嗜酸乳酸桿菌發(fā)酵北蒼術的工藝優(yōu)化

武洪志，刁華杰，許靈敏，宋建樓，王芳芳，王志龍，刁新平，許麗

（東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030）

嗜酸乳酸桿菌發(fā)酵北蒼術的工藝優(yōu)化

武洪志，刁華杰，許靈敏，宋建樓，王芳芳，王志龍，刁新平*，許麗*

（東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030）

本試驗旨在研究嗜酸乳酸桿菌發(fā)酵北蒼術飼料添加劑的最佳工藝。應用單因素和響應面相結合的試驗設計，對所選擇的五個單因素（碳源、氮源、含水量、接種量和發(fā)酵時間）進行方差分析，將確定的對發(fā)酵效果（以北蒼術多糖含量變化為檢測指標）影響較大的因素進行響應面法優(yōu)化。試驗結果表明：（1）碳源和氮源對試驗效果影響較小，其關鍵因素為含水量、發(fā)酵時間和接菌量。（2）在含水量為47.77%，接菌量為6.62%，發(fā)酵時間為3 d條件下測得北蒼術多糖平均值為9.45%，與響應面預測值9.39%接近。（3）相較于未發(fā)酵北蒼術中5.58%的北蒼術多糖，發(fā)酵后北蒼術多糖提高了69.35%。此發(fā)酵工藝操作簡單，能顯著提高多糖含量，為發(fā)酵中草藥飼料添加劑的推廣應用提供理論依據(jù)。

飼料添加劑；北蒼術；多糖；發(fā)酵工藝

中草藥飼料添加劑的研發(fā)是依據(jù)我國中醫(yī)藥理論，科學使用，能扶正祛邪，健脾開胃，具有抗菌促生長、增強機體免疫力、改善動物品質等作用，且來源廣，價格低，具有安全無毒副作用，無殘留，無耐藥性和抗藥性，是抗生素的有效替代品之一（張鵬，2013）。北蒼術（Atractylodes chinensis）是菊科蒼術屬植物，性味辛、苦、溫，歸脾、胃經(jīng)，能健脾、燥濕、解郁、辟穢，主治胸膈煩悶、濕盛困脾、脾虛脹滿、嘔吐、瀉泄、痢疾、瘧疾、痰飲、水腫、風寒感冒等癥（國家藥典委員會，2010）。目前，對北蒼術等中草藥的加工基本仍以熬制為主（韓宇，2012），這便極大地限制了中草藥的應用范圍。本試驗應用嗜酸乳酸桿菌對北蒼術進行發(fā)酵，應用單因素和響應面相結合的試驗方法使其藥效得到最大化的釋放，且探索出簡單易操作的發(fā)酵工藝，使其大范圍的推廣應用成為可能，也為中草藥飼料添加劑取代抗生素類添加劑使用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料試驗中草藥：北蒼術，購于哈爾濱藥材市場。65℃烘干，粉碎后過40目篩，備用。供試菌株：嗜酸乳桿菌粉（購自雨潤公司）。儀器：超凈工作臺，DL-CJ-ZND，購于北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；紫外分光光度計，UV-2401PC，購于日本島津公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，BPN-80CW，購于上海一恒科學儀器有限公司；高壓滅菌鍋，MLS-3780，購于日本三洋公司；可調溫水浴鍋，DK-S12，購于上海森信實驗儀器有限公司；熱空氣消毒箱，GR140，購于上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電子天平，AR1140，購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；臺式高速冷凍離心機，Allegra 64R，購于美國Beckman Coulter公司；真空包裝機，DZ-400/2L，購于南通彩星工貿有限公司；超聲波提取機，KQ-500DB，購于昆山市超聲儀器有限公司；試劑：MRS肉湯培養(yǎng)基，購于北京陸橋技術有限責任公司；乙醇、葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、濃鹽酸及其他試劑均為分析純，購哈爾濱市德美實驗儀器經(jīng)銷有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1葡萄糖標準曲線的繪制精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標品10 mg，蒸餾水定容至100 mL，搖勻，即得0.1 mg/mL葡萄糖對照品溶液。精密吸取該溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL干燥具有塞試管中，以蒸餾水補足至1.0 mL，分別精密加入蒽酮-硫酸溶液（取0.10 g蒽酮，溶于100 mL 80%的濃硫酸中）4.0 mL，混勻后沸水浴10 min。以未加供試品的溶液為參比，在625 nm處測定吸光度值。通過對數(shù)據(jù)進行線性回歸，得到回歸方程Y=44.55x+0.026，R2= 0.997。標準曲線如圖1所示。

