響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化辣木葉多酚超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性

裴　斐，陶虹伶，蔡麗娟，魏琛琛，袁一鳴，楊文建，胡秋輝

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化辣木葉多酚超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性

裴斐，陶虹伶，蔡麗娟，魏琛琛，袁一鳴，楊文建，胡秋輝*

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

為研究辣木葉多酚超聲輔助提取工藝，明確辣木葉多酚體外抗氧化活性，選取超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比為考察指標(biāo)，研究不同工藝參數(shù)對(duì)辣木葉多酚提取量的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉多酚提取工藝。此外，研究辣木葉多酚還原力及其對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力。結(jié)果表明，超聲輔助提取辣木葉多酚最優(yōu)工藝為：超聲時(shí)間19.5 min、料液比1∶30（g/mL）、超聲溫度20.2 ℃、超聲功率250 W。在此條件下，辣木葉多酚提取量為（25.14±0.46） mg/g。辣木葉多酚具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，其還原力、DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力分別達(dá)到同等質(zhì)量濃度VC的81.25%、94.15%和75.05%。該研究為辣木葉多酚等生物活性成分高效制備與抗氧化劑的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

辣木葉；多酚；超聲輔助提取；響應(yīng)面；抗氧化

辣木（Moringa oleifera Lam.）又稱鼓槌樹，為辣木科辣木屬多年生植物，原產(chǎn)于印度西北部喜馬拉雅山南麓，目前廣泛分布在印度、中國(guó)、日本等三十多個(gè)熱帶及亞熱帶的國(guó)家和地區(qū)［1］。辣木營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，其中辣木氨基酸種類較大豆更為全面［2］，且VC、VA、鈣、鉀、鐵等含量尤為突出［3-4］。除此之外，辣木還具有抗氧化、降血壓、降血脂、抑菌、減肥等功效［5］。隨著人們對(duì)于辣木營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的不斷深入，以及對(duì)于自身健康和飲食質(zhì)量日益關(guān)注，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注辣木營(yíng)養(yǎng)與功能成分的綜合開發(fā)和利用。

辣木葉多酚是辣木中重要的生物活性成分，據(jù)研究報(bào)道，辣木葉水提物或醇提物含有槲皮素、山奈酚、綠原酸等多酚類物質(zhì)，具有顯著的抑菌性、抗炎癥以及免疫調(diào)節(jié)等活性［6-7］。目前對(duì)辣木葉多酚的研究主要集中在提取工藝和功能活性驗(yàn)證方面，經(jīng)典的提取方法主要是有機(jī)溶劑提取法、索氏提取法，但存在著產(chǎn)品安全性低、耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低等缺點(diǎn)。近年來，超聲波技術(shù)因其理想的提取效果備受研究者關(guān)注，其優(yōu)勢(shì)在于用超聲波提取多酚可利用其空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)作用、熱效應(yīng)等造成植物細(xì)胞壁的破碎，加快溶劑滲透速率，使有效成分迅速溶解到溶劑里，從而提高了活性成分的浸出率，還能避免一些熱敏性成分由于溫度過高而造成的破壞現(xiàn)象［8］。目前，針對(duì)植物多酚的超聲輔助提取技術(shù)已有較多報(bào)道，如房玉林等［9］研究了石榴皮多酚超聲輔助提取技術(shù)，優(yōu)化并確定了最優(yōu)提取工藝為料液比1∶20（g/mL）、超聲功率100 W、提取時(shí)間20 min。朱德文等［10］研究了超聲輔助提取茶鮮葉中茶多酚提取工藝，證明了與傳統(tǒng)水浴浸提相比，提取得率顯著提高。Wang Wenjie等［11］研究了超聲輔助水果多酚提取工藝，研究證明超聲通過在溶劑系統(tǒng)中分離聚合花色苷顯著提升了水果中單體花青素的提取率。

響應(yīng)面法是一種應(yīng)用廣泛的試驗(yàn)優(yōu)化方法，它可以有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，已應(yīng)用于多種優(yōu)化實(shí)踐中［12-14］。Alessandro等［12］研究了超聲提取野櫻莓多酚工藝，證明了超聲輔助提取工藝是獲得高抗氧化活性野櫻莓多酚的良好提取手段。然而，關(guān)于辣木葉多酚的超聲提取工藝及抗氧化活性評(píng)價(jià)研究較少。研究辣木葉功效成分高效制備提取技術(shù)，獲得提取率高、生物活性高的辣木葉多酚具有重要的研究意義。

