不同代次人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的生物活性比較研究

章毅，許惠利，王鋒，王哲，李春麗，陳亮

不同代次人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的生物活性比較研究

章毅，許惠利，王鋒，王哲，李春麗，陳亮

目的 旨在觀察不同代次人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（PMSCs）體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性和體外誘導(dǎo)分化潛能，為間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性及有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方法 無菌條件下獲取人足月胎兒胎盤組織，通過 II 型膠原酶消化法分離 PMSCs，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至第9 代，倒置相差顯微鏡觀察 P0、P3、P6、P9 代次的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)；MTT 活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及表面標(biāo)志物的陽性表達(dá)率。同時(shí)進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo) 14 d 后分別進(jìn)行油紅 O 染色、茜素紅 S 染色、Masson 染色鑒定，觀察并比較不同代次 PMSCs 的多向誘導(dǎo)分化能力。

結(jié)果 PMSCs 具有很強(qiáng)的貼壁能力，主要呈紡錘梭形，不同代次的 PMSCs 有不同的體外增殖能力，以P0、P3 代較強(qiáng)；均高表達(dá) CD73、CD90、CD105，低表達(dá) CD14、CD34、CD45 和 CD20。細(xì)胞周期中 G0/G1 期細(xì)胞所占比例 P0為 90.95%、P3 為 88.97%、P6 為 85.93%、P9 為 67.89%，誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)顯示，P6、P9 代細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化能力逐漸降低。

結(jié)論 提示在選擇胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞時(shí)，應(yīng)注意選擇適宜的擴(kuò)增代數(shù)，以便既能保證足夠的細(xì)胞數(shù)目又能保留細(xì)胞最佳的分化能力。

胎盤； 間質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞周期； 多向誘導(dǎo)分化

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(5):400-406

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可被誘導(dǎo)分化成各種組織細(xì)胞，包括骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等［1］。最新研究表明，MSCs 易于外源基因?qū)氡磉_(dá)［2］，而且具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能［3］，因此不僅可作為組織工程的種子細(xì)胞，也為基因治療提供了一個(gè)可靠的工具，同時(shí)在誘導(dǎo)移植耐受和治療自身免疫性疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前報(bào)道的 MSCs 主要來源于骨髓，但骨髓中的含量很低，僅占骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的 1/106～ 1/105［4］，且有時(shí)因病毒感染或因衰老使骨髓中細(xì)胞數(shù)量顯著降低或骨髓增生分化功能降低，使骨髓來源的 MSCs受到了限制。故尋找一種能替代骨髓 MSCs，并可彌補(bǔ)其缺陷的 MSCs 來源已越來越受到重視［5］。

胎盤是胎兒與母體之間進(jìn)行物質(zhì)交換的器官，起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層，是由間質(zhì)、血管及滋養(yǎng)細(xì)胞組成，含有大量的間充質(zhì)成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細(xì)胞，由于其細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、表面抗原標(biāo)志、基因表達(dá)等與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高度相似，而且也具有多向分化的潛能。從胎盤中分離培養(yǎng)出這些多能干細(xì)胞將為實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用開辟一個(gè)嶄新而豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞來源［6］。

為了使 PMSCs 能更好、更持久地應(yīng)用于臨床修復(fù)組織細(xì)胞和器官，在移植前評(píng)估此細(xì)胞的生物活性顯得尤為重要，目前國(guó)內(nèi)外研究表明，各代PMSCs 增殖能力及生物活性是否相同仍無定論［7］。關(guān)于 PMSCs 不同代次生物活性的系統(tǒng)研究更是少之又少，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同代次 PMSCs 的增殖能力、細(xì)胞周期及多向誘導(dǎo)分化潛能進(jìn)行觀察分析，為種子細(xì)胞移植的選取提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

胎盤采自足月健康新生兒，在符合國(guó)家相關(guān)法律和倫理委員會(huì)同意下，經(jīng)產(chǎn)婦或家屬簽署知情同意書后獲得。成脂、成軟骨、成骨誘導(dǎo)套裝購自美國(guó) Gibco 公司；MTT 試劑盒購自碧云天公司；PI、RNase A 購自美國(guó) Sigma 公司；MSC PhenotypingKit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP）購自德國(guó)Miltenyi Biotec 公司；油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液購自南京建成公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購自美國(guó) Thermo 公司；顯微設(shè)備購自美國(guó) Olympus 公司；流式細(xì)胞儀購自美國(guó) BD Bioscience 公司。

