人RACK1基因的克隆及原核表達

王向飛，湯靜珍，單金帥，劉暢，吳琛

(河北大學生命科學學院，河北保定　 071002)

?

人RACK1基因的克隆及原核表達

王向飛，湯靜珍，單金帥，劉暢，吳琛

(河北大學生命科學學院，河北保定 071002)

克隆人RACK1基因，構(gòu)建原核表達載體pET-30a(+)-RACK1，誘導(dǎo)表達重組蛋白，純化后Western blot鑒定目的蛋白.根據(jù)GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)載體上的多克隆位點設(shè)計引物，以人胎肝cDNA文庫為模板，釣取RACK1 cDNA全長序列.將目的片段與原核表達載體pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆.將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21 (DE3)細胞，IPTG誘導(dǎo)表達，利用鎳柱對表達的蛋白進行純化，Western blot法檢測純化的蛋白.結(jié)果顯示，克隆得到的目的基因序列與GeneBank中已報道的序列完全一致，成功構(gòu)建了pET-30a(+)-RACK1原核表達載體.重組蛋白主要以包涵體形式存在，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后，Western blot檢測證實純化的蛋白能與特異性的抗體發(fā)生反應(yīng).本研究獲得了人RACK1蛋白,為深入研究RACK1的功能奠定基礎(chǔ).

人RACK1；基因克??；原核表達；蛋白純化

RACK1(receptor for activated C-kinase 1)蛋白由管家基因RACK1編碼合成，它是一種高度保守的細胞內(nèi)接頭蛋白，屬于Trp-Asp 40(WD-40)重復(fù)序列蛋白家族，并與G蛋白β亞基同源[1].WD-40重復(fù)序列蛋白在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控、細胞骨架聚集等方面發(fā)揮重要的作用.RACK1中7個高度保守WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域可與細胞內(nèi)一些具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白相互作用，募集信號分子形成復(fù)合物，如RACK1可與PKC相互作用[2]，激活PKC可以誘導(dǎo)RACK1與βIIPKC結(jié)合，以改變βIIPKC的細胞定位從而激活其活性[3].在βIIPKC的V5結(jié)構(gòu)域存在RACK1特異性結(jié)合位點，該位點可選擇性抑制βIIPKC，從而鑒定βIIPKC選擇性功能[4].RACK1是Src酪氨酸激酶的一種重要底物，與Src酪氨酸激酶結(jié)合，參與Src功能的調(diào)節(jié)和細胞周期的調(diào)控[5].RACK1的WD7結(jié)構(gòu)域與PCBP1相互作用，參與調(diào)節(jié)人MOR基因的表達[6]，而激發(fā)或過表達MOR可促進多種細胞的增殖[7-9]及腫瘤細胞的生長[10-11].總之，RACK1通過參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控基因的合成和蛋白的表達，進而影響細胞免疫應(yīng)答，細胞生長、分化、粘附和遷移等活動.

近些年來，越來越多的研究集中于RACK1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用.研究發(fā)現(xiàn)，RACK1在包括黑色素瘤[12]、乳腺癌[13]、肺癌[14]、口腔鱗狀細胞癌[15-16]在內(nèi)的多種腫瘤中表達上調(diào)，并與這些腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)[16].RACK1通過與RhoA相互作用，激活RhoA/Rho激酶通路，促進乳腺癌細胞侵襲遷移[13]；通過抑制Fem1b的表達促進結(jié)腸癌細胞的生成及增殖[17]；通過Gli1介導(dǎo)激活Sonic Hedgehog(SHH)信號通路，促進非小細胞肺癌的致瘤性[18]；通過促進MCM7蛋白磷酸化，促進肺癌細胞增殖[19].然而，另外一些研究得到了相反的結(jié)果.RACK1通過調(diào)節(jié)Src和生長因子誘導(dǎo)的E-cadherin內(nèi)吞作用來維持腸上皮細胞結(jié)合穩(wěn)定，促進上皮細胞的粘附，抑制侵襲[20]；通過破壞β-Catenin復(fù)合體，對Wnt通路進行負調(diào)控，在胃癌中起腫瘤抑制作用[21]；通過在細胞周期檢測點調(diào)節(jié)Src活性，抑制結(jié)腸細胞的生長[22].

