免疫抑制小鼠急性重癥肺部感染中巨噬細(xì)胞亞型變化與烏司他丁調(diào)控效應(yīng)

秦科，鄺曉聰，孫煦勇，董建輝，藍(lán)柳根，黃瑩，曹嵩，李美思，李壯江，李海濱，蘇慶東，周潔惠（.廣西南寧中國(guó)人民解放軍第303醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院，廣州軍區(qū)器官移植中心，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西移植醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 5300；.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 5300）

肺部重癥感染是免疫抑制器官移植患者致命的并發(fā)癥，起病急且發(fā)展快，往往在病原體尚未查清時(shí)，病情已經(jīng)極度惡化甚至死亡，是目前臨床治療的難點(diǎn)[1]。肺部重癥感染臟器衰竭的病理生理學(xué)機(jī)制是嚴(yán)重急性過度炎癥損傷，研究表明，近年來(lái)烏司他丁可通過調(diào)節(jié)膿毒血癥時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而起到抗炎和炎癥免疫調(diào)理的作用[2-5]，因此廣州軍區(qū)器官移植中心嘗試采用大劑量烏司他丁開展臨床治療，發(fā)現(xiàn)可延緩肺部重癥感染的病程，療效較好。由于器官移植患者感染前出現(xiàn)輔助T細(xì)胞1（Th1）偏向Th2特點(diǎn)的免疫抑制狀態(tài)[6]，與細(xì)菌移位等引起膿毒血癥的機(jī)體免疫條件不同，因此，有必要進(jìn)一步明確其免疫抑制肺部過度炎癥發(fā)生以及烏司他丁抗炎效應(yīng)的機(jī)制，為后續(xù)研究與治療提供思路和依據(jù)。此外，肺部巨噬細(xì)胞在肺部重癥感染發(fā)生過度炎癥的機(jī)制中充當(dāng)重要角色，而且M1和M2巨噬細(xì)胞亞群能夠參與炎癥反應(yīng)的不同階段，與Th1與Th2細(xì)胞調(diào)控密切相關(guān)[7]。鑒于此，本研究在甲潑尼龍免疫抑制小鼠模型的基礎(chǔ)上，聯(lián)合氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素，制備免疫抑制小鼠急性重癥肺部感染，觀察其巨噬細(xì)胞亞群構(gòu)成與活性，并進(jìn)一步施加烏司他丁實(shí)驗(yàn)性干預(yù)治療，觀察烏司他丁干預(yù)后巨噬細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)，初步明確其拮抗重癥肺部炎癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Balb/c小鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)（SCXK桂2011-0003），無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，4～6 W，體重為20～25 g。

1.1.2 主要試劑：脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma公司）、甲潑尼龍（美國(guó)輝瑞公司）、烏司他丁（UTI，廣東天普生化醫(yī)藥株式會(huì)社），引物合成、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與PCR試劑盒（日本Takara公司，其中PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Code ：DRR047S，SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus，Takara公司Code：DRR820S）；抗小鼠 CD163單克隆抗體（北京中杉公司）。

1.1.3 模型建立與實(shí)驗(yàn)分組：選取60只Balb/c小鼠隨機(jī)分為3組，分別為免疫抑制肺部重癥感染組（模型組）、烏司他丁組和對(duì)照組。具體如下：① 模型組（n＝20）：先按文獻(xiàn)[2]建立免疫抑制狀態(tài)小鼠，以30 mg/kg劑量腹腔注射甲潑尼龍，連續(xù)注射3天；第4天以10 mg/kg劑量氣管滴注脂多糖（LPS）；② 烏司他丁組（n＝20）：在免疫抑制肺部重癥感染建模的第4天，氣管滴注LPS前、后30 min分別給予腹腔注射高劑量（1×105U/kg）和低劑量（5×103U/kg）的烏司他??；③ 對(duì)照組（n＝20）：腹腔注射等量生理鹽水。取材時(shí)點(diǎn)為L(zhǎng)PS作用后6小時(shí)。

