超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉和雞肝中抗病毒藥物利巴韋林殘留

齊　凱，湯曉艷,，陶　瑞，楊小體，張小慶，沈習(xí)習(xí)

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉和雞肝中抗病毒藥物利巴韋林殘留

齊凱1,2，湯曉艷1,2,*，陶瑞2，楊小體1,2，張小慶2，沈習(xí)習(xí)1,2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

為研究禁用抗病毒藥物利巴韋林在雞組織中的殘留規(guī)律，對京紅蛋雞以30 mg/kg體質(zhì)量劑量連續(xù)口服灌喂，在不同的時間點采集雞肉和雞肝樣品，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測利巴韋林含量。對雞肉、雞肝中利巴韋林檢測的方法學(xué)考察表明，雞肉中利巴韋林檢測方法線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，檢出限為1.20 μg/kg，質(zhì)量濃度范圍為5.0～200 μg/L；雞肝中利巴韋林檢測方法線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.98，檢出限為1.54 μg/kg，質(zhì)量濃度范圍為10.0～500 μg/L；高、中、低3 種添加水平下回收率為83.5%～120.6%，精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）為0.7%～9.1%，滿足殘留分析方法要求。利巴韋林口服灌喂蛋雞后被迅速代謝吸收，在雞肝中代謝消除較快，殘留時間短，最長檢出時間為24 h，即超過24 h不再有檢出，雞肉中利巴韋林消除速率相對較慢，殘留時間較長，最長檢出時間為60 h，在兩種組織中均不發(fā)生蓄積現(xiàn)象。

雞肉；雞肝；利巴韋林；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；殘留規(guī)律

利巴韋林原名三氮唑核苷，相對分子質(zhì)量244.21，分子式C8H12N4O5，化學(xué)名1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4,-三氮唑-3-羧酰胺，是一種人用的抗病毒類藥物，分子結(jié)構(gòu)式見圖1［1］。2005年10月農(nóng)業(yè)部第560號公告［2］正式廢止了金剛烷胺、利巴韋林及其鹽、酯單復(fù)方制劑的獸藥用途。但由于其顯著的抗病毒療效，實際養(yǎng)殖中仍被一些養(yǎng)殖戶非法用于預(yù)防和治療禽類呼吸道疾病，同時獸藥專項監(jiān)測也發(fā)現(xiàn)，部分中西復(fù)方獸藥中存在利巴韋林檢出問題。前期研究表明，利巴韋林藥物經(jīng)各種給藥途徑進(jìn)入動物體后，可轉(zhuǎn)移至肉、蛋、乳及內(nèi)臟等動物性食品中，從而對人類的健康造成危害［3］。隨著集約化蛋禽養(yǎng)殖業(yè)和食品加工業(yè)的發(fā)展，淘汰蛋雞作為肉食原料大量被加工成各類產(chǎn)品［4］。淘汰蛋雞中藥物殘留也對禽類食品造成安全風(fēng)險，因此有必要對淘汰蛋雞及其產(chǎn)品中常見禁用抗病毒藥物利巴韋林進(jìn)行殘留監(jiān)測，以確保食品安全。目前對于動物組織中利巴韋林檢測方法研究較少，主要為液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，已有方法進(jìn)樣時間長，前處理繁雜，同時不同動物種屬間利巴韋林的殘留特性也存在較大的差異，而家禽組織中利巴韋林殘留特性尚未有相關(guān)研究［5-12］。本研究首先采用改良的QuEChERS前處理方法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了雞肉、雞肝組織中利巴韋林殘留檢測方法，在此基礎(chǔ)上，對蛋雞組織雞肉和雞肝中利巴韋林的殘留規(guī)律進(jìn)行了監(jiān)測，研究結(jié)果為禽類養(yǎng)殖中利巴韋林違法使用監(jiān)管提供了方法依據(jù)，也為禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