圖1　葡萄糖標準曲線

1.2.2樣品溶液的制備與測定精密稱取北蒼術樣品0.5 g于50 mL離心管中，加入3 mL乙醇，靜置30 min，超聲提取30 min，于3000 r/min離心機中離心15 min，棄上清液，重復上述操作一次，蒸干濾渣后加入2%HCl 30 mL，沸水浴提取1 h，離心取上清液于100 mL容量瓶中，重復操作一次，合并濾液后用2%HCl定容至刻度?；靹?，取1 mL于25 mL容量瓶中，用2%HCl定容至刻度。取制備的溶液1 mL于10 mL干燥的試管中，加入4 mL蒽酮硫酸溶液，混勻，水浴加熱10 min，在625 nm中測量其吸光度。測得未發(fā)酵蒼術多糖含量為5.58%。

1.2.3菌液的制備在無菌條件下，將購回的嗜酸乳桿菌菌粉按說明書比例，用事先滅菌的蒸餾水充分溶解，靜置，吸取1 mL菌溶液到裝有99 mL MRS培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中，加蓋密封，置于電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)24 h。復壯兩代后，通過平板計數(shù)法進行細菌計數(shù)，比較該菌正?；罹鷶?shù)（30億/g），來決定復壯次數(shù)。

取活化后的的菌種用接種環(huán)轉接到裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，密封，置于電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.4發(fā)酵工藝單因素試驗設計

1.2.4.1發(fā)酵試驗碳源、氮源的選擇由于嗜酸乳桿菌發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中碳源和碳源的含量對其影響較大，因此，需要對培養(yǎng)基中碳源和氮源的添加量對本試驗的影響進行驗證。精密稱取烘干后北蒼術20 g若干份，添加0、0.5%、1.0%和1.5%不同梯度量的碳源（葡萄糖），在北蒼術含水量50%，接菌量為6.0%的情況下，發(fā)酵2 d，烘干。以發(fā)酵后北蒼術多糖的含量為指標選擇添加葡萄糖的量。在添加最適葡萄糖的量后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0、0.5%、1.0%和1.5%不同梯度的氮源（蛋白胨），在北蒼術含水量50%，接菌量為6.0%的情況下，發(fā)酵2 d，烘干。以發(fā)酵后北蒼術多糖的含量為指標選擇添加蛋白胨的量。

1.2.4.2發(fā)酵試驗含水量的選擇精密稱取烘干后北蒼術20 g，平行3份，裝入發(fā)酵袋中，接入嗜酸乳桿菌6%，分別加入不同體積滅菌后的蒸餾水，使含水量達到20%、30%、40%、50%、60%，抽真空，在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中發(fā)酵2 d，碳源和氮源添加量由1.2.4.1得。烘干后取0.5 g，測發(fā)酵后多糖的含量。以發(fā)酵后多糖含量變化對北蒼術含水量多少進行優(yōu)化選擇。

1.2.4.3發(fā)酵試驗接菌量的選擇精密稱取烘干后北蒼術20 g，平行3份，裝入發(fā)酵袋中，分別接入不同體積的菌液，使接菌量達到2%、4%、6%、8%和10%，加入滅菌后的蒸餾水，使含水量達到

1.2.4.2優(yōu)選的結果，抽真空，在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中發(fā)酵2 d，碳源和氮源添加量由1.2.4.1得。烘干后取0.5 g，測發(fā)酵后多糖的含量。以發(fā)酵后多糖含量變化對北蒼術接菌量多少進行優(yōu)化選擇。

1.2.4.4發(fā)酵試驗發(fā)酵時間的選擇精密稱取烘干后北蒼術20 g，平行15份，均分5組，裝入發(fā)酵袋中，使接菌量為1.2.4.3優(yōu)選的量，含水量達到