1.2 一般情況觀察：記錄小鼠的一般體征，精神狀態(tài)，呼吸頻率等。

1.3 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞的收集方法：麻醉小鼠后用18G留置針氣管穿刺固定，用冷RPMI 1640培養(yǎng)液注射器反復(fù)沖洗后回收支氣管肺泡灌洗液。細(xì)胞懸液以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，移棄上清液，用細(xì)胞沉淀進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類檢測(cè)：細(xì)胞沉淀用于涂片，進(jìn)行瑞氏染色，在油鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)。

1.5 肺組織蘇木精-伊紅（HE）染色與肺損傷評(píng)分：肺組織HE染色后，進(jìn)行Smith評(píng)分，按肺組織水腫、肺泡間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)滲出、出血，肺不張和透明膜形成分別進(jìn)行0～4分的半定量分析。

1.6 肺組織CD163免疫組織化學(xué)染色：按即用型免疫組織化學(xué)試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)呈黃褐色，在200倍鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)視野，采圖并用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，檢測(cè)其吸光度（A）值大小。

1.7 定量PCR檢測(cè)：支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞微量提取RNA、反轉(zhuǎn)錄和定量PCR反應(yīng)均按Takara公司試劑盒方法進(jìn)行，產(chǎn)物定量計(jì)算按參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行分析[5]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況：模型組與烏司他丁組小鼠均出現(xiàn)精神萎靡，部分小鼠呼吸窘迫，口鼻有淡紅色分泌物。

2.2 各組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類與構(gòu)成比例（圖1）：在模型組與烏司他丁組的支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)量均較對(duì)照組增多，主要為單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，可見少量淋巴細(xì)胞，其中烏司他丁組的單核/巨噬細(xì)胞比例稍高，而模型組中性粒細(xì)胞稍高，但兩組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對(duì)照組主要為單核/巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞與少量淋巴細(xì)胞。

圖1 各組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類與構(gòu)成比例

2.3 各組肺組織病理變化與肺損傷評(píng)分（圖2）：模型組小鼠肺損傷主要為肺間質(zhì)肺泡腔大量中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)，肺間質(zhì)增厚，可見水腫、充血。烏司他丁組小鼠肺損傷減輕，肺損傷評(píng)分顯著低于模型組（P＜0.05），但兩組評(píng)分均顯著高于對(duì)照組。

圖2 各組肺組織病理變化與肺損傷評(píng)分

2.4 各組小鼠肺組織中細(xì)胞CD163的表達(dá)情況（圖3）：CD163陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞膜，呈黃褐色，模型組和烏司他丁組中CD163陽(yáng)性表達(dá)（A值）均顯著高于對(duì)照組，而烏司他丁組則顯著低于模型組（P ＜ 0.05）。

2.5 BALF中M1巨噬細(xì)胞相關(guān)分子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的mRNA表達(dá)水平（圖4）：模型組與烏司他丁組小鼠BALF中M1巨噬細(xì)胞相關(guān)分子IL-6和TNF-α的mRNA水平在LPS刺激后均顯著高于對(duì)照組，烏司他丁組IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平則顯著低于模型組（P＜0.05），但各組的iNOS水平無(wú)顯著差異。

圖3 各組小鼠肺組織中細(xì)胞CD163表達(dá)情況

圖4 BALF中M1巨噬細(xì)胞相關(guān)分子iNOS、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平

2.6 BALF中M2巨噬細(xì)胞相關(guān)分子IL-10、Arg-1和CD206的mRNA表達(dá)水平（圖5）：模型組與烏司他丁組小鼠BALF中M2巨噬細(xì)胞相關(guān)分子IL-10、Arg-1和CD206的mRNA表達(dá)水平在LPS刺激后均顯著高于對(duì)照組，模型組與烏司他丁組Arg-1的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異；而烏司他丁組IL-10和CD206的mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組。

