碳點-熒光素?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移體系在阿司匹林測定中的研究與應(yīng)用

金文英 ，廖秀芬 ，陶慧林* ，趙　穎 ，劉紹州 ，梁永敏

(1.廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，桂林理工大學(xué)　化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西　桂林　541004；2.廣西產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，廣西　南寧　530007)

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碳點-熒光素?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移體系在阿司匹林測定中的研究與應(yīng)用

金文英1，廖秀芬2，陶慧林1*，趙穎2，劉紹州2，梁永敏1

(1.廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林541004；2.廣西產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，廣西南寧530007)

研究了經(jīng)L-y半胱氨酸修飾后的碳點(CDs)-熒光素(FAM)熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，并利用該體系建立了測定阿司匹林(ASP)的新方法。結(jié)果表明：在λex=330 nm下，于pH 7.0的Tris-HCl緩沖液中，CDs與FAM反應(yīng)5 min后能發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，能量供體CDs將能量轉(zhuǎn)移到受體FAM，使FAM的熒光顯著增強，而ASP的加入可有效猝滅FAM的熒光，且ASP濃度在1.0～150.0 μg/mL范圍內(nèi)與體系的熒光猝滅值ΔIF呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 6)，基于此建立了測定ASP的新方法。在最佳實驗條件下，方法的檢出限達0.33 μg/mL(3δ/k,n=11)，回收率為 97.1%～105.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于4.6%(n=6)。常見的無機離子以及與ASP同類型的藥物對測定影響較小，方法的選擇性較好。

碳點；熒光素；熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)；阿司匹林

阿司匹林(Aspirin，ASP)是從柳樹皮和柳葉中提取的傳統(tǒng)解熱鎮(zhèn)痛藥，現(xiàn)已廣泛用于解熱鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、預(yù)防暫時性腦缺血及中風(fēng)，治療腦血栓，預(yù)防心絞痛、心肌梗死[1]。同時，ASP可治療女性痛經(jīng)，治療腹瀉、膽道蛔蟲，也具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，針對不同的疾病，其用量各不相同。因此尋找阿司匹林含量測定的方法具有重要意義。目前測定ASP含量的方法主要有高效液相色譜法[2-3]、光度法[4-5]、電化學(xué)分析法[6-7]、熒光光譜法[8-9]等。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)是兩個熒光基團間的距離小于10 nm時熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[10-11]。由于FRET方法簡單、靈敏度高，在分析檢測領(lǐng)域得到了很大的發(fā)展[12-13]。碳點(Carbon dots，CDs)是一種新型的納米材料，具有發(fā)光性質(zhì)穩(wěn)定、熒光壽命長等特點，且與其他熒光材料相比具有更好的生物安全性，是一種優(yōu)良的光學(xué)材料[14-15]。CDs被引入FRET中，使其應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大。本文選用CDs 為能量供體，熒光素(Fluorescein,FAM)作為能量受體，構(gòu)建了一個新型的能量轉(zhuǎn)移體系，并將所建立的FRET體系應(yīng)用于阿司匹林腸溶片中阿司匹林含量的測定。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

RF-5301PC 熒光光度計(日本島津公司)，TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，F(xiàn)A1104電子分析天平(中國江蘇泰興市電子儀器廠)，pHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)，JEM-2010透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

ASP標(biāo)準(zhǔn)液(250.0 μg/mL)：使用時稀釋至所需濃度；FAM(10 μg/L，廣州化學(xué)試劑廠)；三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH 7.0)：配制0.10 mol/L的Tris母液，然后用0.10 mol/L HCl溶液調(diào)至相應(yīng)的pH值。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2實驗方法

1.2.1水溶性CDs的合成按文獻[16]稍作修改：在反應(yīng)釜中加入0.2 g檸檬酸鈉、1.5 g碳酸氫銨固體、10 mL水及50 μL 0.1 mol/L的L-y半胱氨酸在 180 ℃下反應(yīng) 4 h左右，冷卻裝置后，定容至100 mL，于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2測定方法于一系列 5 mL 比色管中加入一定量的 CDs，F(xiàn)AM和ASP，用 pH 7.0的Tris-HCl緩沖液定容至刻度，反應(yīng) 5 min 后，于λex=330 nm處測定相應(yīng)熒光強度IF。儀器的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為 5 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1碳點(CDs)的表征

