重組膠原蛋白制備及其應(yīng)用研究進(jìn)展

唐云平,鄭　強(qiáng),胡　斌,蔡　謹(jǐn),黃　磊,徐志南,*

(1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310027;2.浙江麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,浙江麗水 323000)

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重組膠原蛋白制備及其應(yīng)用研究進(jìn)展

唐云平1,鄭強(qiáng)2,胡斌1,蔡謹(jǐn)1,黃磊1,徐志南1,*

(1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310027;2.浙江麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,浙江麗水 323000)

膠原蛋白由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物功能,在食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛。然而,從動(dòng)物組織中提取的膠原蛋白存在動(dòng)物源疾病等風(fēng)險(xiǎn),限制了其許多潛在用途的開(kāi)發(fā)。重組(類)膠原蛋白具有與天然膠原蛋白相似的性質(zhì)和功能,近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)重組(類)人膠原蛋白的表達(dá)進(jìn)行了廣泛的研究。本文綜述了近年來(lái)重組(類)人膠原蛋白表達(dá)、分離純化和應(yīng)用方面的研究進(jìn)展,為該重組蛋白的制備提供指導(dǎo)意義。

膠原蛋白,類膠原蛋白,重組表達(dá),純化,應(yīng)用

膠原蛋白是動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)中的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白。它由三股α-螺旋結(jié)構(gòu)的肽鏈纏繞形成的纖維狀蛋白,其一級(jí)結(jié)構(gòu)由(Gly-X-Y)n重復(fù)序列組成,其中X通常為脯氨酸,Y為羥脯氨酸或羥賴氨酸[1]。近年來(lái),膠原蛋白被廣泛用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。膠原蛋白主要從動(dòng)物結(jié)締組織中提取獲得,但從動(dòng)物組織中提取的膠原蛋白存在動(dòng)物源疾病等風(fēng)險(xiǎn),限制了其潛在應(yīng)用和開(kāi)發(fā)[2]。因此,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白就顯得非常重要。本文對(duì)重組(類)人膠原蛋白的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述并介紹了其在食品、化妝品和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用,為該重組蛋白的制備提供指導(dǎo)意義。

1　膠原蛋白和類人膠原蛋白

膠原蛋白是結(jié)締組織中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白,它的基本結(jié)構(gòu)是原膠原,每個(gè)原膠原分子都由三條α肽鏈組成,而每個(gè)α肽鏈都會(huì)形成左手螺旋,三條左手螺旋扭在一起形成一個(gè)大的右手螺旋結(jié)構(gòu)(圖1)。膠原蛋白的種類多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,目前發(fā)現(xiàn)的膠原蛋白至少有28種,但其基本結(jié)構(gòu)卻大同小異。

圖1　膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)Fig.1　Human collagen structures that arevisualized using PDB:IBKV in three different forms注:Tube(A),CPK(B)and ball and stick model(C)。

類人膠原蛋白則是根據(jù)人膠原蛋白的特性進(jìn)行優(yōu)化或引入特殊功能的氨基酸序列,通過(guò)重組表達(dá)獲得的具有類似膠原蛋白特性的蛋白。與傳統(tǒng)提取獲得的膠原蛋白相比,主要具有可加工性、無(wú)病毒隱患、水溶性好、批次穩(wěn)定和排異反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)。

2　重組(類)人膠原蛋白的異源表達(dá)

目前,許多重組表達(dá)系統(tǒng)被應(yīng)用于(類)人膠原蛋白的重組表達(dá),如大腸桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等,重組(類)人膠原蛋白的表達(dá)情況見(jiàn)表1。

表1　(類)人膠原蛋白在各表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)總結(jié)

2.1利用大腸桿菌表達(dá)(類)人膠原蛋白

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng),其遺傳背景清楚,發(fā)酵成本低、生產(chǎn)周期短、效率高,可以快速大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白,具備規(guī)?；a(chǎn)外源蛋白的潛力。目前,重組大腸桿菌生產(chǎn)的(類)人膠原蛋白主要分為羥基化和非羥基化兩大類。

2.1.1非羥基化的類人膠原蛋白大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于自身缺乏脯氨酸羥化酶,因此在單獨(dú)表達(dá)膠原蛋白時(shí)不能獲得羥基化的膠原蛋白。Yin等[3]在大腸桿菌中表達(dá)類人膠原蛋白[(GAPGAPGSQGAPGLQ)52],通過(guò)條件優(yōu)化可獲得0.1～0.2 g/L的重組類人膠原蛋白。Yao等[4]在大腸桿菌中表達(dá)類人膠原蛋白([GERGDLGPQGIAGQRGVV(GER)3GAS]8),產(chǎn)量為50～70 mg/L。