圖1　利巴韋林結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structure of ribavirin

1　材料與方法

1.1材料與試劑

京紅蛋雞96 只，240 日齡，購自北京平谷某養(yǎng)殖場，單籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖中心。

利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，CAS：36791-04-5）德國Dr. Ehrenstorfer公司；13C5-利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%，分子式C5H12N4O5，相對分子質(zhì)量249.17）加拿大TRC公司；利巴韋林注射液（規(guī)格0.1 g/mL）杭州民生藥業(yè)有限公司；乙腈、甲酸均為色譜純；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2儀器與設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜 美國Waters公司；QTRAP?6500型線性離子阱質(zhì)譜儀 美國AB Sciex公司；TTL-DCⅡ型氮氣濃縮儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反相色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸溶液，B相為甲醇；柱平衡時間：1 min；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；內(nèi)標(biāo)法定量。流動相梯度方案見表1。

表1　流動相梯度方案Table1　Gradient program of mobile phase

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測；掃描方式：正離子掃描；碰撞氣壓力：2 psi；氣簾氣壓力：25 psi；霧化氣壓力：30 psi；干燥氣壓力：276 psi；電噴霧電壓：5 500 V；離子化溫度：550 ℃。

1.3.3給藥與采樣

蛋雞隨機(jī)分成12 組，每組8 只，分別編號，稱量后分籠飼養(yǎng)。利巴韋林原藥用無菌生理鹽水配制成30 mg/mL的溶液，蛋雞給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥時按編號取受試雞，根據(jù)蛋雞體質(zhì)量，按30 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行口服灌喂，連續(xù)給藥5 d。空白組以等量的生理鹽水灌喂。停藥0（空白樣）、2、6、12、24、36、48、60、72、120、240、480 h，剖殺取肝臟，肌肉（胸肉）組織，保鮮袋分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4樣品前處理

?。?±0.05） g雞肉（雞肝）樣品于50 mL離心管中，加入100 μL 0.2 mg/L質(zhì)量濃度的13C5-利巴韋林內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋均勻，加入1 mL超純水，超聲渦旋混勻，再加入9 mL乙腈，超聲振蕩提取，5 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液，加入石墨化碳黑（graphite carbon black，GCB）40 mg和C1860 mg，渦旋后，5 000 r/min離心5 min。移取上清液，40 ℃條件下氮氣吹干，加入1 mL超純水復(fù)溶，10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，上機(jī)。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用內(nèi)標(biāo)法，并結(jié)合AB SCIEX質(zhì)譜工作站配置的Analyst 1.6.2分析軟件，對測定的結(jié)果進(jìn)行定量分析，測定不同時間點雞肝和雞肉中利巴韋林含量，作藥物殘留質(zhì)量濃度-時間曲線圖。

2　結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

取標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用針泵進(jìn)樣，正離子掃描，以藥物母離子響應(yīng)最優(yōu)條件來確定儀器部分質(zhì)譜參數(shù)（碰撞氣壓力、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、干燥氣壓力、電噴霧電壓、離子化溫度），進(jìn)而對藥物子離子以及去簇電壓及碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化。各藥物優(yōu)化后的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2　利巴韋林及13C5-利巴韋林質(zhì)譜參數(shù)Table2　Optimum parameters and selected fragmentations for ribavirin and-ribavirin

表2　利巴韋林及13C5-利巴韋林質(zhì)譜參數(shù)Table2　Optimum parameters and selected fragmentations for ribavirin and-ribavirin

注：*.定量離子對。

時間/ms碰撞電壓/V去簇電壓/V利巴韋林3.06245*113*501520 9650402013C5-利巴目標(biāo)物保留時間/min母離子（m/z）子離子（m/z）駐留韋林3.03250113*501520 96504020