在前期工作中發(fā)現(xiàn)RACK1為人胃腺癌標志物Lgr5的候選相互作用蛋白，在本研究中，通過構(gòu)建RACK1原核表達載體，誘導(dǎo)表達融合蛋白，純化獲得了重組蛋白純品，并用Western blot方法加以鑒定，從而為進一步研究RACK1和Lgr5的相互作用關(guān)系，及其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1實驗材料

原核表達載體pET-30a(+)、感受態(tài)細胞E.coliDH5α 和E.coliBL21 (DE3)均由本實驗室保存.Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶KpnI、XbaI均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自BIOMIGA公司；引物合成及DNA測序均由華大基因公司進行；6×His-Tagged Protein Purification Kit購自康為世紀公司；RACK1 Antibody rabbit polyclonal IgG、Goat anti-rabbit IgG-HRP 購自Santa Cruz Biotechnology公司.

1.2實驗方法

1.2.1RACK1基因的PCR擴增

根據(jù)pET-30a(+)載體上的多克隆位點和已報道的RACK1基因序列(GenBank Accession number:NM 006098.4)，利用Primer Premier 6.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計上下游分別含有KpnI和XbaI酶切位點、能特異性擴增RACK1基因編碼區(qū)全長序列的引物.上游引物RACK1-F：5'- CGGGGTACCATGACTGAGCAGATGACCCTT-3'(下劃線為KpnI 酶切位點，前3個為保護堿基)；下游引物RACK1-R：5'- GCTCTAGATCACTAGCGTGTGCCAATGGTC-3' (下劃線為XbaI酶切位點，前2個為保護堿基).

以胎肝cDNA文庫為模板，擴增RACK1全長序列.PCR體系：胎肝文庫cDNA模板0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 2 μL，10×Pyrobest buffer 5 μL，Pyrobest Taq DNA聚合酶 1 μL，加ddH2O至50 μL.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃最后延伸7 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收.

1.2.2pET-30a(+)-RACK1原核表達載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI對回收后的PCR產(chǎn)物和pET-30a(+)載體分別進行雙酶切，酶切的DNA片段和載體片段經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收.回收的DNA和載體片段經(jīng)T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜后，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取卡那霉素篩選的陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，最后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送華大基因公司以通用引物進行全長測序，測序結(jié)果與GenBank中公布的序列比對分析，將構(gòu)建成功的重組載體命名為pET-30a(+)-RACK1.

1.2.3RACK1蛋白的誘導(dǎo)表達

將pET-30a(+)-RACK1轉(zhuǎn)入E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞，挑取pET-30a(+)-RACK1單菌落于3 mL LB液體選擇培養(yǎng)基(卡那霉素質(zhì)量濃度為120 μg/mL)中，37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng).將60 μL上述過夜菌液接入6 mL新鮮LB液體選擇培養(yǎng)基(卡那霉素質(zhì)量濃度為120 μg/mL)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)1.3 h至OD600為0.5～0.6.取出1 mL pET-30a(+)-RACK1誘導(dǎo)前全菌液于1.5 mL EP管中，冰上保存.剩余4 mL菌液加入IPTG(終質(zhì)量濃度為100 μg/mL)，37 ℃，220 r/min誘導(dǎo)2 h.取出1 mL pET-30a(+)-RACK1誘導(dǎo)后全菌液于1.5 mL EP管中，冰上保存.將剩余3 mL誘導(dǎo)后菌液12 000 r/min常溫離心2 min，去上清液，收集菌體于1.5 mL EP管中，用400 μL PBS重懸誘導(dǎo)后菌體，超聲破碎菌體.隨后4 ℃，12 000 r/min離心2 min，分別收集上清和沉淀.同時將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液12 000 r/min離心2 min，收集菌體，用50 μL PBS重懸誘導(dǎo)前、后各菌體和超聲破碎后的沉淀，然后分別加入等體積上樣Buffer，沸水中煮5 min，全部樣品12 000 r/min離心2 min，進行120 g/L SDS-PAGE.并以pET-30a(+)誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后產(chǎn)物作對照.