圖5 BALF中M2巨噬細(xì)胞相關(guān)分子IL-10、Arg-1和CD-206的mRNA表達(dá)水平

3 討 論

器官移植患者是一類典型的免疫抑制狀態(tài)人群，以環(huán)孢素A、強(qiáng)的松、FK506等為代表的免疫抑制劑作用靶點(diǎn)多為T細(xì)胞，尤其是強(qiáng)的松等激素類藥物重點(diǎn)抑制Th1細(xì)胞，是引發(fā)器官移植患者早期重癥機(jī)會(huì)性感染的機(jī)體方面因素。本中心早期研究發(fā)現(xiàn)，以大劑量甲潑尼龍（30 mg/kg）連續(xù)干預(yù)小鼠并靜脈注射內(nèi)毒素，發(fā)現(xiàn)免疫抑制內(nèi)毒素血癥小鼠細(xì)胞免疫的特點(diǎn)是Th1向Th2細(xì)胞單向偏移，即Th1相關(guān)細(xì)胞因子γ-干擾素（INF-γ）、IL-2依然為低水平，而Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-10表達(dá)水平均升高，與臨床合并膿毒癥的肝移植患者免疫狀態(tài)的變化特點(diǎn)類似[3，6]。在此基礎(chǔ)上，本研究在連續(xù)使用甲潑尼龍干預(yù)后氣管滴入內(nèi)毒素，模擬器官移植患者肺部重癥感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M1和M2亞群均處于不同程度的活化狀態(tài)，其中M1巨噬細(xì)胞相關(guān)分子TNF-α與IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高，但iNOS變化不大；而巨噬細(xì)胞M2亞群則表現(xiàn)為多個(gè)相關(guān)分子的高水平表達(dá)，如CD206、IL-10和Arg-1等高水平表達(dá)，進(jìn)一步做肺組織的M2亞群細(xì)胞標(biāo)志CD163免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)中出現(xiàn)大量CD163陽(yáng)性細(xì)胞，提示此時(shí)M2巨噬細(xì)胞處于全面活化亢進(jìn)狀態(tài)。究其原因，可認(rèn)為Th1細(xì)胞偏向Th2細(xì)胞的免疫抑制特點(diǎn)有利于出現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)亞群，可能與Th2細(xì)胞因子IL-4與IL-10占優(yōu)勢(shì)密切相關(guān)，其中IL-4可誘發(fā)巨噬細(xì)胞選擇性激活，誘導(dǎo)分化為M2巨噬細(xì)胞亞群[7-8]。本研究中由于Th1細(xì)胞活性被甲潑尼龍抑制，即使在強(qiáng)烈刺激劑LPS誘導(dǎo)下也不能充分激活而分泌INF-γ，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞群體向M1極化減弱，所以M1亞群相關(guān)分子水平并未全面升高。大劑量甲潑尼龍還可抑制LPS活化自然殺傷（NK）細(xì)胞，減少INF-γ的另一個(gè)主要來(lái)源[9]。因此，根據(jù)巨噬細(xì)胞群體細(xì)胞因子和標(biāo)志特點(diǎn)，本研究免疫抑制小鼠急性重癥感染肺部的巨噬細(xì)胞亞群偏向M2型。根據(jù)單核-巨噬細(xì)胞極化理論，單核細(xì)胞在組織轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，M1和M2亞群是兩個(gè)極端狀態(tài)，因此，巨噬細(xì)胞可位于極端分化M1/M2 之間的任一中間階段[7]。雖然選擇性激活M2型巨噬細(xì)胞的活性增強(qiáng)，但殺菌能力可能并未提高，有研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞氨酸酶表達(dá)升高，通過消耗精氨酸含量而減少一氧化氮合成底物，使一氧化氮合成減少而減弱殺菌能力[10]；也可能是本研究中M1亞群iNOS活化減弱的誘導(dǎo)因素，也提示M1和M2亞群可能有互相調(diào)控的可能性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和器官移植患者臨床觀察表明，重癥肺部感染時(shí)，強(qiáng)的松龍等免疫抑制劑營(yíng)造的機(jī)體Th2和肺部M2優(yōu)勢(shì)極化狀態(tài)結(jié)局非常不佳，前期實(shí)驗(yàn)就發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物的存活時(shí)間基本不超過24 h，多在12 h時(shí)死亡，病死率在90%以上，而臨床患者病程進(jìn)展迅速，可導(dǎo)致器官移植患者死亡。因?yàn)闄C(jī)體處于Th2與M2的優(yōu)勢(shì)狀態(tài)可能是一個(gè)代償性抗炎癥反應(yīng)綜合征（CARS）狀況，導(dǎo)致預(yù)后不佳。因此，有必要嘗試改變此時(shí)肺部和機(jī)體的免疫狀態(tài)以緩解重癥肺部感染。為防止排斥反應(yīng)，器官移植患者不允許長(zhǎng)期停用免疫抑制以和徹底改變H1抑制的狀況，因此，其主導(dǎo)策略與普通的膿毒血癥不同，即在抗炎的同時(shí)不能充分提高細(xì)胞免疫而抗感染。此外，停用免疫抑制也增加了排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