1.2.4.2優(yōu)選的結果，抽真空，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中發(fā)酵，時間為1、2、3、4 d和5 d，碳源和氮源添加量由1.2.4.1得。烘干后取0.5 g，測發(fā)酵后多糖的含量。以發(fā)酵后多糖含量變化對北蒼術發(fā)酵時間進行優(yōu)化選擇。

1.2.5響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝

1.2.5.1發(fā)酵關鍵因素的確定在單因素試驗基礎上，利用SAS 9.3軟件分別比較含水量、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH的組間差異，確定對試驗結果有較大影響的關鍵因素。關鍵因素即對北蒼術多糖含量影響較大的因素。

1.2.5.2響應面優(yōu)化發(fā)酵條件利用Design Exepert.V.8.0.6.根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，采用響應面分析，建立北蒼術多糖含量與各關鍵因素的數(shù)學模型，通過計算分析優(yōu)化發(fā)酵北蒼術的最佳發(fā)酵條件。

1.2.5.3模型驗證試驗利用優(yōu)化后的發(fā)酵條件對響應面模型的預測結果進行驗證，試驗重復5次。分析響應面模型預測結果的準確性，以驗證試驗檢測值與理論預測值是否相符，進行可靠性分析，得到最后優(yōu)化發(fā)酵條件。

2　結果與分析

2.1影響北蒼術多糖含量的單因素試驗

2.1.1碳源和氮源的確定由圖2可知，添加不同比例的碳源（葡萄糖）和氮源（蛋白胨），發(fā)酵后多糖含量增加不明顯。碳源和氮源在1.0%時，發(fā)酵北蒼術多糖含量達到較大值。

圖2　不同添加量的碳源（A）和氮源（B）對發(fā)酵后北蒼術多糖含量的影響

2.1.2含水量的確定如圖3所示，含水量小于50%時，隨著含水量的增加，發(fā)酵后北蒼術多糖含量增加，當含水量達到50%時，蒼術多糖的含量最高，當含水量大于50%時，發(fā)酵后北蒼術多糖含量下降，所以選擇含水量50%進行其他單因素的篩選。

圖3　含水量對發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.3接菌量的確定如圖4所示，當接菌量小于8%時隨著接菌量的增加，北蒼術發(fā)酵后多糖含量逐漸升高，當接菌量高于8%時，蒼術發(fā)酵后多糖含量降低，因此選擇接菌量8%進行其他單因素的篩選。

圖4　接菌量對發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.4發(fā)酵時間的確定如圖5所示，隨發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵后北蒼術多糖的含量先增加后降低再增加，且發(fā)酵時間在3 d時，北蒼術發(fā)酵后多糖的含量較高，因此選擇發(fā)酵時間為3 d為最佳。

圖5　發(fā)酵時間對發(fā)酵后多糖含量的影響

2.2利用響應面法優(yōu)化北蒼術發(fā)酵工藝

2.2.1確定影響發(fā)酵的關鍵因素在碳源、氮源、含水量、接菌量和發(fā)酵時間5個單因素試驗結果的基礎上進行方差分析，通過比較其F值的大小，確定不同因素對發(fā)酵效果的影響。分析可知5個單因素對發(fā)酵效果影響大小依次是接菌量＞發(fā)酵時間＞含水量＞氮源＞碳源，碳源和氮源對發(fā)酵效果的影響很小，故含水量、接菌量和發(fā)酵時間三個因素為影響發(fā)酵效果的關鍵因素（表1）。每個因素選3個水平，用響應面進行進一步優(yōu)化。

表1　單因素試驗結果方差分析

2.2.2響應面優(yōu)化北蒼術發(fā)酵工藝根據(jù)Box-Behnken的中心組合設計原理，選擇含水量（X1）、接菌量（X2）、發(fā)酵時間（X3）作為響應面優(yōu)化的考察因素，以北蒼術多糖含量為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，如表2所示。

表2　響應面因素水平及設計

通過Design Expert.V.8.0.6.統(tǒng)計軟件，設計Box-Behnken中心組合設計。試驗設計及結果見表3。其中3、9、10、12、15組是中心試驗，其他組是析因試驗。以北蒼術多糖含量為響應值，每個發(fā)酵試驗重復三次。