1.2.4pET-30a(+)-RACK1融合蛋白的純化

按照上述方法大規(guī)模誘導(dǎo)表達pET-30a(+)-RACK1融合蛋白，根據(jù)康為世紀公司的6×His-Tagged Protein Purification Kit親和層析法純化蛋白.5 000 r/min離心15 min，棄上清液后收集菌體.每50 mg pET-30a(+)-RACK1菌體(濕重)加入1 mL細菌裂解液(含1 μL 1 000 U/mL DNase I和2 μL 50 mg/mL溶菌酶)，充分重懸，超聲破碎.收集沉淀，用變性緩沖液(8 mol/L尿素，0.1 mol/L Na2HPO4， 10 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0)重懸沉淀，充分混勻使包涵體溶解充分.4 ℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后負載上柱，以10倍柱體積/h的流速，收集流穿液.用15倍柱體積的Binding Buffer (8 mol/L尿素，0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.9)，以1～2 mL/min的流速沖洗柱子來去除雜蛋白.用適量Elution Buffer(8 mol/L尿素，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.9)洗脫蛋白，以1～2 mL/min的流速，收集洗脫峰.按照蛋白體積：復(fù)性緩沖液體積=1∶3加入超濾管中，4 ℃，5 000 r/min離心1 h，如此反復(fù)換液4次，達到蛋白復(fù)性的目的.復(fù)性處理過的蛋白進行120 g/L SDS-PAGE.

1.2.5Western blot鑒定表達產(chǎn)物的特異性

將純化的目的蛋白經(jīng)120 g/L SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，以抗人RACK1兔源多克隆抗體(體積比1∶500稀釋)為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，最后加入HRP標記的山羊抗兔二抗(體積比1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯影.

2　結(jié)果與分析

2.1RACK1基因的PCR擴增

以胎肝cDNA文庫為模板，釣取RACK1 cDNA全長序列，目的片段經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在951 bp左右有明顯條帶(圖1)，與預(yù)期大小相符.

2.2構(gòu)建pET-30a(+)-RACK1原核表達載體

重組表達質(zhì)粒pET-30a(+)-RACK1經(jīng)KpnI和XbaI雙酶切，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切得到約951 bp的片段(圖2)，與預(yù)期相符.測序結(jié)果正確，證實pET-30a(+)-RACK1表達載體構(gòu)建成功.

M.DNA Marker(bp)；1,2.RACK1基因PCR產(chǎn)物.圖1　RACK1基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1　Analysis of RACK1 PCR product by agarose gel electrophoresis

M.DNA Marker(bp)； 1.pET-30a(+)-RACK1 Kpn I/Xba I雙酶切產(chǎn)物.圖2　重組質(zhì)粒pET-30a(+)-RACK1雙酶切鑒定Fig.2　Digestion of pET-30a(+)-RACK1 vector by Kpn I and Xba I

2.3pET-30a(+)-RACK1原核表達載體的誘導(dǎo)表達

重組表達質(zhì)粒pET-30a(+)-RACK1和空載體pET-30a(+)分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21 (DE3)，經(jīng)100 μg/mL IPTG誘導(dǎo)2 h后，進行120 g/L SDS-PAGE電泳，在誘導(dǎo)沉淀中可見1條相對分子質(zhì)量約為36 ku的明顯誘導(dǎo)表達帶(Lane4)，而上清液未見明顯誘導(dǎo)條帶(Lane3)，如圖3所示，說明目的蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達.

M.蛋白Maker(ku)；1.誘導(dǎo)前的pET-30a(+)-RACK1全菌蛋白；2.誘導(dǎo)后的pET-30a(+)-RACK1全菌蛋白；3.誘導(dǎo)后的pET-30a(+)-RACK1上清蛋白；4.誘導(dǎo)后的pET-30a(+)-RACK1沉淀蛋白；5.誘導(dǎo)前的pET-30a(+)空載體全菌蛋白；6.誘導(dǎo)后的pET-30a(+)空載體全菌蛋白；7.誘導(dǎo)后的pET-30a(+)空載體上清蛋白；8.誘導(dǎo)后的pET-30a(+)空載體沉淀蛋白.圖3　SDS-PAGE電泳檢測RACK1蛋白誘導(dǎo)表達產(chǎn)物Fig.3　Analysis of RACK1 protein expression in E.coli BL21 (DE3) by SDS-PAGE

2.4RACK1融合蛋白的純化及鑒定

IPTG大量誘導(dǎo)表達pET-30a(+)-RACK1融合蛋白，用6×His-Tagged Protein Purification Kit純化包涵體蛋白，獲得了較高純度的與預(yù)期分子質(zhì)量一致的His-RACK1融合蛋白(圖4).

