心臟營(yíng)養(yǎng)素-1促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞時(shí)心肌α-actin、β-MHC、GATA4和Nkx2-5基因的表達(dá)

徐敏，寧險(xiǎn)峰，錫洪敏，高宏，李自普

心臟營(yíng)養(yǎng)素-1促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞時(shí)心肌α-actin、β-MHC、GATA4和Nkx2-5基因的表達(dá)

徐敏，寧險(xiǎn)峰，錫洪敏，高宏，李自普

目的 探討心臟營(yíng)養(yǎng)素-1（CT-1）促進(jìn)經(jīng) 5-氮雜胞苷（5-aza）誘導(dǎo)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）分化為心肌樣細(xì)胞時(shí)心肌 α-actin、β-MHC、GATA4、Nkx2-5 基因的表達(dá)。

方法 分離、純化 UCMSCs，第 4 代 UCMSCs 分別以普通培養(yǎng)基（A 組）和含 0.1 nmol/L CT-1 培養(yǎng)基（B 組）培養(yǎng)；經(jīng) 5-aza 誘導(dǎo)的第 4 代 UCMSCs 分別以普通培養(yǎng)基（C 組）、含不同濃度 CT-1 培養(yǎng)基 D 組（D1組0.01 nmol/L、D2組 0.1 nmol/L、D3組 1.0 nmol/L）培養(yǎng)。應(yīng)用熒光定量 PCR 檢測(cè)各基因的表達(dá)。

結(jié)果 UCMSCs 培養(yǎng) 2 ～ 3 d 后細(xì)胞貼壁，逐漸由圓形變?yōu)殚L(zhǎng)纖維樣；經(jīng) 5-aza 誘導(dǎo)分化后可見(jiàn)心肌樣細(xì)胞，但未見(jiàn)自發(fā)性搏動(dòng)。RT-PCR 檢測(cè)顯示 B 組和 C 組 α-actin、β-MHC、GATA4 和 Nkx2-5基因的表達(dá)較 A 組均無(wú)明顯增加；α-actin、GATA4 和 Nkx2-5基因在 D 組較 A 組表達(dá)明顯增加，其中 α-actin 基因在 D2組表達(dá)最高，GATA4基因在 D1組表達(dá)最高，Nkx2-5 基因在 D3組表達(dá)最高，而 β-MHC 基因在 D 組表達(dá)未見(jiàn)增加。

結(jié)論 CT-1 可明顯促進(jìn) 5-aza 誘導(dǎo)的 UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞，且心肌樣細(xì)胞 α-actin、GATA4、Nkx2-5 的基因表達(dá)與 CT-1 的濃度有關(guān)。

間質(zhì)細(xì)胞； 心肌細(xì)胞，心臟； 心臟營(yíng)養(yǎng)素-1； 阿扎胞苷

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(5):420-425

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化成心肌樣細(xì)胞的潛能已在動(dòng)物模型和體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［1-3］，國(guó)內(nèi)已有使用骨髓干細(xì)胞成功移植治療擴(kuò)張型心肌病的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)可明顯改善患者心功能及心肌重塑［4］。國(guó)外亦有報(bào)道，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶泽w移植骨髓干細(xì)胞可明顯改善左室功能［5］。Nartprayut 等［6］比較了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）分化為心肌樣細(xì)胞的潛能，發(fā)現(xiàn)所有心肌特異性表面標(biāo)記在 UCMSCs 組表達(dá)均明顯增加，而僅有部分心肌特異性表面標(biāo)記在BMMSCs 組表達(dá)增加，提示 UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞的潛能較 BMMSCs 強(qiáng)。因此，能否應(yīng)用誘導(dǎo)后的 UCMSCs 修復(fù)受損心肌成為目前國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一［6-8］。目前的研究顯示誘導(dǎo)后的 UCMSCs 轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的效率較低［9］，如何高效促進(jìn) UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