1.2 方法

1.2.1 PMSCs 的分離培養(yǎng) 無菌條件下剪取胎盤絨毛膜組織，剪成約 5 mm3的碎塊，加入 II 型膠原酶恒溫消化 1.5 h，室溫條件下以 2000 r/min離心 10 min，加入含 10% FBS 的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)黏附性差異使 PMSCs 與其他組織細(xì)胞分離，經(jīng)過表面標(biāo)志物鑒定，從而確定為 PMSCs。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞融合度達(dá)到 80% ～ 90% 時(shí)，胰酶消化傳代，每 2 ～ 3 天傳代 1 次。

1.2.2 不同代次細(xì)胞形態(tài)觀察、生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期檢測(cè)

1.2.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 取 P0、P3、P6、P9 代PMSCs，當(dāng)貼壁細(xì)胞均生長(zhǎng)到匯合度為 80% 左右時(shí)，對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.2.2 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（MTT 法） 收集P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔1 × l04個(gè)細(xì)胞接種于 7 塊 96 孔板，每孔加完全培養(yǎng)基至總體積 200 μl，在 37 ℃，5% CO2濃度恒溫孵箱中培養(yǎng)，24 h 后每天取一塊板檢測(cè)，向檢測(cè)板的每個(gè)孔中加 MTT 溶液 20 μl，在 37 ℃，5% CO2濃度恒溫箱孵育 4 h 后，每孔加入 150 μl DMSO，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度（A）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為 570 nm，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.2.3 PMSCs 細(xì)胞周期檢測(cè) 取 P0、P3、P6、 P9 代指數(shù)期的 PMSCs，加入 1 ml 預(yù)冷 70 % 乙醇，混勻后 4 ℃ 過夜，每管樣品中加入 5 μl RNA酶，37 ℃ 孵育 30 min，每管加入 10 μl PI 染液，室溫避光孵育 30 min 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每代次 PMSCs 有 3 個(gè)重復(fù)樣本。采用 ModFit LT 軟件獲取并分析結(jié)果。

1.2.3 PMSCs 表面標(biāo)志物檢測(cè) 取 P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，用 1 ml PBS 調(diào)整細(xì)胞總數(shù)為 5 × 106個(gè)，分別加入標(biāo)記抗體 CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP 作為同型對(duì)照，室溫避光孵育 30 min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo 7.6.1軟件獲取并分析結(jié)果。

1.2.4 PMSCs 多向分化潛能及染色鑒定 取P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，以 5 × 103/ml 密度接種于 6 孔板中，置于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% 的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到60% ～ 70% 時(shí)，分別更換為成脂、成軟骨及成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，并設(shè) DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)為對(duì)照孔，每 3 ～ 4 天換液 1 次。每代 PMSCs 重復(fù)3 個(gè)樣本，每個(gè)樣本 3 個(gè)復(fù)孔。誘導(dǎo) 14 d 后，成脂誘導(dǎo)、成軟骨誘導(dǎo)、成骨誘導(dǎo)分別用油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液染色并進(jìn)行鑒定，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同代次 PMSCs 傳代后形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期的比較

2.1.1 不同代次 PMSCs 形態(tài)觀察結(jié)果 倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的 PMSCs 接種 48 h后，大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)為典型成纖維細(xì)胞樣，3 ～ 5 d 可發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞增殖形成細(xì)胞島，6 ～ 9 d后所有細(xì)胞島匯合成單細(xì)胞層鋪滿全皿，中間散在些透亮圓形雜細(xì)胞。P0 和 P3 代均為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞排列緊密，成旋渦狀或放射狀生長(zhǎng)（圖 1A、B）。而 P6 和 P9 代成短梭形或多邊形，細(xì)胞體積變大，成旋渦狀或網(wǎng)狀排列（圖 1C、D）。

圖1 不同代次胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)（A：P0 代；B：P3 代；C：P6 代；D：P9 代）（10 × 10）Figure 1 The growth and morphology of human PMSCs （A： P0； B： P3； C： P6； D： P9） （10 × 10）