2.2特異性考察

研究發(fā)現(xiàn)雞肉、雞肝樣品中均含有一種與利巴韋林相似的物質(zhì)，該物質(zhì)與利巴韋林具有相同的質(zhì)量分子數(shù)且電離打碎后有相同的離子片段，干擾利巴韋林的定性和定量分析，從而影響利巴韋林的檢出和結(jié)果準(zhǔn)確性。Danso等［13］經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)為內(nèi)源性的尿苷類似物（相對分子質(zhì)量244.2），該物質(zhì)在質(zhì)譜ESI+源中被打碎，產(chǎn)生的碎片離子質(zhì)荷比與利巴韋林相同。為了消除尿苷類似物的影響，本研究在前處理無法將該物質(zhì)除去的條件下，通過優(yōu)化液相流動相成分、比例和梯度，使利巴韋林與尿苷及其碎片達(dá)到了有效分離，使其互不干擾，結(jié)果如圖2所示。

圖2　雞肉空白基質(zhì)（A）、雞肉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（B）、空白雞肝（C）和雞肝基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（D）二級質(zhì)譜總離子流色譜圖Fig.2　MS/MS total ion current chromatograms of blank muscle （A）, ribavirin in matrix standard solution of blank muscle （B）, blank liver （C）and ribavirin in matrix standard solution of blank liver （D）

2.3方法線性范圍、回收率和精密度

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對利巴韋林進(jìn)行分析，以定量離子對和內(nèi)標(biāo)13C5-利巴韋林的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸計算。以信噪比（RSN）確定方法的檢出限（limit of detection，LOD），得到利巴韋林在雞肉、雞肝中的LOD（RSN=3）分別為1.20 μg/kg和1.54 μg/kg。同時，在空白雞肉、雞肝中分別以高、中、低3 個添加水平做利巴韋林添加回收實驗。雞肉中利巴韋林的回收率在104.8%～120.6%之間；雞肝中利巴韋林的回收率在83.5%～113.7%之間；利巴韋林在雞肉、雞肝中的準(zhǔn)確度和精密度滿足基本要求，如表3所示。

表3　雞肉、雞肝中利巴韋林回收率和精密度（n=6）Table3　Recovery and precision of ribavirin in chicken muscle and liver （ n= 6）

2.4不同時間雞肉、雞肝中利巴韋林殘留規(guī)律

圖3　口灌給藥后雞肉、雞肝中利巴韋林殘留量-時間曲線（n=6）Fig.3　Concentration-time curve of ribavirin in chicken muscle and liver after oral administration （n = 6）

蛋雞以30 mg/kg體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)口服灌喂5 d，以藥物殘留量平均值和時間的關(guān)系作藥物殘留消除曲線圖（圖3）。由圖3可以看出，雞肝臟中利巴韋林最高殘留量為91.65 ng/g，雞肉中利巴韋林最高殘留量為402.97 ng/g，說明利巴韋林在雞肉中殘留量大，在雞肝中殘留量較低。從2 種組織中利巴韋林最長檢出時間來看，雞肝中利巴韋林最長檢出時間為24 h，雞肉最長檢出時間為60 h，說明利巴韋林在雞肉中殘留時間長，在雞肝中殘留時間較短。從殘留消除曲線斜率來看，12 h前利巴韋林在雞肉中消除速度較快，很快從較高質(zhì)量濃度降到較低質(zhì)量濃度，隨后以低質(zhì)量濃度水平在雞肉中緩慢消除。

3　討 論

3.1檢測方法優(yōu)化

在質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化中，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)量分子數(shù)及分子結(jié)構(gòu)特點，目標(biāo)分析物通常會結(jié)合質(zhì)子、銨根離子或者帶正電荷的堿金屬離子，在ESI+模式下成為帶正電荷的加合離子，如［M+H］+、［M+NH3］+和［M+Na］+等。本研究參考Danso等［13］的方法，采用針泵進(jìn)樣，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子Q1掃描，結(jié)果表明，利巴韋林在正離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度大，因此選?。跰+H］+峰為準(zhǔn)分子離子峰，確定母離子為m/z 245。通過優(yōu)化碰撞能，以其分子斷裂的方式，對碎片離子進(jìn)行優(yōu)化選擇，得到主要子離子對為m/z 113和m/z 96。