心臟營(yíng)養(yǎng)素-1（cardiotrophin-1，CT-1），屬于白介素-6 家族新成員，在心臟發(fā)育中有重要的作用，尤其對(duì)心肌肥大的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)［10］；在缺血性心臟病患者血清中 CT-1 升高，在體外 CT-1 可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化［11］，引起心肌細(xì)胞增生肥大和肌小節(jié)形成，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞肥厚［12］。國(guó)內(nèi)已有 CT-1 促進(jìn)大鼠 BMMSCs 誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的研究［11］，但 CT-1 是否可促進(jìn)UCMSCs 分化為心肌細(xì)胞尚不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn) UCMSCs 可自發(fā)分化為少量心肌樣細(xì)胞，CT-1 可明顯促進(jìn) 5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）誘導(dǎo) UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞，且以濃度0.01 mmol/L 時(shí)促進(jìn)作用最明顯，但具體機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè) CT-1 促進(jìn) 5-aza誘導(dǎo) UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞時(shí)心肌特異性基因 α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）、β-肌凝蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）、GATA4 和 Nkx2-5的表達(dá)情況，旨在探討 CT-1 促進(jìn)增加 5-aza 誘導(dǎo)UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和材料 無(wú)污染的健康足月兒臍帶來(lái)自青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，均簽署知情同意書(shū)。5-氮胞苷購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；CT-1 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司。

1.1.2 儀器 梯度 PCR 儀為德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit）和熒光定量 PCR 擴(kuò)增試劑盒（SYBR Premix EX TAqTMII）均為寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品；Light Cycler RT-PCR 擴(kuò)增儀 Rotor-Gene3000 為上海天呈科技有限公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；超微量分光光度計(jì) K5500 為北京凱奧公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 UCMSCs 分離與培養(yǎng) 取無(wú)污染的健康足月兒臍帶用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗，去除殘留血液，無(wú)菌條件下用剪刀將臍帶組織剪成直徑 1 ～ 2 mm 的組織塊，放入離心管中，經(jīng) 0.1%膠原酶 II 和 0.25% 胰蛋白酶于 37 ℃消化后以1200 r/min 過(guò)濾離心 10 min，收集離心沉淀細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞按 106個(gè)/cm2接種于包被好的T25 培養(yǎng)瓶中，加入含 10% 胎牛血清和 1% 青鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基，置于含有 5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞 80% 融合后用已消毒的 PBS 溶液沖洗瓶底，加入 0.125% 胰蛋白酶溶液（含 l% 依地酸鈉鈣）消化，當(dāng)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底脫落下來(lái)后，用血清終止胰蛋白酶作用；將消化下來(lái)的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1200 r/min 離心5 min 后將收集的細(xì)胞重懸于 DMEM 培養(yǎng)基中，按 1∶3 比例傳代接種至 2 個(gè)新的包被好的 T25培養(yǎng)瓶中，置于含有 5% CO2、37 ℃ 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，記錄并拍照。

1.2.2 試驗(yàn)分組和誘導(dǎo)分化 取第 4 代UCMSCs 分 6 組：A 組（培養(yǎng)基 + UCMSCs），B組（培養(yǎng)基 + UCMSCs + 0.1 nmol/L CT-1），C 組（培養(yǎng)基 + UCMSCs + 10 μmol/L 5-aza），D1組（培養(yǎng)基 + UCMSCs + 10 μmol/L 5-aza+ 0.01 nmol/L CT-1），D2組（培養(yǎng)基 + UCMSCs + 10 μmol/L 5-aza + 0.1 nmol/L CT-1），D3組（培養(yǎng)基 + UCMSCs + 10 μmol/L 5-aza + 1.0 nmol/L CT-1）。2 μg/支 CT-1 用 10% 胎牛血清分別稀釋到不同濃度。