本實(shí)驗(yàn)以辣木葉超聲輔助提取過程參數(shù)超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比為考察因素，研究不同提取工藝參數(shù)對(duì)辣木葉多酚提取量的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉多酚超聲輔助提取工藝。此外，研究了辣木葉多酚體外抗氧化活性，為辣木葉多酚等生物活性成分高效制備與抗氧化劑的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

辣木莖葉，產(chǎn)自云南楚雄州，葉齡45 d，由楚雄宏桂綠色食品有限公司提供，新鮮辣木葉經(jīng)除雜、清洗、晾曬至半干后，置于熱風(fēng)烘箱在60 ℃條件下進(jìn)行干燥，烘干至水分含量6%以下，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過80 目篩，密封避光保存于-18 ℃冰箱備用。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品鑒定所；碳酸鈉（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Folin-Ciocalteu試劑（分析純） 上海摩爾生化試驗(yàn)有限公司；VC、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3635型96 孔紫外微孔板 美國(guó)Corning公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Tris、EDTA-Na2美國(guó)Sigma公司；乙醇、鹽酸（均為分析純） 南京化學(xué)試劑股份有限公司；氯化鐵（分析純） 上海光譜試劑有限公司；鄰苯三酚（分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)控恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；GB204電子分析天平 Mettler Toledo上海有限公司；WF-100型高速萬能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；101-3A電熱鼓風(fēng)干燥機(jī) 上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；QTR-3120超聲波清洗機(jī) 天津市瑞普電子儀器公司；GL21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；i-mark酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1辣木葉多酚含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用Folin-Ciocalteus比色法［13］測(cè)定辣木葉中多酚類物質(zhì)的含量。準(zhǔn)確稱取0.050 0 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解并轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容、混勻，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別取不同體積（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL）的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 mL，分別加入雙蒸水60 mL、Folin-Ciocalteu試劑3 mL，搖勻后靜置3 min后，再加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的碳酸鈉溶液，搖勻后在20 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h。最后分別定容至100 mL容量瓶中，在760 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，并以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程：Y=65.892X-0.0083，R2=0.994 4。

辣木葉多酚含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取辣木葉粉樣品2.000 g，按一定料液比加入蒸餾水，常溫浸泡30 min后，采用超聲波法進(jìn)行提取。浸提液經(jīng)冷卻后在4 000×g轉(zhuǎn)速條件下離心，收集上清液，測(cè)定其體積。吸取l.0 mL樣品液于100 mL容量瓶中（記錄稀釋因子），加入60 mL蒸餾水，3 mL的Folin-Ciocalteu試劑，搖勻，放置3 min后再加入10%的碳酸鈉溶液3 mL，搖勻，并在20 ℃水浴中反應(yīng)l h后，用蒸餾水定容至刻度。以空白對(duì)照作為參比液，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量。辣木葉多酚提取量計(jì)算參照陳純等［14］的方法，并略有改動(dòng)，如公式（1）所示：

式中：c為辣木葉多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；n為稀釋因子；V為濾液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

前期研究報(bào)道表明，在多酚的超聲波輔助提取過程中，多酚提取得率受超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比提取工藝參數(shù)的影響［15］。因此，以多酚提取量為考察指標(biāo)，分別考察超聲功率（200、250、300、350、400 W）、超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）、超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）和料液比（l∶30、l∶35、l∶40、1∶45、1∶50（g/mL））對(duì)辣木葉多酚提取量的影響。

1.3.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比為關(guān)鍵工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)四因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，以辣木葉多酚提取量為考察指標(biāo)，共設(shè)計(jì)5 個(gè)中心點(diǎn)和29 個(gè)不同組合的試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table1　Factors and levels of response surface experiments

1.3.4體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法分析確定的辣木葉多酚的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行辣木葉多酚提取，提取液經(jīng)D101大孔樹脂進(jìn)行純化，并通過70%乙醇溶液洗脫后，將乙醇溶劑回收后并冷凍干燥，得到辣木葉多酚凍干粉。將該樣品配制不同質(zhì)量濃度進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)。