2.1.2通過(guò)添加羥脯氨酸獲得羥基化人膠原蛋白大腸桿菌自身缺乏脯氨酸羥化酶,但培養(yǎng)過(guò)程中,在含有高濃度NaCl的培養(yǎng)基中添加羥脯氨酸,可獲得羥基化的重組膠原蛋白[5]。但該法合成的膠原蛋白與來(lái)自于組織中的天然膠原有一定程度的差異,羥脯氨酸在Gly-X-Y三聯(lián)體中的X和Y位置均可能出現(xiàn),X位的脯氨酸發(fā)生羥化后會(huì)使得膠原蛋白的熱穩(wěn)定性減弱。

2.1.3通過(guò)與羥化酶共表達(dá)獲得羥基化(類)人膠原蛋白將(類)人膠原蛋白和脯氨酸羥化酶基因一起在大腸桿菌中共表達(dá)可獲得羥化的類人膠原蛋白。目前使用的脯氨酸羥化酶基因主要有病毒來(lái)源的羥化酶和人源脯氨酸羥化酶。例如,Rutschmann等[6]在大腸桿菌中將人源III型膠原蛋白和病毒來(lái)源的脯氨酸羥化酶一起共表達(dá),獲得羥化的重組膠原蛋白,產(chǎn)量為90 mg/L。但該羥化酶既能催化Gly-X-Y三聯(lián)體中X位的脯氨酸,也能催化Y位上的脯氨酸。因此,有必要對(duì)該羥化酶進(jìn)行分子改造,提高該酶對(duì)底物的專一性,使重組膠原蛋白的熱穩(wěn)定進(jìn)一步增強(qiáng)。本課題組[1]通過(guò)將類人膠原蛋白、人源脯氨酸羥化酶和D-阿拉伯糖-1,4-內(nèi)酯酶基因一起在大腸桿菌中共表達(dá),獲得了羥化的類人膠原蛋白,產(chǎn)量為0.26 g/L。雖然在大腸桿菌中可獲得羥化的類人膠原蛋白,但產(chǎn)量普遍不高,為滿足市場(chǎng)上對(duì)膠原蛋白的需求還須不斷的探索與改進(jìn)。

2.2利用酵母表達(dá)(類)人膠原蛋白

迄今為止,利用酵母表達(dá)(類)人膠原蛋白的研究較多,如畢赤酵母、漢遜酵母和釀酒酵母等[7-8,12-13]。其中利用畢赤酵母表達(dá)獲得的重組(類)人膠原蛋白的表達(dá)量和羥化效率最高。例如,Myllyharju等[7]將人源膠原蛋白I、II和III基因整合到含脯氨酸羥化酶的畢赤酵母工程菌中,獲得的重組膠原蛋白均能被充分羥基化且產(chǎn)量為0.2～0.6 g/L。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件,重組人源I、II和III型膠原蛋白在畢赤酵母中的產(chǎn)量分別可達(dá)1.1、0.7、1.5 g/L[8]?？偟脕?lái)說(shuō),(類)人膠原蛋白能夠在畢赤酵母中進(jìn)行充分的羥基化表達(dá),且隨著發(fā)酵產(chǎn)量的逐步提高,具備工業(yè)化生產(chǎn)的前景。

2.3利用動(dòng)植物表達(dá)(類)人膠原蛋白

國(guó)外對(duì)膠原蛋白在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中的重組表達(dá)也進(jìn)行了大量的研究,如轉(zhuǎn)基因鼠、蠶、玉米和番茄等。例如,Toman等[9]利用鼠的乳腺細(xì)胞中表達(dá)重組I型人膠原蛋白,產(chǎn)量為8 g/L,但該表達(dá)系統(tǒng)的培養(yǎng)基昂貴,操作繁瑣并不適合商業(yè)化生產(chǎn)。Adachi等[10]在蠶的中部絲腺中表達(dá)人I型膠原蛋白αI,重組蛋白在蠶繭中的含量達(dá)8%。Stein等[11]在番茄中將I型人膠原蛋白、人源脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶基因進(jìn)行共表達(dá),產(chǎn)量為20 g/L且羥脯氨酸和羥賴氨酸的含量分別為7.55%和0.74%,和天然I型人膠原蛋白非常接近,該技術(shù)已被Collplant公司用來(lái)商業(yè)化生產(chǎn)重組I型人膠原蛋白。