誘導(dǎo)分化過(guò)程如下：第 4 代 UCMSCs 按照1 × 104個(gè)/cm2接種 6 孔培養(yǎng)板，加入 DMEM 培養(yǎng)基和 10% 胎牛血清（FBS）培養(yǎng)，待細(xì)胞融合到 60% ～ 70%，棄去培養(yǎng)基，用 L-DMEM 洗滌細(xì)胞 2 次后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度的誘導(dǎo)劑和 CT-1，孵育 24 h 后去除培養(yǎng)基，用 L-DMEM洗滌細(xì)胞 2 次后，改用 10% FBS 普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，每 3 天做一次半量換液，待細(xì)胞融合 80% 左右后，按照 1 × 104個(gè)/cm2傳代。誘導(dǎo)后第 28 天，獲取細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)期間分別于誘導(dǎo)分化前和誘導(dǎo)分化后 24 h、48 h、1 周、2 周、3 周、4 周于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，記錄并拍照。1.2.3 總 RNA 提取和 cDNA 合成 收集細(xì)胞，以 1200 r/min 離心 5 min，去除上清液，沉淀中加入 1 ml Trizol，反復(fù)吹打，吸出所有裂解液置于 1.5 ml Microtube 管中，室溫下靜置 5 min；加200 μl 氯仿，劇烈振蕩 15 s，室溫下靜置 3 min；4 ℃ 下，以 1200 r/min 離心 15 min；吸取上清液400 μl 至 1.5 ml Microtube 管中，加 50 μl 異丙醇混勻，室溫下靜置 15 min；再次 4 ℃ 1200 r/min 離心 15 min；棄上清，加乙醇洗滌后 4 ℃ 1200 r/min離心 5 min；棄上清，于空氣中晾干 RNA 10 min；加 50 μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解 RNA，-80℃ 保存待用。

選擇完整性良好的 RNA 樣本，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit）說(shuō)明書(shū)合成 cDNA。在 Microtube 管中配制 10 μl 反應(yīng)體系：dNTP Mixture 1 μl，Oligo dT Prime 1 μl，Template RNA 2 μl，RNase Free H2O 6 μl。在梯度 PCR 儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)：65 ℃ 5 min，4 ℃ 30 s。將該Microtube 管離心 30 s 使混合液聚集于 Microtube管底部。在上述 Microtube 管中配置 20 μl 反應(yīng)體系：上述變性、退火后反應(yīng)液 10 μl，5 × PrimeScript Buffer 4 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，PrimeScript RTase 0.5 μl，RNase Free H2O 5 μl。在 PCR 儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 1 min。用超微量分光光度計(jì) K5500 測(cè)定所得 DNA A260/A280比值在 1.6 ～ 1.9，將合成的 cDNA -20 ℃保存待用。

表 1 各目的基因及內(nèi)參基因的 PCR 引物Table 1 The PCR primers of target genes and reference gene

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，見(jiàn)表 1。將各引物離心30 s 后按引物合成報(bào)告單配制成 100 μmol/L 的貯存液，用蒸餾水稀釋 20 倍，配制成 5 μmol/L 的貯存液，-20 ℃ 保存待用。按照熒光定量 PCR 擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因 α-actin、β-MHC、GATA4和 Nkx2-5 定量 PCR 擴(kuò)增。A、B、C、D1、D2、D3組獲得的 cDNA 作為 PCR 擴(kuò)增的 DNA 模板，分別與目的基因和內(nèi)參基因的 PCR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體步驟如下：在 Microtube 管中配制 20 μl 反應(yīng)體系：SYBR Premix EX TAqTMII（2 ×）10 μl，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μl，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μl，DNA模板 2 μl，dH2O 6.4 μl，在 PCR 儀上進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)過(guò) 95 ℃ 預(yù)變性 5 min，98 ℃ 變性 10 s，54 ～ 62 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，重復(fù) 40 ～45 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸 10 min。在 real-time PCR反應(yīng)的指數(shù)期，設(shè)定熒光信號(hào)閾值，該閾值是以PCR 反應(yīng)前 15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)；Ct（Cycle threshold）值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，將 Ct 值作為樣本表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)標(biāo)本重復(fù) 3 次，Ct 值取平均值；使用 2-△△Ct法［13］計(jì)算各組相關(guān)基因的表達(dá)量：△△Ct =（Cttarget- Ctref）實(shí)驗(yàn)組-（Cttarget-Ctref）對(duì)照組，Cttarget：目的基因的 Ct 值；Ctref：內(nèi)參基因的 Ct 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 UCMSCs 形態(tài)

