ChiTaSBSS1200血液核酸檢測系統(tǒng)的分析性能驗證

聶湘輝 劉麗華 胡蒞鴻

ChiTaSBSS1200血液核酸檢測系統(tǒng)的分析性能驗證

聶湘輝 劉麗華 胡蒞鴻

廣東省河源市中心血站（河源513000）

目的 對ChiTaSBSS1200血液核酸檢測系統(tǒng)（簡稱“ChiTaS”）主要分析性能進行驗證，確定該系統(tǒng)是否穩(wěn)定、準確、可靠。方法 參照美國臨床實驗室標(biāo)準化協(xié)會（CLSI）相關(guān)文件要求，對在ChiTaS上開展的HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA項目進行檢出限、精密度、準確度及抗干擾等方面驗證。結(jié)果 ChiTaS分析系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA最低檢出限分別為3.63（3.16～6.26）IU/mL、12.71（10.37～21.63）U/mL、25.49（21.43～37.48）IU/mL；HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA陽性樣本總變異系數(shù)分別為2.56%、1.03%、3.36%；22個陰性樣本和10個陽性樣本進行8混樣模式檢測結(jié)果為反應(yīng)性，拆分檢測結(jié)果：陽性樣本符合率100%、陰性樣本符合率100%；溶血血漿（血紅蛋白含量為5 g/L）、脂肪血漿（甘油三酯大于6.3 mmol/L）對低濃度HBV（6.3 IU/mL）、HCV（23.3 IU/mL）、HIV（47.6 IU/mL）樣本檢出無顯著影響。結(jié)論 ChiTaS檢出限、精密度、準確度等均達到生產(chǎn)商的檢測性能的要求，實驗室該系統(tǒng)的檢測能力可以滿足本血站對無償獻血者樣本的常規(guī)核酸檢測要求。

核酸檢測 性能驗證

檢測系統(tǒng)的分析性能評價是臨床檢驗質(zhì)量管理的重要內(nèi)容之一?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程（2015版）》要求所有血液在進行血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)上，必須進行核酸檢測。隨著血液核酸檢測全覆蓋工作的推進，如何對血液核酸檢測的新設(shè)備進行性能驗證、有效進行過程監(jiān)控是很多血站檢驗科面臨的難題。目前核酸檢測系統(tǒng)的操作性能和分析性能信息大部分由生產(chǎn)廠家提供，這些參數(shù)源自廠家在最佳條件下完成，因此實驗室應(yīng)對各自實驗室檢測系統(tǒng)重新評價或建立性能參數(shù)，才能保證檢測結(jié)果符合臨床應(yīng)用需求［1］。CAP認可和ISO15189要求對于定量檢測性能驗證均有詳細說明，對于免疫學(xué)定性檢測性能驗證指標(biāo)尚無明確的行業(yè)標(biāo)準。國內(nèi)專家認為在定性檢測中最重要的性能驗證應(yīng)包括檢測的精密度、準確性及最低檢出限［2］。本研究參照美國臨床實驗室標(biāo)準化協(xié)會（CLSI）相關(guān)文件要求，從檢出限、精密度、準確度率等方面對ChiTaS檢測系統(tǒng)進行性能驗證：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 選擇本血站2015年1月1日—2016年1月1日采集的無償獻血者血漿。收集的所有樣本均嚴格按照本科室現(xiàn)行SOP要求檢測［3］。①陰性樣本：實驗室檢測HBVsAg、HBVsAb、HBVeAg、HBVeAb、HBVcAb、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV、HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢測結(jié)果均為陰性；②HBV陽性樣本：HBVsAg、HBVeAg/ HBVeAb、HBVcAb、HBV-DNA結(jié)果均為陽性；③HCV陽性樣本：稀釋后的HCV陽性質(zhì)控品；④HIV陽性樣本：抗-HCV雙試劑陽性且確認試驗結(jié)果陽性；⑤溶血血漿（血紅蛋白含量為5 g/L）及脂肪血漿（甘油三酯大于6.3 mmol/L）由本實驗室制備，HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA檢測結(jié)果均為陰性。

1.1.2 主要儀器 ChiTaS BSS1200自動核酸純化儀；ABI 7500核酸擴增儀；HR40-IIA2生物安全柜；DL-5M低速冷凍離心機。

1.1.3 主要試劑 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）由上海浩源生物科技有限公司提供，批號為MF20160102。質(zhì)控品由北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司提供，HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA濃度分別為500 IU/mL、2000 IU/mL、2000 IU/mL，批號為201601001。