透射電子顯微鏡(TEM)、紫外光譜法、熒光光譜法是對 CDs 進行表征的常見手段。用TEM可對CDs進行直觀的形貌觀察，以獲得其形狀、粒徑大小及分散性等信息。通過CDs的TEM圖(圖1A)可以看出所合成的 CDs 分散性較好，粒子尺寸分布較為集中。CDs的紫外吸收光譜和熒光光譜見圖1B，其最大吸收峰在343 nm，熒光發(fā)射峰在443 nm，Stokes位移100 nm。根據(jù)參考文獻，用硫酸奎寧作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Φs=0.55)[17]，計算得CDs的量子產(chǎn)率Φu為0.65。由此可見，本文所合成的CDs具有分散性好、粒度均勻、熒光量子產(chǎn)率高、峰形窄而對稱等特點。

圖1　CDs的TEM圖(A)以及吸收光譜和熒光光譜(B)Fig.1　TEM image(A),absorption and fluorescence spectra of CDs(B)a.absorption spectrum；b.fluorescence spectrum

2.2FRET體系的構(gòu)建

供體的熒光發(fā)射光譜和受體紫外吸收光譜有相當(dāng)程度的光譜重疊是分子間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的必要條件之一。對CDs的熒光光譜和FAM的吸收光譜進行分析可知，CDs的熒光峰在443 nm處，F(xiàn)AM的吸收峰在491 nm處，兩者差為48 nm。此外，根據(jù)參考文獻[18]，計算得光譜重疊面積J=2.8×10-14J/(cm3·L·mol-1)。說明供體CDs的熒光光譜與受體FAM的紫外吸收有較好的重疊，為二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移提供了前提條件。

圖2　CDs(a)、FAM(b)和CDs-FAM(c)的熒光光譜Fig.2　Fluorescence spectra of CDs(a),FAM(b)and CDs-FAM mixture(c)ρCDs=4.0 μg/mL,ρFAM=2.0 μg/mL

圖3　ASP對 CDs-FAM能量轉(zhuǎn)移體系的影響Fig.3　Effects of ASP on the FRET of CDs-FAMρASP:(a-j):0.0,1.0,4.0,8.0, 16.0,40.0,60.0,80.0,120.0,150.0 μg/mL；ρCDs=4.0 μg/mL；ρFAM=2.0 μg/mL

為了獲得理想的能量轉(zhuǎn)移效果，用330 nm激發(fā)混合體系。同一物質(zhì)在相同的濃度下分別繪制CDs、FAM和兩者混合物的熒光光譜，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，體系中供體CDs發(fā)生熒光猝滅，將能量有效地轉(zhuǎn)移給受體FAM，使FAM的熒光顯著增強，說明在CDs-FAM之間發(fā)生了有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

根據(jù) F?rster 非輻射能量轉(zhuǎn)移機制，影響能量轉(zhuǎn)移效率的主要因素是供體-受體之間的距離(r)和臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)。供體與受體之間的能量轉(zhuǎn)移效率E為[19]：

式中，F(xiàn)為加入能量給受體后給體的熒光強度；F0為未加入受體時給體的熒光強度；k2為偶極空間取向因子(取k2=2/3)，N為水和有機溶劑的平均折射率(取1.37)，Φ為供體的熒光量子產(chǎn)率，J為光譜重疊程度。根據(jù)前文計算結(jié)果Φ= 0.55，J=2.8×10-14J/(cm3·L·mol-1)。根據(jù)上式計算得E=0.66，R0=3.62 nm，r=3.25 nm，說明CDs與FAM間發(fā)生了有效的能量轉(zhuǎn)移。

圖4　CDs(a)及加入ASP前(b)、后(c)CDs-FAM的紫外吸收圖譜Fig.4　Absorption spectra of CDs(a),and CDs-FAM system before(b)and after(c)addition of ASP ρCDs=4.0 μg/mL,ρFAM=2.0 μg/mL;ρASP=16.0 μg/mL

2.3ASP對CDs-FAM體系的作用

考察了不同濃度ASP對CDs-FAM能量轉(zhuǎn)移體系的影響，結(jié)果如圖3所示。ASP能有效猝滅CDs-FAM體系中FAM的熒光強度，且隨著ASP濃度的增大，F(xiàn)AM的熒光猝滅程度增強。據(jù)此可以建立能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅體系體系測定ASP的新方法。

2.4實驗條件的優(yōu)化

按實驗方法，考察了pH值、反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等條件對 CDs-FAM-ASP體系的影響。實驗表明，pH 7.0時，ASP對體系的熒光猝滅最靈敏。因此考察了pH 7.0的不同緩沖介質(zhì)及其用量對體系的影響，發(fā)現(xiàn)加入4 mL Tris-HCl 緩沖液時可獲得最佳的猝滅效果。此外，體系在35 ℃下反應(yīng)5 min可達穩(wěn)定，并且可穩(wěn)定1 h以上。