新鮮分離的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng) 2 ～ 3 d后，培養(yǎng)瓶底即出現(xiàn)散在的貼壁細(xì)胞，形態(tài)以圓形為主，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變得不均一，1 周后多數(shù)呈圓形、梭形、纖維樣或者多角形（圖 1A）。傳代后的細(xì)胞密度漸分布均勻，細(xì)胞生長(zhǎng)也均勻一致，多數(shù)沿胞體長(zhǎng)軸呈單層的旋渦狀或輻射狀，細(xì)胞變大，梭形為主（圖 1B）。消化傳代后，細(xì)胞3 ～ 4 h 內(nèi)迅速貼附瓶壁，2 ～ 3 d 后細(xì)胞可達(dá)到80% ～ 90% 融合程度。每次傳代，細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增 2 ～3 倍。細(xì)胞傳代過(guò)程中，細(xì)胞的形態(tài)及增殖能力無(wú)明顯改變。

圖 1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)（A：原代細(xì)胞培養(yǎng) 1 周，呈圓形、梭形、纖維樣或者多角形；B：細(xì)胞傳至第 4 代，細(xì)胞生長(zhǎng)均勻一致，多數(shù)沿胞體長(zhǎng)軸呈單層的旋渦狀或輻射狀，細(xì)胞變大，以梭形為主）Figure 1 The morphology of umbilical cord mesenchymal stem cells （A： Culture primary cell for 1 week， round， fusiform，polygonal or fiber shaped； B： Cells spread to the fourth generation. Cell growth is uniform and look like a single vortex or radial along the long axis of the cell body. The cells become large， spindle shaped）

圖2 誘導(dǎo)分化后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)（A：1 w，細(xì)胞數(shù)目較前增多，形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主；B：2 w，細(xì)胞變成多角形，胞體增大；C：3 w，部分細(xì)胞發(fā)生空泡樣改變，可見(jiàn)細(xì)胞間有融合，排列方向漸趨向一致；D：3 w 后，細(xì)胞形態(tài)和排列方向變得不規(guī)則）（× 100）Figure 2 The morphology of umbilical cord mesenchymal stem cells after differentiation （A： 1 w， the number of cells is increased，and the morphology is dominated by long spindle shape； B： 2 w， cells become polygonal and bigger； C： 3 w， some of the cells have the vacuole， and there is a convergence between the cells. The direction of their arrangement is consistent； D： After 3 w， cell morphology and cell arrangement direction all become irregular） （× 100）

圖3 基因 α-actin、β-MHC、GATA4 和 Nkx2-5在各實(shí)驗(yàn)組中的 2-△△Ct值Figure 3 2-△△Ctof α-actin， β-MHC， GATA4， Nkx2-5 gene in each group

2.2 誘導(dǎo)分化后 UCMSCs 的形態(tài)

誘導(dǎo)后 1 周內(nèi)細(xì)胞增長(zhǎng)速度無(wú)明顯減慢，細(xì)胞數(shù)目增多，形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主（圖 2A），UCMSCs誘導(dǎo) 2 周后細(xì)胞增生速度減慢，形態(tài)發(fā)生變化，由原來(lái)的長(zhǎng)梭狀變成多角形，胞體增大（圖 2B），3 周后細(xì)胞體積繼續(xù)增大，部分細(xì)胞發(fā)生空泡樣改變，細(xì)胞間可見(jiàn)融合，形成細(xì)胞集落，相鄰集落細(xì)胞之間出現(xiàn)連接，排列方向漸趨向一致（圖 2C）；繼續(xù)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞增殖能力減慢，形態(tài)變得不規(guī)則，排列方向不一致（圖 2D）。在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，未發(fā)現(xiàn)有明顯的心肌肌管形成，亦未觀察到可自發(fā)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。

2.3 目的基因的表達(dá)

基因 α-actin、β-MHC、GATA4 和 Nkx2-5 與其內(nèi)參基因在 A、B、C、D1、D2、D3組中的 RT-PCR基因擴(kuò)增曲線呈 S 型，有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期、線性期及平臺(tái)期，曲線起峰 Ct 值 10 ～ 25，所有曲線走型光滑，顯示擴(kuò)增效果理想。

