超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定藏藥薩熱十三味鵬鳥丸中烏頭堿類含量

魏文芝，海平，駱桂法

（青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810016）

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定藏藥薩熱十三味
鵬鳥丸中烏頭堿類含量

魏文芝，海平，駱桂法

（青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810016）

目的建立測(cè)定薩熱十三味鵬鳥丸中烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿含量的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。方法采用顯微特征鑒別法鑒別成藥中的鐵棒錘，色譜柱為AcQuity UPLC BEH C18柱，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI）、正離子掃描（ES+）及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）測(cè)定薩熱十三味鵬鳥丸中烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的含量。結(jié)果薩熱十三味鵬鳥丸成藥粉末中可見鐵棒錘特征性傘狀或盔帽狀淀粉粒；烏頭堿進(jìn)樣量在13.15～2 630.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 4），平均回收率為97.34%，RSD=1.79%（n=9）；次烏頭堿進(jìn)樣量在32.06～3 205.89 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為96.09%，RSD=1.94%（n=9）；新烏頭堿進(jìn)樣量在10.23～2 046.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 3），平均回收率為95.94%，RSD=1.75%（n=9）。結(jié)論該顯微鑒別法簡單易操作，顯微特征明顯，結(jié)果易辨識(shí)；該烏頭堿類含量測(cè)定方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定薩熱十三味鵬鳥丸中3種烏頭堿類物質(zhì)的含量。

薩熱十三味鵬鳥丸；顯微鑒別；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；烏頭堿；次烏頭堿；新烏頭堿

薩熱十三味鵬鳥丸是藏醫(yī)習(xí)用藥物，由麝香、木香、藏菖蒲、鐵棒錘、訶子、甘草膏等13味中藥組方，具有消炎止痛、通經(jīng)活絡(luò)、醒腦開竅的功效，主要用于治療由中風(fēng)及“白脈病”引起的口眼歪斜、麻木癱瘓、四肢關(guān)節(jié)不利，以及脈管炎、腱鞘炎、麻風(fēng)等［1］。其臨床應(yīng)用廣泛，已入選青海省2012年基本藥物目錄。鐵棒錘含有毒性生物堿類成分烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿，三者毒性均較大，烏頭堿成人致死量為2～5 mg，從染毒到死亡只需8 min至4 h［2］，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿小鼠靜脈注射的半數(shù)致死量（LD50）分別為0.12～0.27 mg/kg，0.477 mg/kg，0.1～0.137 mg/kg［3］。為保證制劑的安全性，筆者對(duì)薩熱十三味鵬鳥丸成藥中的鐵棒錘及烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿進(jìn)行了定性、定量考察。

1　儀器與試藥

1.1儀器

OLYMPUS BX-51型顯微成像儀（日本Olympus公司）；Waters AcQuity-TQD型超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；Sartorius BS 224S型電子天平、Sartorius CP 225D型電子天平（德國Sartorius公司）；HY-2型調(diào)速多用振蕩器（國華電器有限公司），現(xiàn)報(bào)道如下。

1.2試藥

烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110720-200410），次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110798-200805，含量為99.5%），新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110799-200404），均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，Dikma公司）；甲酸（優(yōu)級(jí)純，J&K Sciencific Ltd）；異丙醇、乙醚、三氯甲烷（分析純，天津百世化工有限公司）。試驗(yàn)所用藥材由青海金訶藏藥藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)青海省食品藥品檢驗(yàn)所駱桂法主任藥師鑒定，均為正品。薩熱十三味鵬鳥丸樣品信息見表1。

表1　薩熱十三味鵬鳥丸樣品信息

2　方法與結(jié)果

2.1鐵棒錘顯微鑒別

分別取鐵棒錘藥材粉末和薩熱十三味鵬鳥丸樣品粉末少許，置載玻片上，加水合氯醛封片，置顯微鏡下觀察。結(jié)果，鐵棒錘藥材粉末與薩熱十三味鵬鳥丸樣品粉末中均可見鐵棒錘特征性淀粉粒［4-5］，呈盔帽狀、傘狀。見圖1。

2.2烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量測(cè)定

2.2.1儀器工作條件

色譜條件：色譜柱為AcQuity UPLC BEH C18柱，采用流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，程序見表2；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃。

表2　梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描（ES+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM，見表3）；毛細(xì)管電壓4.0 kV；離子源溫度140℃；去溶劑氣溫度250℃；去溶劑氣流速480 L/h；錐孔氣流速50 L/h；0～1 min，不進(jìn)入質(zhì)譜，1～3 min，進(jìn)入質(zhì)譜分析，3～20 min，不進(jìn)入質(zhì)譜。

表3　MRM監(jiān)測(cè)模式

2.2.2溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別精密稱取烏頭堿對(duì)照品13.15 mg、次烏頭堿對(duì)照品16.20 mg及新烏頭堿對(duì)照品20.72 mg，置100 mL容量瓶中，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液適量，使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL中含烏頭堿0.131 5 mg，次烏頭堿0.161 1 mg，新烏頭堿0.207 2 mg的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

圖1　顯微鑒別特征圖

供試品溶液：取樣品粉末約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醚-三氯甲烷（1∶1）混合溶液50 mL，加氨試液6 mL，搖勻，放置過夜，濾過，濾渣加乙醚-三氯甲烷（1∶1）混合溶液50 mL，振搖1 h，濾過，濾渣用乙醚-三氯甲烷（3∶1）混合溶液洗滌3次，每次10 mL，合并濾液與洗液，70℃水浴蒸干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液溶解，并定容至10 mL，經(jīng)0.2 μm濾膜濾過，即得。