配制質(zhì)量濃度分別為62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL的辣木葉多酚溶液，對(duì)其進(jìn)行總還原能力、DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定，以VC為陽性對(duì)照。

1.3.4.1總還原力測(cè)定

參照袁婭等［16］的方法并略作修改，取不同質(zhì)量濃度的樣品液1.0 mL，加入1.0 mL的磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后置于50 ℃的水浴鍋中水浴20 min，隨后取出冷卻至室溫，加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，室溫放置10 min，再向其中加入1.0 mL蒸餾水及0.2 mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻后反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在700 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度。

1.3.4.2DPPH自由基清除率測(cè)定

瀝青混凝土中的集料是可以稱作是它的骨架，集料的質(zhì)量能夠決定混凝土的整體強(qiáng)度，對(duì)混凝土的支撐能力有重要的影響，在集料的質(zhì)量控制中首先應(yīng)該保證集料的外形上接近立方體，保證其有良好的穩(wěn)定性，另外由于細(xì)集料和粗集料有不同的用處，例如細(xì)集料是為了對(duì)粗集料中間的空隙進(jìn)行填充，因此還應(yīng)該對(duì)集料的體積大小進(jìn)行嚴(yán)格的把控。

表1　DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)加樣表Table1　DPPH sample tablee

參照Vattem等［17］的方法并略作修改，配制0.2 mmol/L DPPH溶液和70%乙醇溶液備用。按表1加入試劑后置于室溫條件下避光反應(yīng)30 min，測(cè)定不同樣品液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并按公式（2）計(jì)算不同質(zhì)量濃度樣品液及VC溶液對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.3.4.3超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧陰離子自由基清除能力并參照蓋玉紅［18］和陳晨等［19］的方法。取不同質(zhì)量濃度待測(cè)樣品液1.0 mL，加入1.8 mL的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.2），在25 ℃條件下保溫10 min，再加入100 μL預(yù)熱好的0.01 mol/L鄰苯三酚溶液，立即搖勻并在320 nm波長(zhǎng)條件下每隔30 s測(cè)定1 次吸光度，總時(shí)間控制為4 min。用等體積蒸餾水替代樣品液，10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚溶液測(cè)定空白值。鄰苯三酚自氧化速率記為A0，可通過吸光度的斜率表示；加入辣木葉多酚樣品后的鄰苯三酚氧化速率記為A1，通過公式（3）可計(jì)算出超氧陰離子自由基清除率。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過SPSS 18軟件進(jìn)行分析，ANOVA程序用于方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異顯著。最小顯著差異法用于數(shù)據(jù)多重比較分析。數(shù)據(jù)以3 次獨(dú)立樣品測(cè)定結(jié)果的表示。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1　超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）和料液比（D）對(duì)辣木葉多酚提取量的影響Fig.1　Effect of ultrasonic power （A）, extraction time （B）, extraction temperature （C）, and solid to liquid ratio （D） on extraction rate of polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves

由圖1A可知，隨著超聲功率的增加，辣木葉多酚提取量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，并在超聲功率300 W時(shí)達(dá)到最大。這可能是由于超聲波引起的“空化效應(yīng)”隨著超聲功率的增加而增加，導(dǎo)致酚類物質(zhì)滲透速率加快［20］。然而，當(dāng)微波功率超過300 W后，過高的“空化效應(yīng)”產(chǎn)生的高壓環(huán)境會(huì)破壞辣木葉多酚的結(jié)構(gòu)，同時(shí)雜質(zhì)溶出增加，導(dǎo)致辣木葉多酚提取量的下降。

由圖1B可知，超聲時(shí)間在10～15 min，多酚提取量顯著上升，在15 min以后辣木葉多酚得率趨于平穩(wěn)。這可能是由于超聲提取初期，細(xì)胞破碎程度迅速增加，使得浸提液中多酚含量不斷增加。當(dāng)超聲15 min后，辣木葉多酚已基本溶出，因此含量并未發(fā)生顯著變化［8］。