1.2 方法

1.2.1 檢出限驗證 將HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA定值質(zhì)控品用陰性血漿進行梯度稀釋，HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA系列濃度為：①12.6 IU/mL、46.6 IU/ mL、95.2 IU/mL；②6.3 IU/mL、23.3 IU/mL、47.6 IU/ mL；③3.2 IU/mL、11.7 IU/mL、23.8 IU/mL；④1.5 IU/ mL、5.8 IU/mL、11.9 IU/mL。采用單人份檢測模式（簡稱“單檢”），每個濃度重復(fù)10次，統(tǒng)計分析其95%檢出限及置信區(qū)間。

1.2.2 準確度驗證 22例陰性樣本與HBV（6例）、HCV（2例）、HIV（2例）陽性樣本交替間隔排列。先采用混合樣本檢測模式（簡稱“混檢”），呈反應(yīng)性結(jié)果再進行單檢拆分。

1.2.3 精密度驗證 分別將HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA質(zhì)控品稀釋至100%檢出限（由廠家提供），即稀釋后HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA質(zhì)控品終濃度分別為18.9 IU/mL、69.9 IU/mL、142.8 IU/mL。對該樣采用單檢模式檢測，連續(xù)檢測5天，每日重復(fù)檢測4次，陽性結(jié)果以Ct值表示，參照文獻［4］計算Ct值的標(biāo)準差和變異系數(shù)（CV值），同廠家提供的允許CV值比較。

1.2.4 抗干擾確認 將HBV、HCV、HIV質(zhì)控品按一定比例分別加入到溶血血漿、重度脂肪血漿（乳糜狀）及陰性血漿中，使HBV、HCV、HIV質(zhì)控品在血漿中終濃度分別為：6.3 IU/mL、23.3 IU/mL、47.6 IU/mL。與陰性樣本混檢模式檢測20次。

1.2.5 質(zhì)控檢測 每次實驗過程中同時檢測試劑盒配套的陰性、陽性對照以及外部購買的陽性質(zhì)控（濃度為廠家提供的100%檢出限）。當(dāng)每次質(zhì)控結(jié)果在控且符合實驗室SOP要求時，實驗數(shù)據(jù)為有效，否則要求重新檢測。

1.2.6 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件PROBIT統(tǒng)計分析系統(tǒng)的95%檢出限及其相關(guān)置信區(qū)間。準確性和精密度分別用陰性、陽性檢出率、Ct值的標(biāo)準差及變異系數(shù)進行驗證。

2 結(jié) 果

2.1 檢出限驗證結(jié)果 HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA95%檢出限分別為3.63 IU/mL、12.71 U/mL、25.49 IU/mL，均低于廠家提供的檢出限。見表1。

表1 ChiTaS系統(tǒng)檢測HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢出限驗證結(jié)果

2.2 準確度驗證結(jié)果 22個陰性樣本和10個陽性樣本進行8混樣模式檢測結(jié)果為反應(yīng)性，拆分單檢結(jié)果中22個陰性，陰性符合率100%；10個陽性樣本結(jié)果分別為HBVDNA 6例、HCV-RNA 2例、HIV-RNA 2例，陽性符合率為100%。

2.3 精密度驗證結(jié)果 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA結(jié)果均為陽性，Ct值的均數(shù)分別為37.93、33.63、40.60，總變異系數(shù)分別為2.56%、1.03%、3.36%。均低于廠家要求允許的CV值（10%）。

表2 ChiTaS系統(tǒng)檢測HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA精密度驗證結(jié)果

2.4 抗干擾能力驗證 含有低濃度HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA質(zhì)控品的溶血血漿（血紅蛋白含量為5 g/ L）、重度脂肪血漿（甘油三酯大于6.3 mmol/L）及正常陰性血漿檢測結(jié)果見表3：在溶血血漿及重度脂肪血漿中HIV-RNA的檢出率較低，分別為90%（18/20）和95%（19/20），與正常陰性血漿檢出率（95%）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.147；=1.026，P=0.311）；在溶血血漿、重度脂肪血漿及正常陰性血漿中HBV-DNA、HCV-RNA檢出率均為100%（20/20）。溶血血漿及重度脂肪血漿對低濃度的HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢出均無影響。