2.5Western blot鑒定RACK1蛋白

以抗人RACK1兔源多克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗兔為二抗，進行Western blot鑒定.檢測到與預(yù)期分子質(zhì)量大小一致的特異性條帶(圖5)，可見純化后的融合蛋白具有與特異性抗體結(jié)合的能力.

M.蛋白Maker(ku)；1.純化后的目的蛋白.圖4　His-RACK1蛋白的純化結(jié)果Fig.4　Purification analysis of target protein by SDS-PAGE

1，2.純化后RACK1蛋白.圖5　Western blot鑒定純化后RACK1蛋白的特異性Fig.5　Identification of RACK1 protein by Western blot

3　討論

1991年，RACK1作為蛋白激酶C的胞內(nèi)受體而被首次發(fā)現(xiàn)[2]，關(guān)于RACK1的研究逐漸增多.RACK1全長951 bp，含有8個外顯子和7個內(nèi)含子，基因定位在染色體5q35.3.看家基因RACK1編碼合成RACK1蛋白.RACK1含有317個氨基酸，分子質(zhì)量為36 ku，是一種高度保守的接頭蛋白，細胞質(zhì)內(nèi)游離的Gβ樣支架蛋白.RACK1可作為潛在的腫瘤標志物，在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、黑色素瘤、口腔鱗狀細胞癌、卵巢癌肝癌、胃癌和前列腺癌中，RACK1表達發(fā)生明顯變化.RACK1作為框架分子、接頭分子和錨定分子，通常募集多種信號分子，形成復(fù)合物，參與活性分子胞內(nèi)轉(zhuǎn)位、受體-配體親和性、轉(zhuǎn)錄翻譯活性、細胞發(fā)育、運動與生長以及免疫應(yīng)答等多項細胞功能調(diào)控.除了能與PKCs和Src酪氨酸激酶相互作用外，RACK1還可與磷酸二酯酶PDE4D5[23]、整合素β[24]、keratin[25]和spectrin[26]等結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞活動.

本課題組在前期研究人胃腺癌腫瘤標志物Lgr5的生物學功能過程中，利用酵母雙雜交大規(guī)模文庫篩選技術(shù)，發(fā)現(xiàn)RACK1為Lgr5的候選相互作用蛋白，并用生物信息學方法預(yù)測了其間有極大相互作用的可能性，究竟RACK1在Lgr5參與的人胃腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起到什么樣的作用，目前尚不清楚.為了進一步利用GST-pulldown等實驗驗證RACK1與Lgr5的相互作用關(guān)系，需要獲得高純度的RACK1蛋白用于下一步研究.因而本研究采用基因工程手段，以人胎肝cDNA文庫為模板，成功克隆RACK1 cDNA全長序列，構(gòu)建了pET-30a(+)-RACK1原核表達載體，在體外表達并獲得了大量的人RACK1融合蛋白.本實驗中選用的載體pET-30a(+)是帶有6個組氨酸標簽的質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達后形成的融合蛋白可通過方便快捷的鎳離子親和層析法進行純化，鎳離子親和層析法是利用融合于重組蛋白的組氨酸標記物與Ni2+特異性結(jié)合，從而結(jié)合于吸附有Ni2+的層析介質(zhì)上，隨后將其洗脫以達到分離的目的.利用此方法獲得了純度較高的RACK1蛋白.本實驗結(jié)果為進一步研究其在胃腺癌發(fā)生發(fā)展過程中介導(dǎo)Lrg5的生物學作用奠定了一定的工作基礎(chǔ).

[1]MCCAHILL A, WARWICKER J, BOLGER G B, et al.The RACK1 scaffold protein:a dynamic cog in cell response mechanisms [J].Molecular Pharmacology, 2002,62(6):1261-1273.DOI:10.1124/mol.62.6.1261.

[2]MOCHLY-ROSEN D, KHANER H, LOPEZ J.Identification of intracellular receptor proteins for activated protein kinase C [J].Biochemistry, 1991,88(9):3997-4000.DOI:10.1073/pnas.88.9.3997.

[3]RON D, JIANG Z, YAO L, et al.Coordinated movement of RACK1 with activated βIIPKC [J].The Journal of Biological Chemistry, 1999,274(38):27039-27046.DOI:10.1074/jbc.274.38.27039.