基因 α-actin、β-MHC、GATA4 和 Nkx2-5在單純加入 0.1 nmol/L CT-1 的 B 組和單純加入10 μmol/L 5-aza 的 C 組較 A 組均無(wú)明顯表達(dá)；除 β-MHC 基因外，α-actin、GATA4 和 Nkx2-5基因在同時(shí)加入不同濃度 CT-1 和 10 μmol/L 5-aza的 D 組較 A 組表達(dá)明顯增加，其中 α-actin 基因在 D2組的表達(dá)最明顯，GATA4 基因在 D1組的表達(dá)最明顯，Nkx2-5 基因在 D3組的表達(dá)最明顯（圖 3）。

3 討論

有關(guān)干細(xì)胞的心肌再生治療已經(jīng)經(jīng)歷了大量實(shí)驗(yàn)室研究和臨床實(shí)踐，目前研究和應(yīng)用最多的是BMMSCs，然而，BMMSCs 的獲取具有創(chuàng)傷性，并且供者的年齡影響其分化能力。近些年來(lái)，具有來(lái)源豐富、無(wú)倫理問(wèn)題、低免疫原性和多向分化潛能等優(yōu)勢(shì)的 UCMSCs 引起人們的關(guān)注；Nartprayut等［6］發(fā)現(xiàn)在分化為心肌樣細(xì)胞潛能方面 UCMSCs優(yōu)于 BMMSCs。5-aza 是常用的促間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化劑，但誘導(dǎo)分化率不高；Chen 等［11］聯(lián)合應(yīng)用 5-aza 和 CT-1 促 BMMSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，分化率較單純應(yīng)用 5-aza 明顯增高；Monserrat 等［10］發(fā)現(xiàn) CT-1 與心肌肥大的嚴(yán)重程度密切相關(guān)；我們的前期研究結(jié)果證實(shí)未進(jìn)行誘導(dǎo)分化的 UCMSCs 可自發(fā)表達(dá)少量心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物，加入 CT-1 后，UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)心肌特異性基因的表達(dá)情況，以進(jìn)一步了解 CT-1 促進(jìn) 5-aza 誘導(dǎo) UCMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)顯示基因 α-actin、GATA4 和 Nkx2-5在單獨(dú)加入 CT-1 的 B 組和單獨(dú)加入 5-aza 的C 組均無(wú)明顯表達(dá)，而在同時(shí)加入 0.1 μmol/L CT-1和 10 μmol/L 5-aza 的 D 組較空白對(duì)照組 A 組表達(dá)明顯增加，提示 α-actin、GATA4 和 Nkx2-5基因參與了心肌細(xì)胞的形成和發(fā)育，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果證實(shí)目的基因在 D 組明顯表達(dá)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符，但各目的基因之間對(duì) CT-1 敏感的濃度存在差異，考慮各目的基因的具體作用機(jī)制及表達(dá)方式尚未完全明確，亦考慮不同的濃度可能會(huì)影響各基因的表達(dá)量，尚待驗(yàn)證。

心肌肌動(dòng)蛋白（α-actin）是心肌肌小節(jié)中細(xì)肌絲的重要組成部分，并通過(guò)作用于相鄰的肌小節(jié)和心肌細(xì)胞使心肌收縮同步［14］。不同研究組分別在心肌致密化不全和擴(kuò)張型心肌病的患者中發(fā)現(xiàn)了基因 α-actin 突變［15-16］；Jiang 等［17］發(fā)現(xiàn)在心衰患者中 α-actin 表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)，并證實(shí)與心肌細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。因此，基因 α-actin 在心肌細(xì)胞的形成、發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的作用。GATA4 作為一種心肌轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于心肌細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段，并通過(guò)調(diào)控心肌某些基因的轉(zhuǎn)錄活性參與心臟形成的整個(gè)過(guò)程，如心房利鈉因子、肌鈣蛋白、β-MHC 等［18］，并在擴(kuò)張型心肌病的患者中發(fā)現(xiàn)了基因 GATA4 突變［19］，Brody 等［20］在擴(kuò)張型心肌病小鼠模型中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)致病基因GATA4 的一個(gè)全新靶點(diǎn)基因 Lrrc10?；?Nkx2-5作為特異性心肌轉(zhuǎn)錄因子，同樣也參與了心臟發(fā)生、發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，尤其是心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)［21］，在胚胎時(shí)期 Nkx2-5 的缺失會(huì)導(dǎo)致死胎或心臟畸形［22］，在先天性心臟病的患者中也發(fā)現(xiàn)了基因 Nkx2-5突變［23］，上述內(nèi)容證明基因 α-actin、GATA4 和Nkx2-5 均參與了心臟的起源、發(fā)育及病變過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，目的基因在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了 CT-1 促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞。