表1　干擾物質(zhì)對體系的影響Table 1　Effect on the measurement result by interference

2.5工作曲線

按照“1.2.2”方法對不同濃度ASP進行檢測，并繪制工作曲線，結(jié)果顯示，體系的熒光猝滅值(ΔIF)與ASP 的濃度(ρ，μg/mL)在 1.0～150.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔIF=11.74ρ+4.34，相關(guān)系數(shù)(r)為 0.999 6，檢出限(3δ/k)為0.33 μg/mL。

2.6干擾實驗

ASP濃度為16 μg/mL 時，在最優(yōu)實驗條件下考察了部分共存物質(zhì)對體系的影響，結(jié)果如表1所示。由表1可知，當(dāng)相對誤差控制在±5%以內(nèi)時，常見陽離子、陰離子及小分子物質(zhì)對體系基本沒有影響，說明該體系對ASP具有較高的選擇性。

2.7樣品分析

考察了該 FRET 體系測定ASP的可行性和實用性，對ASP腸溶片(100 mg/粒)中ASP含量進行了檢測。參考文獻[20]進行樣品前處理：取阿司匹林腸溶片1 粒，研碎，加入 3～5 mL乙醇，待溶解后將溶液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，強烈振搖使阿司匹林溶解，再用乙醇定容至刻度。取50 μL 母液，按照實驗方法，定容至5 mL進行檢測，同時進行加標(biāo)回收實驗。結(jié)果測得ASP腸溶片中ASP的含量分別為96.8，98.0，102.1 mg/粒，方法回收率為97.1%～105.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于4.6%(見表2)。

表2　樣品的分析結(jié)果Table 2　Analytical results of samples

3　結(jié)　論

本文以CDs作為能量給體，F(xiàn)AM作為能量受體構(gòu)建了CDs-FAM FRET體系，對 CDs-FAM體系進行探討，計算了能量轉(zhuǎn)移體系的相關(guān)參數(shù)，并利用 CDs-FAM體系建立了測定ASP的新方法。在最佳實驗條件下，該方法對ASP的檢測范圍為1.0～150.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)(r)為 0.999 6，檢出限達 0.33 μg/mL。將方法應(yīng)用于阿司匹林腸溶片中ASP含量的測定，回收率為97.1%～105.3%,RSD不大于4.6%。該方法靈敏度高、選擇性好、操作簡單、線性范圍寬，同時具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，具有推廣應(yīng)用價值。

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Study on Carbon Dots-Fluorescein Fluorescence Resonance Energy Transfer System and Its Application in Aspirin Analysis

JIN Wen-ying1,LIAO Xiu-fen2,TAO Hui-lin1*,ZHAO Ying2,LIU Shao-zhou2,LIANG Yong-min1

(1.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection,College of Chemistry and Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin541004，China;2.Guangxi Zhuang Autonomous Region Testing Institute of Product Quality,Nanning530007,China)

A fluorescence resonance energy transfer(FRET)system between fluorescence carbon dots(CDs,donor)and fluorescein(FAM,acceptor)was constructed,and a novel method for the sensitive and selective determination of aspirin(ASP)was accordingly proposed.It was found that in pH 7.0 Tris-HCl buffer，effective energy transfer from CDs to FAM occurred,which resulted in a great enhancement of the fluorescence intensity of FAM.Upon the addition of ASP,fluorescence quenching of FAM occurred,and the change of FAM fluorescence intensity was in a good linearity(r=0.999 6)with ASP in the concentration range of 1.0-150.0 μg/mL.A novel fluorescence quenching platform for the determination of ASP was constructed.Under the optimum conditions,the detection limit of ASP for this method was 0.33 μg/mL(3δ/k,n=11),and the spiked recoveries ranged from 97.1%to 105.3%with RSD(n=6)not more than 4.6%.The result showed that common relevant substance,cations and anions did not interfere with the detection of ASP.

carbon dots;fluorescein;fluorescence resonance energy transfer(FRET);aspirin

2016-03-14；

2016-04-09

國家自然科學(xué)基金資助項目(61264007)；廣西高校食品安全與檢測重點實驗室資助項目

陶慧林，教授，研究方向：光譜分析，Tel:0773-5898551，E-mail：thl@glut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.013

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1147-05