由圖1C可知，當(dāng)超聲溫度上升至30 ℃時(shí)，辣木葉多酚提取量顯著上升，但隨著溫度的進(jìn)一步提升，提取量略有降低但變化并不顯著。這是由于溫度在一定范圍內(nèi)升高時(shí)，多酚物質(zhì)的溶解度會(huì)增加，同時(shí)分子之間的粘滯度會(huì)有所下降，從而使更多的酚類物質(zhì)溶出。但溫度過高，會(huì)破壞酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性［21］。

由圖1D可知，料液比為1∶30～1∶35時(shí)，隨著溶劑用量的增加，多酚提取量顯著上升，這是由于質(zhì)量濃度梯度增加有利于多酚提取物的溶出，但當(dāng)料液比在1∶35后，辣木葉多酚卻呈現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。這可能是由于辣木葉在提取過程中溶出了多糖等其他的物質(zhì)，影響了辣木葉多酚的提取分離，導(dǎo)致多酚提取量的減少。

2.2Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，本研究通過響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)辣木葉多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以辣木葉多酚提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。在29 個(gè)試驗(yàn)組合條件下，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Table2　Box-Behnken design matrix and the response value

2.3模型的建立及顯著性分析

基于參數(shù)評(píng)估，運(yùn)用Design-Expert V8.05b軟件可得出響應(yīng)值與被檢變量之間的邏輯關(guān)系。對(duì)這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值與變量之間方程：

為檢驗(yàn)建立模型的有效性，利用分析軟件進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分析，其中辣木葉多酚提取量系數(shù)顯著性結(jié)果見表3，多元回歸模型的方差分析結(jié)果見表4。

表3　辣木葉多酚得率擬合多元二次方程模型的方差分析Table3　Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model of extraction rateo of polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves

表4　多元回歸模型方差分析表Table4　Analysis of variance （ANOVA） for the quadratic polynomial model

由表3可知，方程的一次項(xiàng)中X2、X3對(duì)辣木葉多酚提取量的影響極顯著；交互項(xiàng)X1X2、X2X3、X2X4和X3X4對(duì)辣木葉多酚提取量的影響極顯著。由此可知，各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并非是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素之間均存在顯著的交互作用。由表4可知，回歸模型項(xiàng)極為顯著，響應(yīng)值的決定系數(shù)R2達(dá)到0.928 6，說明模型的擬合度良好，表明通過該模型能夠很好地對(duì)辣木葉多酚提取量做出預(yù)測(cè)。調(diào)整決定系數(shù)達(dá)到0.857 3，說明辣木葉多酚提取量模型分別能夠在85.73%的程度上解釋試驗(yàn)結(jié)果，僅有14.27%不能用該模型表示。模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），進(jìn)一步說明此模型的擬合度良好。離散系數(shù)表示試驗(yàn)的精確度［22］，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ碗x散系數(shù)為1.43%，說明模型方程能夠較好地反映真實(shí)值。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測(cè)辣木葉多酚提取量。

2.4響應(yīng)面分析

圖2　各因素交互作用對(duì)辣木葉多酚提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.2　Response surface plots showing the effects of extraction condition on the extraction rateof polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves

響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述，能夠直觀反映各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩因素間交互作用的類型，然后進(jìn)一步優(yōu)化成生產(chǎn)條件［23］。運(yùn)用Design-Expert軟件所獲得的三維響應(yīng)面圖，由圖2A可知，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)辣木葉多酚提取量不斷上升而后逐漸趨于平穩(wěn)，當(dāng)料液比變化到1∶40（g/mL）時(shí)，辣木葉多酚提取量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，這與料液比單因素分析中結(jié)果一致，即在較高的溶劑用量條件下，辣木葉提取量出現(xiàn)下滑現(xiàn)象；由圖2B、C可知，當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，辣木葉多酚提取量隨超聲溫度的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。而當(dāng)超聲溫度或超聲功率一定時(shí)，辣木葉多酚提取量呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)；圖2D、E與圖2A類似，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，隨著超聲溫度的升高或超聲功率的增加辣木葉多酚提取量不斷上升而后逐漸趨于平穩(wěn)，當(dāng)料液比變化到1∶40（g/mL）時(shí)，辣木葉多酚提取量隨溫度的升高或超聲功率的增加呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)；由圖2F可知，當(dāng)一個(gè)因素值確定后，辣木葉多酚提取量隨另一個(gè)因素值的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