由于利巴韋林的強(qiáng)極性，在普通C18反相色譜柱上保留性差，本實驗采用對極性化合物具有良好保留效果的Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），同時采用高比例的水相進(jìn)行洗脫，使目標(biāo)物與基質(zhì)中的尿苷類似物達(dá)到有效分離。

利巴韋林屬于強(qiáng)極性的化合物，易溶于水和一些有機(jī)溶劑［14］。目前對于動物組織中利巴韋林的提取，主要是有機(jī)溶劑和水相結(jié)合的方式，有機(jī)溶劑使蛋白、核苷等大分子物質(zhì)變性，從而去除干擾。目前已有研究采用提取溶劑包括0.1%甲酸溶液-乙腈溶液（1∶9，V/V）、0.1%甲酸溶液-20 mmol/L乙酸銨甲醇溶液（1∶9，V/V）、乙腈-水（9∶1，V/V）、甲酸-水（9∶1，V/V）等［15］。本實驗對以上提取溶劑進(jìn)行了比較優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)乙腈-水（9∶1，V/V）作為提取溶劑具有良好的提取效果。

關(guān)于利巴韋林的凈化方式，目前主要采用固相萃取技術(shù)，如MCX萃取柱、NH2萃取柱、PBA萃取柱和HLB萃取柱等［16-17］。本研究利用QuEChERS快速樣品前處理方法原理，采用C18和GCB兩種主要的固相萃取材料進(jìn)行樣品凈化，取得了良好提取效果，回收率明顯高于固相萃取柱，且操作簡單、凈化時間短。

3.2雞肉、雞肝中利巴韋林殘留特性

目前利巴韋林在機(jī)體內(nèi)的研究主要在藥物代謝動力學(xué)方面，研究對象集中在大鼠、獼猴、仔豬和人等哺乳類動物，對于禽類組織中的研究甚少［18-23］。Catlin等［24］研究發(fā)現(xiàn)，人體單劑量口服利巴韋林后吸收迅速，血藥濃度在1～1.5 h即達(dá)到峰值。劉雪梅［25］對利巴韋林在仔豬體內(nèi)的代謝研究發(fā)現(xiàn)，利巴韋林在仔豬體內(nèi)吸收好，分布廣泛，但代謝消除速率緩慢，容易在仔豬組織中產(chǎn)生蓄積，引起中毒癥狀。這說明不同動物種屬之間，利巴韋林的代謝、吸收、分布和殘留特性存在較大差異。Glue等［26］研究發(fā)現(xiàn)利巴韋林消除主要途徑是代謝轉(zhuǎn)化，經(jīng)腎臟排泄消除的原型僅占5%～15%。劉敬先等［1］研究也提出利巴韋林原藥在機(jī)體內(nèi)主要是以糞便形式排出，但原型約占17%。本課題組前期對蛋雞中利巴韋林藥物代謝動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，利巴韋林在蛋雞血漿中代謝消除速率很快，半衰期僅1.59 h，主要是原型藥物發(fā)生了代謝轉(zhuǎn)化，生成了代謝產(chǎn)物［27］。