鐵棒錘陰性對(duì)照溶液：按薩熱十三味鵬鳥丸處方比例稱取缺鐵棒錘的陰性藥材粉末2.5 g，精密稱定，照供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5.0 μL，注入高效液相色譜儀，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)。結(jié)果表明，其他成分對(duì)烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿測(cè)定無干擾，見圖2。

圖2　高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，制成混合對(duì)照品線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（見表4）。分別吸取上述溶液5.0 μL，注入高效液相色譜儀，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定峰面積。以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，烏頭堿為Y=3.548 9 X+174.13，r=0.999 4（n=8），其進(jìn)樣量在13.15～263 0.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；次烏頭堿為Y=0.849 5X+ 19.629，r=0.999 9（n=8），其進(jìn)樣量在32.06～3 205.89 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；新烏頭堿為Y=0.323 9X+17.871，r=0.999 3（n=8），其進(jìn)樣量在10.23～2046.00ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液5.0 μL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為0.33%，0.89%，0.45%（n=6），表明儀器精密度良好。

表4　混合對(duì)照品線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（ng/mL）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液5.0 μL，分別于4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為0.67%，0.84%，0.93%（n=4），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為100101），依法平行制備供試品溶液6份，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿峰面積，計(jì)算烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的含量。結(jié)果得烏頭堿平均含量為8.996 4 μg/g，RSD為0.59%（n=6）；次烏頭堿平均含量為0.187 1 μg/g，RSD為1.06%（n=6）；新烏頭堿平均含量為1.691 7 μg/g，RSD為1.43%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品（批號(hào)為100101，已知烏頭堿含量為8.996 4 μg/g）9份，各0.5 g，按相當(dāng)于烏頭堿含量的80%，100%，120%分別加入烏頭堿對(duì)照品溶液2.7，3.0，3.5 mL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定每份供試品中烏頭堿的含量，計(jì)算回收率；精密稱取同一批樣品（批號(hào)為100101，已知次烏頭堿含量為0.187 1 μg/g）9份，各1.5 g，按相當(dāng)于次烏頭堿含量的80%，100%，120%分別加入次烏頭堿對(duì)照品溶液0.9，1.2，1.4 mL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定每份供試品中次烏頭堿的含量，計(jì)算回收率；精密稱取同一批樣品（批號(hào)為100101，已知新烏頭堿含量為1.691 7 μg/g）9份，各0.5 g，按相當(dāng)于新烏頭堿含量的80%，100%，120%分別加入新烏頭堿對(duì)照品溶液0.3，0.4，0.5 mL，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定每份供試品中新烏頭堿的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表5。

2.2.4樣品含量測(cè)定

分別稱取5批薩熱十三味鵬鳥丸樣品粉末2.5 g，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.2.1項(xiàng)下儀器工作條件試驗(yàn)，測(cè)定峰面積，計(jì)算烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的含量。結(jié)果見表6。

3　討論

表5　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表6　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

［6-12］，嘗試多種烏頭堿類物質(zhì)的提取方法：1）供試品加0.1%氨溶液濕潤后，加乙醚超聲處理放置過夜后濾過，揮干，殘?jiān)右译娑ㄈ荩?）供試品加氨試液濕潤后，加乙醚振搖1 h，放置過夜后，濾過，揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL定容；3）供試品加氨試液，加異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液超聲處理，濾液揮干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容；4）供試品加乙醚-三氯甲烷（3∶1）混合溶液，加氨試液，放置過夜，濾過，濾渣70℃水浴蒸干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液溶解并定容。試驗(yàn)結(jié)果證明，第4種方法提取效率最佳。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，薩熱十三味鵬鳥丸中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量均較低，在安全范圍內(nèi)。本試驗(yàn)為其他含有鐵棒錘藥材的中藏成藥中烏頭堿類成分的含量考察提供了參考。

［1］WS3-BC-0330-95，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥（第一冊(cè)）［S］.

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Content Determination of Aconitine，Hypaoconitine and Mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills by UPLC-MS

Wei Wenzhi，Hai Ping，Luo Guifa
（Qinghai Institute For Food and Drug Control，Xining，Qinghai，China810016）

ObjectiveTo establish an UPLC-MS method for the content determination of aconitine，hypaoconitine and mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills.MethodsThe microscopic identification method was used to identifythe aconitum in agents；the chromatographic column was AcQuity UPLC BEH C18column，mobile phase A was methanol and mobile phase B was 0.1%formic acid，gradient elution；the electrospray ionization（ESI），positive ion scan（ES+）and multiple reaction monitoring（MRM）were used todeterminethe contents of aconitine，hypaoconitine and mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills.ResultsThe linear relationship was good in the range of 13.15-2 630.00 ng for aconitine（r=0.999 4），and the average recovery rate was 97.34%，RSD=1.79%（n=9）；the linear relationship was good in the range of 32.06-3 205.89 ng for hypaoconitine（r=0.999 9），and the average recovery rate was 96.09%，RSD=1.94%（n=9）；the linear relationship was good in the range of 10.23-2 046.00 ng for mesaconitine（r=0.999 3），and the average recovery rate was 95.94%，RSD=1.75%（n=9）.ConclusionThis microscopic identification method is simple and sensitive with significantly clear characteristics and easy to identify results；the UPLC-MS method is accurate and reliable with good repeatability，and can be used for the content determination aconitine，hypaoconitine and mesaconitine in SareShisanweiPengniao Pills.

SareShisanweiPengniao Pills；microscopic identification；UPLC-MS；aconitine；hypaoconitine；mesaconitine

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2016）18-0025-05

青海省科技廳資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2012-N-523。

魏文芝（1984-），女，主管藥師，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治觯娫挘?971-8247794（電子信箱）304436784@qq.com。

（2015-06-17）