2.1.2 不同代次 PMSCs 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果 用MTT 方法繪制的不同代次 PMSCs 體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖 2 所示，各代細(xì)胞與 P0 代比較增殖能力出現(xiàn)明顯差異，P0、P3 代細(xì)胞在培養(yǎng) 2 ～3 d 細(xì)胞數(shù)即達(dá)到倍增；P6 在培養(yǎng) 2 ～ 4 d 達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)期，6 ～ 7 d 進(jìn)入平臺(tái)期；P9 代細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度緩慢。

圖2 MTT 法繪制不同代次胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Figure 2 The growth curves of PMSCs at different passages

圖3 不同代次胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期［A：P0 代；B：P3 代；C：P6 代；D：P9 代；P0、P3 增殖能力最強(qiáng)；隨著傳代次數(shù)的增加，G0/G1 期細(xì)胞逐漸降低，而（S + G2/M）期細(xì)胞逐漸增多］Figure 3 Cell cycles of PMSCs at different passages ［A： P0； B： P3； C： P6； D： P9； The cells of P0 and P3 have the highest proliferation ability. The percentage of G0/G1 become lower and lower， relatively， the percentage of （S + G2/M） become higher and higher with subculture］

2.1.3 不同代次 PMSCs 細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)比較不同代次 PMSCs 體外細(xì)胞周期水平，結(jié)果顯示大部分細(xì)胞均處于 G0/G1 期，G0/G1 期細(xì)胞 P0（90.95%）、P3（88.97%）、P6（85.93%）、P9（67.89%）；S 期與 G2/M 期分別是 P0（9.05%）、P3（11.02%）、P6（14.07%）、P9（32.11%）（圖 3）。從中可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，G0/G1 靜止期逐漸減少，而（S + G2/M）期細(xì)胞逐漸增多。

2.2 不同代次 PMSCs 表面標(biāo)記物的比較

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同代次PMSCs 表面標(biāo)記物 CD14/CD20/CD34/CD45 含量在 0.5% 以下，均為低表達(dá)；同時(shí)強(qiáng)陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)抗原 CD73、CD90、CD105，表達(dá)率 ＞ 98%（圖 4）。不同代次間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)率無明顯差異。

2.3 不同代次的 PMSCs 多向誘導(dǎo)分化

PMSCs 成脂誘導(dǎo) 14 d，油紅 O 染色結(jié)果顯示 P0、P3、P6 代細(xì)胞胞漿周圍均含有大小不等的脂滴，脂滴被染成紅色（圖 5 B1 ～ D1）。隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，P0、P3 代細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，仍為梭形，誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞的數(shù)目增多，P0 代細(xì)胞胞質(zhì)聚攏飽滿，脂滴充滿整個(gè)胞漿，P3 代胞質(zhì)稍有擴(kuò)散，脂滴增多且變大；而 P6、P9 代細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形或多角形，誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞數(shù)目明顯減少，P6 代細(xì)胞胞質(zhì)擴(kuò)散，脂滴數(shù)目減少，P9 脂滴數(shù)目更少且小。

PMSCs 成骨誘導(dǎo) 14 d，茜素紅 S 染色結(jié)果顯示，P0、P3、P6 代細(xì)胞出現(xiàn)大量橘紅色沉淀，呈圓形或類圓形或堆積成片狀，有明顯的“礦化”結(jié)節(jié)形成且數(shù)量上呈遞減趨勢(shì)（圖 5B2 ～ D2），P9 代細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后形成的“礦化”結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少（圖 5E2）。

PMSCs 成軟骨誘導(dǎo) 14 d，倒置相差顯微鏡下觀察 P0、P3、P6、P9 代細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞扁平伸展，由長(zhǎng)梭形變成多邊多角形態(tài)，具有軟骨細(xì)胞樣的形態(tài)（圖 5B3 ～ E3）；經(jīng) Masson 染色結(jié)果顯示 P0、P3、P6 代細(xì)胞膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)紫色，P9 代染色呈陽性明顯減少。Masson 染色在 P0、P3 代時(shí)陽性率最強(qiáng)，P6、P9 代時(shí)呈遞減趨勢(shì)。