表3　Box-Behnken試驗設計及多糖含量測定結果

2.2.3模型的建立及顯著性檢驗對Box-Behnken試驗結果進行方差分析，結果見表4。同時對模型進行可信度分析，結果見表5。

由表4可知，用F檢驗回歸方程各項對響應值的影響，該模型P值較低（P＜0.0001），回歸達到顯著水平（P＜0.05），具有分析意義。模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，本試驗模型失擬項P值為0.3796，大于0.05，模型失擬項不顯著，表示該模型與試驗結果數(shù)據(jù)非常契合。線性系數(shù)X1和二次項系數(shù)X1^2、X3^2對模型影響極顯著（P＜0.01），其他系數(shù)（X3、X1X2和X2X3）影響不顯著（P＞0.05）。

表4　回歸方程統(tǒng)計分析

表5　可信度分析

由表5可見，模型的相關性決定系數(shù)為0.9847，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9650，表示北蒼術多糖含量98.47%歸因于變量因子，只有約1.53%的總變異，模型不能解釋。C.V.表示單位均值上的離散程度，C.V.值越高試驗的可靠性越低，本試驗C. V.=1.1322%，說明只有約1.1322%的總變異該模型不能解釋，試驗可信。

對試驗結果進行二次線性回歸擬合，如表6所示。

表6　方程回歸系數(shù)估計

根據(jù)表6分析，得到數(shù)學模型為：

2.2.4各因素最佳水平分析對二次方程模型進行最優(yōu)化分析，得到各因素的最佳水平。當含水量為47.77%，接菌量為6.62%，發(fā)酵時間為3 d。此條件下預測北蒼術多糖含量最大值為9.39%。

2.2.5Box-Behnken響應面及等高線圖結合二次多項式擬合方程，運用Design Exepert.V.8.0.6.軟件，繪制響應曲面圖及等高線圖，從中可以直觀地看出各因素間的交互作用對北蒼術多糖含量的影響，如圖6、圖7、圖8所示。

在響應面試驗設計中，等高線所呈的形狀表示了交互效應的強弱，圓形表示交互效應不顯著，橢圓則表示顯著。同時，響應面模型可直觀地表現(xiàn)出兩因素對發(fā)酵效果的影響，響應面越陡峭、等高線越密集，兩因素相互作用對響應值的影響越大。由表6結合圖6、7、8可知，含水量和發(fā)酵時間兩個因素之間的交互效應達到了顯著水平，而含水量和接種量以及接種量與發(fā)酵時間之間的交互效應未達到顯著水平。

由圖6、7、8還可以看出，各交互因素的最佳作用點基本都落在了試驗所選范圍之內，證明此響應面試驗設計較為合理。

圖6　Y=f（X1，X2）的響應面和等高線圖

圖7　Y=f（X1，X3）的響應面和等高線圖

2.2.6模型驗證試驗在含水量為47.77%，接菌量為6.62%，發(fā)酵時間為3 d的發(fā)酵條件下，分別進行5次驗證試驗。實測北蒼術多糖平均值為9.45%，與預測值9.39%接近，進一步說明該數(shù)學模型能夠較好地預測實際發(fā)酵情況。

3　討論

3.1各因素對發(fā)酵效果的影響

3.1.1碳源和氮源對發(fā)酵效果的影響北蒼術是菊科蒼術屬植物，其本身就含有滿足微生物生長的碳源和氮源。不同微生物對碳源和氮源的需要量不同，本試驗中添加不同劑量的葡萄糖和蛋白胨，北蒼術多糖含量變化不明顯，這可能是嗜酸乳酸桿菌自身生長所需的碳源和氮源完全可由發(fā)酵培養(yǎng)基（北蒼術）提供，所以不需要額外添加碳源和氮源。

圖8　Y=f（X2，X3）的響應面和等高線圖

3.1.2料水比對發(fā)酵效果的影響在發(fā)酵試驗中，發(fā)酵原料的含水量多少是保證菌種正常生長活動的重要因素，含水量的不同會對發(fā)酵效果產生很大的影響。張苗蕾等（2009）研究含水量對牛糞和玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵的影響發(fā)現(xiàn)，在適宜的含水量下，發(fā)酵時產氣最高，含水量過高或過低都會使產氣降低。因此在適宜的含水量下，才能保證發(fā)酵的效果，含水量過高或過低都會影響發(fā)酵的品質。