3　重組(類)膠原蛋白的分離純化

重組蛋白的分離純化是發(fā)酵產(chǎn)品規(guī)?；a(chǎn)的限制因素,純化費(fèi)用約占生產(chǎn)成本的20%～30%,甚至更高。目前,重組(類)膠原蛋白的分離純化方法主要有:親和層析法、鹽析沉淀法、離子交換層析法和凝膠過(guò)濾層析結(jié)合法等。Tang等[1]利用親和層析對(duì)重組類人膠原蛋白進(jìn)行了分離純化,回收率為68.6%。王曉軍等[14]利用硫酸銨沉淀、DEAE-52陰離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析對(duì)破碎液中重組類人膠原蛋白進(jìn)行大規(guī)模的分離純化,最終產(chǎn)物純度達(dá)98%,回收率為80.5%,達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

4　重組膠原蛋白的應(yīng)用

4.1在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

膠原蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用,主要包括以下幾方面:作為功能性食品和保健品，經(jīng)常食用膠原蛋白豐富的食品可增加皮膚組織細(xì)胞的儲(chǔ)水能力,增強(qiáng)和維持肌膚良好的彈性,延緩肌體衰老;作為肉制品改良劑,可影響肉類的嫩度,改善產(chǎn)品品質(zhì),提高蛋白質(zhì)含量;作為食品包裝材料,如人工腸衣等。重組(類)膠原蛋白應(yīng)用于食品領(lǐng)域的報(bào)道不多,俞園園將鋅和鈣等微量元素與重組類人膠原蛋白進(jìn)行螯合,獲得類人膠原蛋白-鋅、類人膠原蛋白-鈣等螯合物,為補(bǔ)鈣或補(bǔ)鋅等制劑的制備奠定基礎(chǔ)[15-16]。

4.2在化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用

膠原蛋白中含有大量羧基和羥基的氨基酸,如羥脯氨酸、羥賴氨酸以及甘氨酸等天然保濕因子,對(duì)皮膚具有很好的保濕效果。此外,膠原蛋白多肽與皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、增殖、遷移以及分化有關(guān),可提供養(yǎng)分從而延緩皮膚衰老并且還具有促進(jìn)皮膚的創(chuàng)面修復(fù)和抗輻射的作用,因而廣泛用于化妝品領(lǐng)域。

4.3在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

膠原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性和促進(jìn)血小板凝聚等生物學(xué)特性,是非常重要的天然生物材料。重組人源I型膠原蛋白制備成的海綿具有多孔微觀結(jié)構(gòu)和低炎癥反應(yīng)的特性,可被運(yùn)用于細(xì)胞組織的再生[8]。重組人源II型膠原蛋白能刺激細(xì)胞外軟骨基質(zhì)的更新合成,被應(yīng)用于軟骨再生[17]。此外,重組膠原蛋白還被應(yīng)用于混合仿生學(xué)或互穿網(wǎng)絡(luò)支架,如制備人工角膜等[18]。

5　前景與展望

由于其特有的三重螺旋結(jié)構(gòu)和功能特性,膠原蛋白可廣泛用于食品、化妝品、化工和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。雖然利用重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)(類)膠原蛋白的研究取得了一些進(jìn)展,但是還有很多問(wèn)題亟需解決。相信隨著技術(shù)水平的進(jìn)步和人們對(duì)基因重組蛋白的認(rèn)可,重組(類)膠原蛋白在食品、化妝品和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用也將得到進(jìn)一步的提高。

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Research progress on preparation and application of recombinant collagens

TANG Yun-ping1,ZHENG Qiang2,HU Bin1,CAI Jin1,HUANG Lei1,XU Zhi-nan1,*

(1.College of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China;2.College of Ecology,Lishui University,Lishui 323000,China)

Collagens have been widely used in food,cosmetic and biomedicine for its unique physical and chemical properties and biological functions. However,collagens used in these fields were commonly extracted from animal tissues,thus its application was limited by the risk of animal-derived contaminating pathogens and difficulties in the preparation. Recombinant human collagen-like proteins have the some properties and functions as the natural collagens. In recent years,human collagen-like proteins have been expressed in a variety of expression systems. The new research progress of bio-production and purification of recombinant collagen-like proteins and their application have been reviewed in this paper. This work will be helpful to the large-scale preparation of the recombinant human collagen-like proteins in the future.

collagen;collagen-like protein;recombinant expression;purification;application

2016-03-23

唐云平(1985-)，男，博士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：11128056@zju.edu.cn。

徐志南(1966-)，男，博士，教授，研究方向：生物化工，E-mail：znxu@zju.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21306164)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)18-0384-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.065