性升高（P＜0.05）。

圖2 各組受鼠肝臟組織病理學(xué)改變 （HE×200）

表2 氧化應(yīng)激水平及caspase-3 mRNA和Cyt-c mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 氧化應(yīng)激水平及caspase-3 mRNA和Cyt-c mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與Sham組相比，aP＜0.05；與OLT組相比，bP＜0.05

Cyt-c mRNA（2-ΔΔCt）Sham 組 8 0.64±0.07 204.13±17.75 1.09±0.18 0.99±0.17 OLT 組 8 1.25±0.13a135.78±10.92a 2.02±0.26a 1.96±0.19a HS 組 8 1.02±0.11ab158.81±12.09ab 1.67±0.17ab 1.64±0.18ab組別 動(dòng)物數(shù)（只）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）

2.4 肝細(xì)胞胞漿中LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白的表達(dá)量（圖3）：HS組大鼠肝細(xì)胞LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)均受到抑制，其表達(dá)量明顯低于OTL組（P＜0.05）；而與Sham組相比，OTL組和H組LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組受鼠肝細(xì)胞LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)

2.5 各組受鼠肝組織caspase-3和Cyt-c的mRNA表達(dá)量（表2）：再灌注后6 h，OLT組受鼠肝組織caspase-3和Cyt-c的mRNA表達(dá)量較Sham組顯著上調(diào)（P＜0.05）；與OLT組比較，HS組肝組織caspase-3和Cyt-c的mRNA表達(dá)水平下降（P ＜ 0.05）。

3 討 論

IRI是肝移植術(shù)后肝功能衰竭和原發(fā)性無(wú)功的重要因素之一[7]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)[8]建立并改良了Kamada二袖套肝移植模型，結(jié)果表明，再灌注后6 h，與Sham組比較，OLT組ALT、AST、MDA水平和肝組織病理學(xué)損傷評(píng)分升高，SOD活性降低，提示肝移植模型制備成功。

氫氣是無(wú)色、無(wú)味的小分子氣體，可通過(guò)單純擴(kuò)散迅速進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)，可以直接作用于氧化應(yīng)激損傷最嚴(yán)重的細(xì)胞器——線粒體。實(shí)驗(yàn)表明，氫氣可選擇性清除氧化活性較強(qiáng)的羥自由基（·OH）及過(guò)氧亞硝酸陰離子（ONOO-），而不與其他具有生物活性的氧自由基（ROS）發(fā)生反應(yīng)，從而起到選擇性抗氧化作用[9-10]。Fukuda等[5]發(fā)現(xiàn)，吸入氫氣可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激，抑制肝IRI。在本研究中，與OLT組比較，HS組ALT、AST、MDA水平和肝組織病理學(xué)損傷評(píng)分明顯減低，而SOD活性升高，同時(shí)caspase-3和Cyt-c mRNA表達(dá)量減低，提示靜脈注射飽和氫氣生理鹽水可減輕肝移植中肝IRI，減少肝細(xì)胞凋亡。

自噬在細(xì)胞生存及其穩(wěn)態(tài)的維持中具有重要作用。細(xì)胞可以通過(guò)自噬降解細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的蛋白，分解得到的氨基酸等可為細(xì)胞代謝提供底物[11]。Gotoh等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，自噬引起的肝細(xì)胞死亡導(dǎo)致移植肝功能衰竭，抑制自噬可有效緩解肝臟冷IRI。最新研究顯示，在骨骼肌的IRI中，氫氣可以通過(guò)抑制自噬從而起到一定的保護(hù)作用[12]。在本研究中，OLT組移植肝再灌注6 h后，自噬被激活，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)凋亡相關(guān)基因caspase-3、Cyt-c mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。開放肝下下腔靜脈后注射飽和氫氣生理鹽水可減輕大鼠肝組織病理?yè)p傷，MDA含量明顯降低而SOD活性顯著升高，同時(shí)LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白以及caspase-3和Cyt-c mRNA表達(dá)均下降。LC3與Beclin-1是自噬過(guò)程中的兩個(gè)重要蛋白，可反映細(xì)胞自噬活性。由此可見，肝移植IRI可上調(diào)肝細(xì)胞自噬，而靜脈注射飽和氫氣生理鹽水可通過(guò)抑制自噬減少IRI。

綜上所述，飽和氫氣生理鹽水可以通過(guò)抑制肝細(xì)胞自噬來(lái)緩解細(xì)胞凋亡，減輕移植肝的IRI，但氫氣對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步證實(shí)。