3 討論

在組織工程和臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療中，干細(xì)胞種類的選擇是決定治療效果的重要因素，以往常以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為治療的首選［8］。但取髓會(huì)給供者帶來很大痛苦，且有時(shí)因病毒感染或因衰老使骨髓中細(xì)胞數(shù)量顯著降低或是骨髓增生分化功能減低，使骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞受到限制。近年來研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分布廣泛，在骨髓、胎盤、肌肉、脂肪、骨、軟骨等組織中均含有間充質(zhì)干細(xì)胞。人胎盤是人類妊娠期間胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長(zhǎng)成的母子間進(jìn)行物質(zhì)交換的器官，由胚胎發(fā)育而成，它的來源更加原始，所以它的可塑性和分化能力更強(qiáng)［9-10］；同時(shí)胎盤屬于醫(yī)療廢棄物，獲取方便，不需要侵入性的操作等特點(diǎn)［11-12］，其中含豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，是極具價(jià)值的干細(xì)胞來源。

PMSCs 生物活性與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高度相似，可在體外培養(yǎng)，具有強(qiáng)大的向多種組織分化的特性，在適當(dāng)?shù)臈l件下可被誘導(dǎo)分化為韌帶細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等［13］，因此在許多疾病包括骨/軟骨缺損或發(fā)育不良、韌帶損傷、心肌梗死、肝功能衰竭和糖尿病等的治愈提供了新的方法和途徑，為醫(yī)學(xué)界攻克這些人類疑難病癥提供了希望。

圖4 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)（不同代次間充質(zhì)干細(xì)胞均強(qiáng)陽性表達(dá) CD73-APC、CD90-FITC、CD105-PE，表達(dá)率 ＞ 98%；低表達(dá) CD14/CD20/CD34/CD45-PerCP，表達(dá)率 ＜ 0.5%）Figure 4 Surface antigens of PMSCs （The CD73-APC、CD90-FITC and CD105-PE were highly expressed by all the mesenchymal stem cells of different generations， the positive expression rate ＞ 98%. Relatively， low expressed CD14/CD20/CD34/CD45-PerCP，and the rate ＜ 0.5%）

圖5 不同代次人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞 14 d 誘導(dǎo)分化染色（40 × 10）Figure 5 After multipotent differentiation for 14 d， staining of PMSCs at different passages （40 × 10）

為了使 PMSCs 能更好、更持久地應(yīng)用于臨床修復(fù)組織細(xì)胞和器官，在移植前評(píng)估此細(xì)胞的生物活性顯得尤為重要，本實(shí)驗(yàn)研究不同代次 PMSCs的增殖能力、細(xì)胞周期及多向誘導(dǎo)分化潛能。隨著體外培養(yǎng)代次的不斷增加，細(xì)胞形態(tài)由 P0 代排列緊密的長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)榫W(wǎng)狀排列的短梭形，細(xì)胞體積變大，貼壁不牢，易于消化。通過 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，了解 P0、P3、P6、P9 代次細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示 P0 ～ P3 代間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯高于 P6、P9 代，P9 代細(xì)胞已沒有經(jīng)典的生長(zhǎng)曲線，增殖速度也明顯變緩。本實(shí)驗(yàn)的形態(tài)觀察結(jié)果、生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)結(jié)果以及細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果高度吻合，PMSCs 在體外培養(yǎng)時(shí)，隨著細(xì)胞代次的增加，細(xì)胞會(huì)逐漸出現(xiàn)老化現(xiàn)象。并且此結(jié)果與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及其他動(dòng)物來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果相似，均是隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力和分化潛力降低。

關(guān)于 PMSCs 表面標(biāo)志已開展了大量研究工作，卻一直沒有明確的定論，直至 2006 年國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)干細(xì)胞委員會(huì)提出間充質(zhì)干細(xì)胞定義標(biāo)準(zhǔn)為 CD73、CD90、CD105 陽性率 ≥ 90%，同時(shí)低表達(dá) CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79α或 CD19、HLA-DR，表達(dá)率 ≤ 2%［14］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)與此標(biāo)準(zhǔn)一致，低表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志分子CD34、CD45，髓樣單核細(xì)胞分化抗原 CD14，B 細(xì)胞分化抗原 CD20，表達(dá)率 ＜ 0.5%，強(qiáng)陽性表達(dá)Thy-1 CD90，5'-核苷酸酶 CD73，內(nèi)皮糖蛋白CD105，表達(dá)率 ＞ 98%。表明可從胎盤中獲得高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞，且不同代次 PMSCs 表面標(biāo)志無明顯差異。