烏司他丁是廣譜蛋白水解酶抑制劑，近幾年多用于膿毒血癥的抗炎治療，阻斷全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），減少肺損傷，緩解呼吸衰竭病程發(fā)展[11]通常聯(lián)合使用胸腺肽等藥物提高T細(xì)胞活性，增強(qiáng)機(jī)體抗感免疫，獲得更滿意的臨床效果[12-13]。本中心在移植后肺部重癥感染時(shí)，給予大劑量使用烏司他丁干預(yù)，可緩解病情加重，另外為防止肺纖維化的發(fā)生，仍維持一定劑量的皮質(zhì)激素治療，并未完全撤出激素干預(yù)，提示有必要進(jìn)一步探討烏司他丁的抗炎機(jī)制。因此，針對(duì)器官移植重癥肺部感染患者，是否考慮在免疫反應(yīng)起始環(huán)節(jié)的巨噬細(xì)胞就進(jìn)行調(diào)控，使過度炎癥反應(yīng)通過巨噬細(xì)胞亞群調(diào)控而獲得緩解，如M1和M2亞群再平衡的調(diào)控，可不涉及Th1和Th2的調(diào)節(jié)，從而達(dá)到抗炎效果。本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，烏司他丁組小鼠肺部炎性細(xì)胞侵潤(rùn)減少，肺損傷的評(píng)分減少，提示烏司他丁對(duì)免疫低下的重癥肺損傷的小鼠肺組織具有保護(hù)作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，烏司他丁在抑制巨噬細(xì)胞活化方面顯示了良好的調(diào)控效應(yīng)，降低了M1巨噬細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6，體現(xiàn)其抗炎效應(yīng)，還可以顯著抑制M2巨噬細(xì)胞分泌IL-10，減少其分子標(biāo)志CD206和CD163，但對(duì)Arg-1的改變不大，尤其是回調(diào)過高的IL-10，是改善CARS的一個(gè)因素，因?yàn)镮L-10水平并不是越高越有利[14]，這說明烏司他丁的抗炎作用更多表現(xiàn)為M1和M2細(xì)胞亞群失衡的調(diào)控作用，可能使LPS活化的M1和M2以及中間段的巨噬細(xì)胞細(xì)胞亞群回調(diào)至機(jī)體可控的炎癥范圍，維持一定水平的M1和M2再平衡，但又可適應(yīng)Th1單向偏移Th2的免疫抑制狀態(tài)，可減輕甚至避免“炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴”對(duì)肺部的損傷。這可能作為器官移植肺部重癥感染的抗炎治療模式與機(jī)制研究的全新切入點(diǎn)。