2.5提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證

運(yùn)用Design-Expert軟件求出被檢變量的最優(yōu)值。即最優(yōu)提取工藝為超聲時(shí)間19.5 min、料液比1∶30（g/mL）、超聲溫度20.2 ℃、超聲功率250 W，此時(shí)辣木葉多酚提取量為25.60 mg/g。在此條件下，通過超聲輔助提取法提取辣木葉多酚，3 次平行實(shí)驗(yàn)得出辣木葉多酚實(shí)際提取量為（25.14±0.46）mg/g，與理論值非常接近。因此，該多元二次回歸方程能夠準(zhǔn)確對(duì)超聲輔助提取辣木葉多酚提取量預(yù)測(cè)。在與超聲輔助提取最優(yōu)條件相同的溫度（20.2 ℃）、料液比（1∶30）和時(shí)間（19.5 min）條件下，對(duì)辣木葉多酚采用傳統(tǒng)水浴浸提法進(jìn)行提取，3 次平行實(shí)驗(yàn)得出辣木葉多酚提取量?jī)H為（12.33±0.84）mg/g。因此，與傳統(tǒng)提取方法相比，通過本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的超聲輔助提取工藝對(duì)辣木葉多酚進(jìn)行提取，其提取量能夠提高1 倍以上。

2.6體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

圖3　辣木葉多酚的還原力（A）、DPPH自由基清除率（B）和超氧陰離子自由基清除率（C）測(cè)定結(jié)果Fig.3　The reducing power （A）, the DPPH radical scavenging activities （B）and the· scavenging effect （C） of polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves

由圖3 A可知，在辣木葉多酚質(zhì)量質(zhì)量濃度62.5～4 000 μg/mL的范圍內(nèi)，辣木葉多酚的還原力隨著多酚質(zhì)量質(zhì)量濃度增加而增加，當(dāng)多酚質(zhì)量質(zhì)量濃度處于最高點(diǎn)（4 000 μg/mL時(shí)），還原力（1.82±0.05）達(dá)到了同等質(zhì)量濃度VC還原力（2.24±0.02）的81.25%，證明了辣木葉多酚具有良好的還原力。

由圖3B可知，不同質(zhì)量濃度的辣木葉多酚具有一定的DPPH自由基清除能力，半數(shù)清除質(zhì)量濃度（EC50）為159.75 μg/mL。其中當(dāng)質(zhì)量濃度在62.5～500 μg/mL范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力迅速上升，在辣木葉多酚質(zhì)量質(zhì)量濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率高達(dá)（89.78±2.59）%，達(dá)到同等質(zhì)量濃度VC的DPPH自由基清除率（（95.36±0.72）%）的94.15%。當(dāng)辣木葉多酚質(zhì)量質(zhì)量濃度高于500 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率趨于平穩(wěn)。

超氧陰離子自由基是反應(yīng)性氧中間物的一種，其與羥基結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)對(duì)細(xì)胞DNA造成一定程度的損壞。因此，清除超氧陰離子自由基在抗氧化過程中起著重要的作用。由圖3C可知，辣木葉多酚的超氧陰離子自由基EC50值為79.05 μg/mL。隨著辣木葉多酚質(zhì)量質(zhì)量濃度的升高，超氧陰離子自由基清除率升高，并在質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL后趨于平穩(wěn)，在此質(zhì)量濃度條件下，辣木葉多酚的超氧陰離子自由基清除率高達(dá)（74.92±2.68）%，是同質(zhì)量濃度VC超氧陰離子自由基清除率（（99.83±0.01）%）的75.05%。

通過辣木葉多酚的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，證明了辣木葉多酚具有較強(qiáng)還原力、DPPH自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力，是一種潛在的抗氧化劑。

3　結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到了辣木葉多酚超聲輔助提取最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲時(shí)間19.5 min、料液比1∶30（g/mL）、超聲溫度20.2 ℃、超聲功率250 W。在此條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，辣木葉多酚提取量達(dá)到（25.14±0.46）mg/g，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取辣木葉多酚是準(zhǔn)確可行的。此外，通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)充分證明了辣木葉多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其還原力、DPPH自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力分別達(dá)到同等質(zhì)量濃度VC的81.25%、94.15%和 75.05%。該研究為辣木葉多酚進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)以及辣木活性成分抗氧化劑的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

［1］ 劉鳳霞, 王苗苗, 趙有為, 等. 辣木中功能性成分提取及產(chǎn)品開發(fā)的研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué), 2015, 36（19）： 282-286. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201519051.