3.1.3發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響培養(yǎng)基接菌量的不同，會影響菌種的生長狀況，對發(fā)酵效果有顯著的影響。吳暉等（2008）研究接菌量對枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕中蛋白酶活力的影響中發(fā)現(xiàn)，隨著接菌量的增加，蛋白酶的活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，這與本試驗研究接菌量對發(fā)酵后多糖含量變化相吻合。

3.1.4發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響微生物發(fā)酵的最佳時期是對數(shù)期和穩(wěn)定期，進入衰亡期時，發(fā)酵的效果會隨之下降，發(fā)酵時間的選擇就是基于這點。葉勁松等（2006）在研究發(fā)酵時間對發(fā)酵豬耳西式火腿品質的影響發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間過短或過長都對產品的品質不利，時間過短發(fā)酵不能充分進行；時間過長則容易產生酸味過大、顏色過深等現(xiàn)象。這與本試驗得到的結果基本一致。

3.2響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝在微生物發(fā)酵生產中發(fā)酵工藝，常用的方法一般有單因素試驗、正交試驗、響應面試驗等（Bandaru等，2006）。單因素試驗實施的前提是假設各個因素之間不存在交互作用，所以試驗結果存在一定的瑕疵，正交試驗相較于單因素試驗能夠分析部分因素之間的線性關系，但若因素水平太多則會產生較大的工作量（武洪志等，2016）。響應面試驗不僅能夠描述各個試驗因素對發(fā)酵效果的影響，還能夠描述各個因素之間的交互效應，且能夠精準地分析得到各個因素的最佳值。本試驗采用單因素和響應面相結合的試驗設計，在單因素的基礎上確定對響應值北蒼術多糖影響較大的三個因素，再經(jīng)響應面進一步優(yōu)化，準確得出嗜酸乳酸桿菌發(fā)酵北蒼術的最佳發(fā)酵工藝：含水量為47.77%，接菌量為6.62%，發(fā)酵時間為3 d。與單因素試驗試驗結果作比較，響應面結果與單因素試驗結果不盡一致，因為響應面試驗考察了各因素之間的交互作用，單因素是做不到的，最終導致結果的不一致。

4　結論

利用單因素以及在此基礎上的三因素三水平響應面法試驗設計，探索出發(fā)酵北蒼術的最佳發(fā)酵條件：含水量為47.77%，接菌量為6.62%，發(fā)酵時間為3 d，此條件下測得北蒼術多糖平均值為9.45%，與響應面預測值9.39%%接近，相較于未發(fā)酵北蒼術中5.58%的北蒼術多糖，發(fā)酵后北蒼術多糖含量提高了69.35%。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2010．

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The aim of this experiment was to study the optimum process of Atractylodes chinensis fermented by Lactobacillus acidophilus.The experimental design was combined single factor with response surface.Variance analysis was conducted on five single factors，carbon source，nitrogen source，water content，inoculation amount and fermentation time，for fixing the most important factors to the fermentation effect with Atractylodes chinensis polysaccharide content as index for the further optimization by response surface.The results showed that：（1）the carbon source and nitrogen source had little influence on the test results，the key factors were water content，fermentation time and inoculation amount.（2）an average Atractylodes chinensis polysaccharide of 9.45%was gotten under the water content 47.77%，inoculation amount 6.62%，fermentation time 3 days，and closed to the response surface predicted value of 9.39%.（3）compared to the 5.58% Atractylodes chinensis polysaccharides 5.58%in unfermented Atractylodes chinensis，after the fermentation the Atractylodes chinensis polysaccharides increased by 69.35%.The experimental results showed that the fermentation process was simple and could significantly improve the content of polysaccharides，which provided theoretical basis for the application of the Chinese herbal medicine feed additives.

feed additives；Atractylodes chinensis；polysaccharide；fermentation process

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161607

S816.7

A

1004-3314（2016）16-0028-06

國家科技支撐計劃（2014BAD13B03-1）