[4]STEBBINS E G, MOCHLY-ROSEN D.Binding specificity for RACK1 resides in the V5 region of βII protein kinase C [J].The Journal of Biological Chemistry, 2001,276(32):29644-29650.DOI:10.1074/jbc.M101044200.

[5]MAMIDIPUDI V, CARTWRIGHT C A.A novel pro-apoptotic function of RACK1:suppression of Src activity in the intrinsic and Akt pathways [J].Oncogene Article, 2009,28(50):4421-4433.DOI:10.1038/onc.2009.293.

[6]NAHAR-GOHAD P, SULTAN H, ESTEBAN Y, et al.RACK1 identified as the PCBP1-interacting protein with a novel functional role on the regulation of human MOR gene expression [J].Journal of Neurochemistry, 2013,124(4):466-477.DOI:10.1111/jnc.12100.

[7]KIM E, CLARK A L, KISS A, et al.μ- and κ-opioids induce the differentiation of embryonic stem cells to neural progenitors [J].The Journal of Biological Chemistry, 2006,281(44):33749-33760.DOI:10.1074/jbc.M603862200.

[8]BRILLET K, DA CONCEICAO M M, PATTUS F, et al.Bioprocess parameters of cell growth and human mu opioid receptor expression in recombinant Drosophila S2 cell cultures in a bioreactor [J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006,28(5):291-293.DOI:10.1007/s00449-005-0033-0.

[9]HARBURG G C, HALL F S, HARRIST A V, et al.Knockout of the mu opioid receptor enhances the survival of adult-generated hippocampal granule cell neurons [J].Neuroscience, 2007,144(1):77-87.DOI: 10.1016/j.neuroscience.2006.09.018.

[10]LENNON F E, MIRZAPOIAZOVA T, MAMBETSARIEV B, et al.Overexpression of the μ-opioid receptor in human non-small cell lung cancer promotes Akt and mTOR activation, tumor growth, and metastasis [J].Anesthesiology, 2012,116(4):857-867. DOI:10.1097/ALN.0b013e31824babe2.

[11]BORTSOV A V, MILLIKAN R C, BELFER I, et al.μ-Opioid receptor gene A118G polymorphism predicts survival in patients with breast cancer [J].Anesthesiology, 2012,116(4):896-902.DOI:10.1097/ALN.0b013e31824b96a1.

[12]EGIDY G, JULE S, BOSSE P, et al.Transcription analysis in the MeLiM swine model identifies RACK1 as a potential marker of malignancy for human melanocytic proliferation [J].Molecular Cancer,2008,7:34.DOI:10.1186/1476-4598-7-34.

[13]CAO X X, XU J D, XU J W, et al.RACK1 promotes breast carcinoma proliferation and invasion/ metastasis in vitro and in vivo [J].Breast Cancer Research and Treatment, 2010,123(2):375-386.DOI:10.1007/s10549-009-0657-x.

[14]NAGASHIO R, SATO Y, MATSUMOTO T, et al.Expression of RACK1 is a novel biomarker in pulmonary adenocarcinomas [J].Lung Cancer, 2010,69(1):54-59.DOI:10.1016/j.lungcan.2009.09.015.

[15]WANG Z, ZHANG B, JIANG L, et al.RACK1, an excellent predictor for poor clinical outcome in oral squamous carcinoma, similar to Ki67 [J].European Journal of Cancer, 2009,45(3):490-496.DOI:10.1016/j.ejca.2008.11.012.

[16]WANG Z, JIANG L, HUANG C, et al.Comparative proteomics approach to screening of potential diagnostic and therapeutic targets for oral squamous cell carcinoma [J].Molecular & Cellular Proteomics, 2008,7(9):1639-1650.DOI:10.1074/mcp.M700520-MCP200.

[17]SUBAUSTE M C, VENTURA-HOLMAN T, DU L, et al.RACK1 downregulates levels of the pro-apoptotic protein Fem1b in apoptosis-resistant colon cancer cells [J].Cancer Biology & Therapy, 2009,8(23):2297-2305.DOI:10.4161/cbt.8.23.10262.

[18]SHI S, DENG Y Z, ZHAO J S, et al.RACK1 promotes non-small-cell lung cancer tumorigenicity through activating sonic hedgehog signaling pathway [J].The Journal of Biological Chemistry, 2012,287(11):7845-7858.DOI:10.1074/jbc.M111.315416.