我們也注意到加入 CT-1 后，目的基因β-MHC 表達(dá)未見(jiàn)明顯增加，與文獻(xiàn)報(bào)道不符；推測(cè)可能原因有：①本實(shí)驗(yàn)體外誘導(dǎo)分化的條件與文獻(xiàn)報(bào)道不完全相同；②目的基因 β-MHC 的擴(kuò)增曲線雖可見(jiàn)明顯的指數(shù)期，線性期及平臺(tái)期，擴(kuò)增曲線走型光滑，但其曲線起峰 Ct 值在 25 ～ 30 之間，起峰較晚，因此可能存在循環(huán)數(shù)不夠而造成表達(dá)下降；③選擇的引物特異性不高。

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Objective To investigate the express of α-actin， β-MHC， GATA4， Nkx2-5 gene which are effected by cardiotrophin-1 （CT-1） on differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells （UCMSCs） in vitro with 5-azacytidine （5-aza）.

Methods The UCMSCs isolated and purified from umbilical cord were divided into several groups respectively as ordinary culture medium of UCMSCs （Group A）， culture medium with 0.1 nmo1/L CT-1 （Group B）， ordinary culture medium including 10 μmol/L 5-aza only （Group C）， culture medium combined with different concentration of CT-1 and 10 μmol/L 5-aza （Group D）. The group D includes three subgroups based on the concentration of CT-1： D10.01 nmol/L CT-1， D20.1 nmo1/L CT-1， D31.0 nmo1/L CT-1. The fluorescent quantitation PCR was used to detect the expression levels of the α-actin， β-MHC， GATA4， Nkx2-5 gene.

Results After culture for 2 or 3 days， UCMSCs adhereed to the wall， and gradually became from spherical to long fiber-like. Differentiated UCMSCs treated with 5-aza and CT-1 distinctly showed morphological characteristics of myocyte-like cells， yet spontaneous contraction of few cells wasn't observed. There was no significant expression level of target genes in group B， C as compared with control group A. The expression levels of α-actin， GATA4， Nkx2-5 in group D were much higher than that in control group A， and each of them was sequentially highest in group D2， D1and D3， respectively. However， there was no significant expression level of β-MHC between group D and control group A.

Conclusions The phenomenon of UCMSCs differentiating into cardiomyocyte-like cells can be promoted by CT-1. The expression levels of α-actin， GATA4， Nkx2-5 are associated with the concentration of CT-1.

Author Affiliations： Department of Cardiorenal Pediatrics （XU Min， LI Zi-pu）， Vasculocardiology Department （NING Xian-feng），Neonatal Department （XI Hong-min）， Stem Cell Center （GAO Hong）， Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):420-425

The expression of α-actin， β-MHC， GATA4， Nkx2-5 gene during the process of umbilical cord mesenchymal stem cells differentiating into cardiomyocyte-like cells promoted by cardiotrophin-1

XU Min， NING Xian-feng， XI Hong-min， GAO Hong， LI Zi-pu

Mesenchymal stem cells； Myocytes， cardiac； Cardiotrophin-1； Azacitidine

LI Zi-pu， Email： 13370871121@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.006

青島市科技支撐計(jì)劃（10-3-4-3-15-jch）

266003 青島大學(xué)附屬醫(yī)院心腎免疫兒科（徐敏、李自普），心血管內(nèi)科（寧險(xiǎn)峰），新生兒科（錫洪敏），干細(xì)胞中心（高宏）

李自普，Email：13370871121@163.com

2016-04-18