本實(shí)驗(yàn)世界范圍內(nèi)首次通過流式細(xì)胞術(shù)顯示不同代次 PMSCs 的細(xì)胞周期差異，結(jié)果顯示大部分細(xì)胞均處于 G0/G1 期，但 P0 代處于 G0/G1期細(xì)胞明顯多于 P9 代 G0/G1期細(xì)胞，從中可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，間充質(zhì)干細(xì)胞處于G0/G1 靜止期細(xì)胞逐漸減少，而（S + G2/M）期細(xì)胞逐漸增多，說明隨著間充質(zhì)干細(xì)胞傳代次數(shù)增多，盡管保持干細(xì)胞樣形態(tài)并表達(dá)間充質(zhì)主要表面標(biāo)記抗原但多向分化潛能逐漸降低。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，G0/G1 期細(xì)胞比例越高，表明此細(xì)胞具有高度分化的潛能［15］，本實(shí)驗(yàn)與此結(jié)論一致。此外，通過對(duì)不同代次 PMSCs 進(jìn)行多向誘導(dǎo)分化證實(shí)，細(xì)胞傳代培養(yǎng)至 P9 代仍然具有誘導(dǎo)分化潛能，但較之P0 代細(xì)胞分化能力顯著下降。再次證明隨著細(xì)胞傳代培養(yǎng)，PMSCs 的多向誘導(dǎo)分化能力隨著其干性減弱在逐漸降低。

總之，PMSCs 傳代至 P6 代以后，較之 P3 代增殖能力稍有降低，但仍可保持旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，而傳至 P9 代時(shí)生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎趟笮?，體積變大，而免疫表型并無明顯變化，細(xì)胞仍能維持 PMSCs 的基本生物學(xué)性狀。但是從細(xì)胞周期及多向誘導(dǎo)分化潛能發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，P6、P9 代細(xì)胞 G0/G1 期比例明顯減少，分化能力逐漸降低，說明體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后 PMSCs 的誘導(dǎo)分化潛能下降。而從胎盤中分離 P0 代細(xì)胞數(shù)量不足，不能滿足組織工程及臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療的需求，所以在選擇 PMSCs 作為種子細(xì)胞時(shí)，應(yīng)注意選擇適宜的擴(kuò)增代數(shù)，以便既能保證足夠的細(xì)胞數(shù)目又能保留細(xì)胞最佳的分化能力，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，P3 代細(xì)胞無論是在增殖能力還是多向分化的潛能方面都與 P0 代細(xì)胞并無顯著性差異，因此使用 P3 代以內(nèi)的細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞是較為理想的選擇。

志謝 感謝上海市臍帶血造血干細(xì)胞庫對(duì)于實(shí)驗(yàn)過程給予資金支持，感謝上海長(zhǎng)寧婦幼保健院提供實(shí)驗(yàn)材料，以及上海市臍帶血造血干細(xì)胞庫有關(guān)部門對(duì)于實(shí)驗(yàn)材料的保存和運(yùn)輸，感謝實(shí)驗(yàn)技術(shù)員協(xié)助實(shí)驗(yàn)的完成。

［1］ Pittenger MF， Mackay AM， Beck SC， et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science， 1999， 284（5411）：143-147.

［2］ Duan HF， Wu CT， Wu DL， et al. Treatment of myocardial ischemia with bone marrow-derived mesenchymal stem cells overexpressing hepatocyte growth factor. Mol Ther， 2003， 8（3）：467-474.

［3］ Ikehara S. New strategies for BMT， organ transplantation， and regeneration therapy. Hematology， 2003， 8（2）：77-81.

［4］ Hong Y， Huo SW， Lu Y， et al. Biological characters of mesenchymal stem cells separated from different components of human placenta. J Clin Rehabil Tissue Eng Res， 2014， 18（19）：3082-3087. （in Chinese）洪艷， 霍思維， 陸瑤， 等. 人胎盤不同組織分離間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性. 中國(guó)組織工程研究， 2014， 18（19）：3082-3087.

［5］ Campagnoli C， Roberts IA， Kumar S， et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood， liver， and bone marrow. Blood， 2001， 98（8）：2396-2402.

［6］ Fukuchi Y， Nakajima H， Sugiyama D， et al. Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential. Stem Cells，2004， 22（5）：649-658.

［7］ Bai JP， Li XY， Li X， et al. Proliferative abilities of placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages. J Clin Rehabil Tissue Eng Res， 2014， 18（10）：1591-1596. （in Chinese）

白金萍， 李秀英， 李雪， 等. 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后的增殖能力.中國(guó)組織工程研究， 2014， 18（10）：1591-1596.