［2］ 段瓊芬, 李迅, 陳思多, 等. 辣木營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的開發(fā)利用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36（29）： 12670-12672. DOI：10.3969/ j.issn.0517-6611.2008.29.058.

［3］ 初雅潔, 符史關(guān), 龔加順. 云南不同產(chǎn)地辣木葉成分的分析比較［J］.食品科學(xué), 2016, 37（2）： 160-164. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201602028.

［4］ MCBURNEY R P H, GRIFFIN C, PAUL A A, et al. The nutritional composition of African wild food plants： from compilation to utilization［J］. Journal of Food Composition and Analysis, 2004, 17（3/4）： 277-289. DOI：10.1016/j.jfca.2004.03.008.

［5］ 岳秀潔, 李超, 扶雄. 超聲提取辣木葉黃酮優(yōu)化及其抗氧化活性［J］. 食品工業(yè)科技, 2016, 37（1）： 226-231. DOI：10.13386/ j.issn1002-0306.2016.01.037.

［6］ SINGH R S G, NEGI P S, RADHA C. Phenolic composition, antioxidant and antimicrobial activities of free and bound phenolic extracts of Moringa oleifera seed fl our［J］. Journal of Functional Foods, 2013, 5（4）： 1883-1891. DOI：10.1016/j.jff.2013.09.009.

［7］ BAEK J, AHN J, JEGAL Y, et al. Antiproliferation and induction of apoptosis by Moringa oleifera leaf extract on human cancer cells［J］. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49（6）： 1270-1275. DOI：10.1016/ j.fct.2011.03.006.

［8］ YANG W, YONG F, JIN L, et al. Optimization of ultrasonic extraction of Flammulina velutipes polysaccharides and evaluation of its acetylcholinesterase inhibitory activity［J］. Food Research International, 2011, 44（5）： 1269-1275. DOI：10.1016/j.foodres.2010.11.027.

［9］ 房玉林, 齊迪, 郭志君, 等. 超聲波輔助法提取石榴皮中總多酚工藝［J］.食品科學(xué), 2012, 33（6）： 115-118.

［10］ 朱德文, 岳鵬翔, 袁弟順, 等. 超聲波輔助浸提茶鮮葉中茶多酚的工藝研究［J］. 中國(guó)農(nóng)機(jī)化學(xué)報(bào), 2011（1）： 112-115. DOI：10.3969/ j.issn.1006-7205.2011.01.029.

［11］ WANG W J, JUNG J Y, TOMASINO E, et al. Optimization of solvent and ultrasound-assisted extraction for different anthocyanin rich fruit and their effects on anthocyanin compositions［J］. LWT-Food Science and Technology, 2016, 72： 229-238. DOI：10.1016/j.lwt.2016.04.041.

［12］ ALESSANDRO L G, KRIAA K, NIKOV I, et al. Ultrasound assisted extraction of polyphenols from black chokeberry［J］. Separation and Purification Technology, 2012, 93： 42-47. DOI：10.1016/ j.seppur.2012.03.024.

［13］ 陳東明. 超聲提取玫瑰花渣中多酚、多糖的工藝研究［D］. 鄭州： 鄭州大學(xué), 2014.

［14］ 陳純, 王延圣, 羅自生, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取甘蔗皮多酚的工藝條件［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2013, 13（7）： 95-100. DOI：10.16429/ j.1009-7848.2013.07.011.

［15］ BELWAL T, DHYANI P, BHATT I D, et al. Optimization extraction conditions for improving phenolic content and antioxidant activity in Berberis asiatica fruits using response surface methodology（RSM）［J］. Food Chemistry, 2016, 207： 115-124. DOI：10.1016/ j.foodchem.2016.03.081.

［16］ 袁婭, 許佳妮, 張劍飛, 等. 不同培養(yǎng)基對(duì)平菇營(yíng)養(yǎng)成分、多酚含量及其抗氧化活性的影響［J］. 食品科學(xué), 2014, 35（13）： 137-142. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201413026.