雞肉、雞肝兩種組織中雞肉的利巴韋林殘留量大，而肝臟中殘留量低。蛋雞經(jīng)30 mg/kg體質(zhì)量連續(xù)口服灌喂利巴韋林后，肝臟中利巴韋林原藥最高殘留量為91.65 ng/g，雞肉中最高殘留量為402.97 ng/g，這可能是肝臟作為藥物代謝器官，導(dǎo)致利巴韋林在肝臟中發(fā)生了代謝轉(zhuǎn)化。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利巴韋林在蛋雞體內(nèi)代謝吸收速度快，在組織中消除速度也快，雞肝與血液具有相似的代謝殘留特點，即原藥殘留量低，代謝轉(zhuǎn)化速度快。利巴韋林在組織中最長檢出時間點雞肝為24 h，雞肉為60 h。結(jié)合本課題組鄭鋅等［27］對利巴韋林在蛋雞體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)研究可以看出，蛋雞口服給藥后藥物迅速向血液中轉(zhuǎn)移，血漿中的最大殘留量達(dá)到2 796 ng/mL，本研究同時也發(fā)現(xiàn)藥物也向肝臟、雞肉組織中轉(zhuǎn)移，并且在雞肉中消除速率緩慢。說明禽類養(yǎng)殖中違禁使用利巴韋林會對禽肉產(chǎn)品帶來一定的安全風(fēng)險隱患。

4　結(jié) 論

本研究建立了雞肉、雞肝中利巴韋林超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，方法線性關(guān)系良好（R2＞0.98），回收率為83.5%～120.6%，精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）為0.7%～9.1%。雞肉、雞肝的LOD分別為1.20、1.54 μg/kg，樣品分析時間短、操作簡單，可作為禽類養(yǎng)殖中禁用抗病毒藥物利巴韋林殘留監(jiān)管的手段。同時對可食用組織雞肉、雞肝中利巴韋林殘留特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)利巴韋林在雞肉組織中殘留量比雞肝中殘留量大，殘留時間比雞肝中殘留時間長，禽類養(yǎng)殖中違禁使用利巴韋林會對禽產(chǎn)品質(zhì)量安全造成一定的風(fēng)險隱患。

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Determination of Residues of the Antiviral Drug Ribavirin in Chicken Muscle and Liver by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

QI Kai1,2, TANG Xiaoyan1,2,*, TAO Rui2, YANG Xiaoti1,2, ZHANG Xiaoqing2, SHEN Xixi1,2
（1. National Centry of Meat Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China； 2. Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China）

This study aimed to investigate the distribution prolfiles of residues of the antiviral drug ribavirin in chicken tissues, whose use has been banned. Ribavirin at the dose of 30 mg/kg was continuously administered to Jinghong laying hens. The animals were executed and chicken muscle and liver samples were collected at different time intervals for the detection of ribavirin content by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The calibration curve for ribavirin in chicken muscle was linear in the concentration range of 5.0-200 μg/L with a correlation coefficients （R2） of above 0.99, and the limit of detection （LOD） was 1.20 μg/kg. The calibration curve for ribavirin in chicken liver was linear in the concentration range of 10.0-500 μg/L with a correlation coefficients （R2） of above 0.98, and the the limit of detection （LOD） was 1.54 μg/kg. At three spiked concentration levels, the recoveries of ribavirin ranged from 83.5% to 120.6%, and the precision expressed as relative standard deviation （RSD） ranged from 0.7%-9.1%, which met the basic quantitative requirements. The results showed that ribavirin in chicken liver was rapidly eliminated and the final detection time was 24 h, while the elimination rate for muscle was relatively slow, and the final detection time was 60 h after oral administration. Finally, there was no accumulation of ribavirin residue in both tissues.

chicken muscle； liver； ribavirin； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；residue distribution pattern

10.7506/spkx1002-6630-201620024

TS251.7

A

1002-6630（2016）20-0146-05

齊凱, 湯曉艷, 陶瑞, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉和雞肝中抗病毒藥物利巴韋林殘留［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 146-150. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620024. http：//www.spkx.net.cn

QI Kai, TANG Xiaoyan, TAO Rui, et al. Determination of residues of the antiviral drug ribavirin in chicken muscle and liver by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 146-150. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620024. http：//www.spkx.net.cn

2016-05-26

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目

齊凱（1988—），男，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：410584866@qq.com

湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：txycaas@126.com