［8］ Tuan RS， Boland G， Tuli R. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering. Arthritis Res Ther， 2003， 5（1）：32-45.

［9］ Sabapathy V， Ravi S， Srivastava V， et al. Long-term cultured human term placenta-derived mesenchymal stem cells of maternal origin displays plasticity. Stem Cells Int， 2012， 2012：174328.

［10］ Nazarov I， Lee JW， Soupene E， et al. Multipotent stromal stem cells from human placenta demonstrate high therapeutic potential. Stem Cells Transl Med， 2012， 1（5）：359-372.

［11］ Parolini O， Alviano F， Bagnara GP， et al. Concise review： isolation and characterization of cells from human term placenta： outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells， 2008， 26（2）：300-311.

［12］ Roson-Burgo B， Sanchez-Guijo F， Del Ca?izo C， et al. Transcriptomic portrait of human Mesenchymal Stromal/Stem Cells isolated from bone marrow and placenta. BMC Genomics， 2014， 15：910.

［13］ Antoniadou E， David AL. Placental stem cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol， 2016， 31：13-29.

［14］ Dominici M， Le Blanc K， Mueller I， et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy， 2006，8（4）：315-317.

［15］ Ding DC， Shyu WC， Chiang MF， et al. Enhancement of neuroplasticity through upregulation of beta1-integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted stroke model. Neurobiol Dis， 2007， 27（3）：339-353.

Objective To observe the biological characteristics and induced differentiation potential of human placenta derived mesenchymal stem cells （PMSCs） at different passages in vitro and to provide experimental evidences for the safety and efficacy in clinical application of PMSCs.

Methods The human term placenta were obtained in sterile condition. The PMSCs were isolated by digestion using collagenase II and in adherent cultur in vitro. The PMSCs were cultured into the 9thgenerations with the normal cultural condition， and the morphological features of the primary cells， 3rd， 6thand 9thgenerations of PMSCs were observed. The proliferative ability of PMSCs was detected by MTT assay and the growth curve was drawn. The cell cycle and the positive expression rates of the surface markers of the different generations of PMSCs were detected by flow cytometry （FCM）. Meanwhile， the PMSCs were induced to differentiate into adipocytes， osteoblasts and chondroblasts in vitro， and identified by staining with oil red O， alizarin red， Masson， respectively for 14 d after being induced. The multipotent differentiation potential of PMSCs from the different generation were assessed.

Results Placenta derived mesenchymal stem cells were mainly in spindle shaped adherent cells， and PMSCs at different passages had different proliferative capability in vitro， especially the primary cells and 3rdgenerations of PMSCs with more potent proliferative activities. The PMSCs were strongly expressed CD73， CD90， CD105 and lowly expressed CD14， CD34， CD45 and CD20. The proportion of G0/G1 phase in cell cycle was 90.95% at the primary cells， 88.97% at passage 3， 85.93% at passage 6，67.89% at passage 9. The multipotent differentiation potential of PMSCs at passages 6 and 9 were decreased.

Conclusion The appropriate amplification passage should be chose in order to obtain the cells with best differentiation potential and cell quantity when using placenta derived mesenchymal stem cells as seed cells.

Author Affiliation： Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co.， Ltd./China Stem Cell Group Co.， Ltd.，Shanghai 200051， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):400-406

Comparative study of biological activities of placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages

ZHANG Yi， XU Hui-li， WANG Feng， WANG Zhe， LI Chun-li， CHEN Liang

Placenta； Mesenchymal stem cells； Cell cycle； Induced multi-direction differentiation

s： CHEN Liang， Email： chenliang@shanghaicordblood.org； LI Chun-li， Email： lichunlicherry@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.003

上海市自然科學(xué)基金（16ZR1429200）；上海市科委研發(fā)平臺(tái)專項(xiàng)（16DZ2293000）；上海市嘉定區(qū)工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目

200051 上海市臍帶血造血干細(xì)胞庫/上海市干細(xì)胞技術(shù)有限公司/中國(guó)干細(xì)胞集團(tuán)有限公司

陳亮，Email：chenliang@shanghaicordblood.org；李春麗，Email：lichunlicherry@163.com

2016-08-01