［17］ VATTEM D A, LIN Y T, LABBE R G, et al. Antimicrobial activity against select food-borne pathogens by phenolic antioxidants enriched in cranberry pomace by solid-state bioprocessing using the food grade fungus Rhizopus oligosporus［J］. Process Biochemistry, 2004, 39（12）：1939-1946. DOI：10.1016/j.procbio.2003.09.032.

［18］ 蓋玉紅. 靈芝多糖抗氧化活性研究［D］. 長(zhǎng)春： 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

［19］ 陳晨, 胡文忠, 田沛源, 等. 超聲輔助提取香蕉皮多酚工藝優(yōu)化及其抗氧化性的分析［J］. 食品科學(xué), 2014, 35（2）： 12-17. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201402003.

［20］ 林士惠, 易運(yùn)紅, 龍梓, 等. 超聲波輔助提取香蕉葉多糖工藝的優(yōu)化［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 45（2）： 295-298. DOI：10.3969/ j：issn.2095-1191.2014.2.295.

［21］ HAMMI K M, JDEY A, ABDELLY C, et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of antioxidant compounds from Tunisian Zizyphus lotus fruits using response surface methodology［J］. Food Chemistry, 2015, 184： 80-89. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.03.047.

［22］ 陳書勤, 黃健泉, 黃康寧, 等. 響應(yīng)曲面法在優(yōu)化果糖和葡萄糖色譜分離中的應(yīng)用［J］. 輕工科技, 2011（10）： 20-21. DOI：10.3969/ j.issn.1003-2673.2011.10.010.

［23］ KADAM S U, TIWARI B K, SMYTH T J, et al. Optimization of ultrasound assisted extraction of bioactive components from brown seaweed Ascophyllum nodosum using response surface methodology［J］. Ultrasonics Sonochemistry, 2015, 23： 308-316. DOI：10.1016/j.ultsonch.2014.10.007.

Optimization of Polyphenols from Moringa oleifera Lam. Leaves by Ultrasound-assisted Extraction Using Response Surface Methodology and Their Antioxidant Activities

PEI Fei, TAO Hongling, CAI Lijuan, WEI Chenchen, YUAN Yiming, YANG Wenjian, HU Qiuhui*
（Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China）

In order to obtain the best ultrasound-assistedextracting conditions for polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves, and clarified their antioxidant activities. Response surface methodology was used to explore the effects of ultrasonic power, extraction time, extraction temperature, and solid to liquid ratio on extraction rate. Moreover, the reducing power, the DPPH radical scavenging activities and the· scavenging effect of polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves were also investigated. The results showed that the best extraction condition were as follows： the extraction time of 19.5 min, the solid to liquid ratio of 1：30 （g/mL）, the extraction temperature of 20.2 ℃, and the ultrasonic power of 250 W. Under the optimal extractions, the extraction rate of phycoerythrin was （25.14 ± 0.46） mg/g. In addition, the polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves. have strong anti-oxidative, and the reducing power, the DPPH radical scavenging activities and the· scavenging effect were 81.25%, 94.15% and 75.05% of L-ascorbic acid, respectively. This research could provide the theoretical basis for higher preparation and antioxidants development of Moringa oleifera Lam. leaves.

Moringa oleifera Lam.； polyphenols； ultrasound-assisted extraction； response surface methodology； antioxidant activities

10.7506/spkx1002-6630-201620005

TS210.4

A

1002-6630（2016）18-0024-07

裴斐, 陶虹伶, 蔡麗娟, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化辣木葉多酚超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）：24-30. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620005. http：//www.spkx.net.cn

PEI Fei, TAO Hongling, CAI Lijuan, et al. Optimization of polyphenols from Moringa oleifera Lam. leaves by ultrasoundassisted extraction using response surface methodology and their antioxidant activities［J］. Food Science, 2016, 37（20）：24-30. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620005. http：//www.spkx.net.cn

2016-05-15

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

裴斐（1987—），男，講師，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及儲(chǔ)藏工程。E-mail：feipei87@163.com

胡秋輝（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：qiuhuihu@njue.edu.cn