[19]ZHANG X Y, TANG L Z, REN B G, et al.Interaction of MCM7 and RACK1 for activation of MCM7 and cell growth [J].The American Journal of Pathology, 2013,182(3):796-805.DOI:10.1016/j.ajpath.2012.11.020.

[20]SWAMINATHAN G, CARTWRIGHT C A.Rack1 promotes epithelial cell-cell adhesion by regulating E-cadherin endocytosis [J].Oncogene, 2012,31(3):376-389.DOI: 10.1038/onc.2011.242.

[21]DENG Y Z, YAO F, LI J J, et al.RACK1 suppresses gastric tumorigenesis by stabilizing the β-catenin destruction complex [J].Gastroenterology,2012,142(4):812-823.DOI:10.1053/j.gastro.2011.12.046.

[22]MAMIDIPUDI V, DHILLON N K, PARMAN T, et al.RACK1 inhibits colonic cell growth by regulating Src activity at cell cycle check points [J].Oncogene, 2007,26(20):2914-2924.DOI: 10.1038/sj.onc.1210091.

[23]BIRD R J, BAILLIE G S, YARWOOD S J.Interaction with receptor for activated C-kinase 1 (RACK1) sensitizes the phosphodiesterase PDE4D5 towards hydrolysis of cAMP and activation by protein kinase C [J].The Biochemical Journal, 2010,432(1):207-216.DOI:10.1042/BJ20101010.

[24]DEEVI R K, COX O T, O'CONNOR R.Essential function for PDLIM2 in cell polarization in three-dimensional cultures by feedback regulation of the β1-integrin-RhoA signaling axis [J].Neoplasia, 2014,16(5):422-431.DOI:10.1016/j.neo.2014.04.006.

[25]KR?GER C, LOSCHKE F, SCHWARZ N, et al.Keratins control intercellular adhesion involving PKC-α-mediated desmoplakin phosphorylation [J].The Journal of Cell Biology, 2013,201(5):681-692.DOI:10.1083/jcb.201208162.

[26]MYKLEBUST L M, HORVLI O, RAAE A J.RACK1 (receptor for activated C-kinase 1) interactions with spectrin repeat elements [J].Journal of Molecular Recognition, 2015,28(1):49-58.DOI:10.1002/jmr.2411.

(責任編輯：趙藏賞)

Cloning and expression of human RACK1 gene

WANG Xiangfei, TANG Jingzhen, SHAN Jinshuai, LIU Chang, WU Chen

(College of Life Science, Hebei University, Baoding 071002, China)

HumanRACK1 gene was cloned and constructed to pET-30a(+) prokaryotic expression vector.RACK1 protein was expressed and purified and identified by Western blot.A pair of primers was designed according to the digestion sites in pET-30a(+) and theRACK1 gene sequence published on GeneBank.RACK1 cDNA was amplified from a human fetal liver cDNA library and constructed into pET-30a(+) vector.The recombinant expression vector was transformed into the hostE.coliDH5α.The positive clone was identified by double enzyme digestion and sequencing analysis.The recombinant expression vector pET-30a(+)-RACK1 was highly expressed inE.coliBL21 (DE3) under the induction of IPTG.The fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and purified by 6×His-Tagged Protein Purification Kit.The purified RACK1 protein was confirmed by Western blot.The results showed that theRACK1 cDNA sequence we cloned was right.The recombinant expression vector pET-30a(+)-RACK1 was successfully constructed.The fusion protein was expressed as inclusion body, which was purified by affinity chromatography.The result of Western blot indicated that the purified RACK1 protein could bind its specific antibody.The obtained human RACK1 protein laid a good foundation for further study on RACK1.

human RACK1; gene cloning; prokaryotic expression; protein purification

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.012

2015-10-23

國家自然科學基金資助項目(30800180)；河北省自然科學基金資助項目(C2009000191; C2013201112)；河北省教育廳優(yōu)秀青年基金(Y2012024)

王向飛(1989-)，女，河南洛陽人，河北大學在讀碩士研究生.E-mail:18330249598@163.com

吳琛(1977-)，女，河北保定人，河北大學教授，主要從事腫瘤分子生物學研究.E-mail:dawnwuchen@163.com

Q78

A

1000-1565(2016)03-0293-07