表3 ChiTaS系統(tǒng)對溶血血漿和重度脂肪血漿干擾能力驗證結(jié)果

3 討 論

血站實驗室實行有效的質(zhì)量控制，對于相關(guān)輸血傳染病檢出、保障輸血安全至關(guān)重要［5］。實驗室應(yīng)盡量選擇特異性、靈敏性高及穩(wěn)定性好的檢測系統(tǒng)。目前國內(nèi)血站實驗室檢測均采用國家法規(guī)規(guī)定的血液檢測方法，基本上實現(xiàn)自動化檢測設(shè)備和商品化試劑盒。葛紅衛(wèi)［6］等提出為獲得準確、穩(wěn)定檢測結(jié)果，實驗室除在血液檢測方法使用之前對檢測系統(tǒng)進行確認外，還應(yīng)在使用一定時間周期內(nèi)，對已經(jīng)過確認的檢測方法的進行性能驗證，識別使用過程中產(chǎn)生的偏差，并及時加以糾正。ChiTas可以采取混檢或單檢模式HBV-DNA/HCV-RNA/HIV-RNA單管同時檢測，直接報告反應(yīng)性病原體種類，不需要再進行鑒別檢驗。本研究采用購買的定值血漿質(zhì)控品，每個項目均收集40例檢測結(jié)果做檢出限驗證分析，結(jié)果顯示該系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢出限分別為3.63（3.16～6.26）IU/mL、12.71（10.37～21.63）U/mL、25.49（21.43～37.48），符合FDA對NAT血液篩查HBV（100 IU/mL）、HCV（100 copies/mL）、HIV（100 copies/mL）分析靈敏度要求［7］，均低于廠家提供的檢出限，符合實驗室核酸檢測要求。曹誼［8］等認為研究結(jié)果與廠家參數(shù)比較不完全一致，其原因可能是由于廠家進行性能驗證時使用的是國際標(biāo)準品和大樣本檢測。

對于定性試驗，準確度通常采用陰性、陽性符合率來驗證［9］。本研究采用混檢、單檢模式確認陰性、陽性符合率，結(jié)果顯示：混檢陽性符合率、單檢拆分陽性率符合率為100%。在拆分單檢時，相間排列在陽性樣本間22個陰性樣本結(jié)果均為陰性，陰性符合率100%，未出現(xiàn)假陽性。由于本實驗室實行剔除酶免結(jié)果陽性樣本再進行核酸檢測策略，樣本陽性率低，且在整個性能驗證過程中未出現(xiàn)樣本間交叉污染現(xiàn)象，故本研究未對該儀器抗交叉污染性能進行驗證。

精密度作為性能驗證的重要指標(biāo)之一，定量檢測通常以變異系數(shù)或標(biāo)準差表示。定性檢測的精密度驗證可以根據(jù)檢測樣本的S/C0值，按照定量檢測方式進行CV值的分析。本研究中，由于ABI7500核酸擴增儀結(jié)果無法導(dǎo)出S/ C0值，則采用Ct值計算CV值。結(jié)果顯示：HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA總變異系數(shù)分別為2.56%、1.03%、

3.36 %，均低于廠家低于測定的CV值（10%），說明Chi-TaS系統(tǒng)在本實驗室具有良好的精密度，符合實驗要求。同時，ChiTaS系統(tǒng)抗干擾能力強，低濃度陽性樣本不受樣本中脂肪血漿（甘油三酯）、溶血血漿（血紅蛋白）的影響。

綜上所述：ChiTaS檢出限、精密度、準確度等參數(shù)符合要求，實驗室該系統(tǒng)的檢測能力可以滿足本血站對樣本的常規(guī)核酸檢測要求。

［1］趙芹，辛青松，李崢嶸，等.ABIViiA 7 Taqman HBVDNA檢測系統(tǒng)性能驗證［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015（5）：669-670.

［2］李金明.定性測定的性能驗證［C］//中華醫(yī)學(xué)會第九次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編.2011.

［3］黃璐，聶湘輝，劉麗華.河源市無償獻血者人群結(jié)構(gòu)特征與血液檢測結(jié)果分析［J］.廣州醫(yī)藥，2015，46（6）：77-80.

［4］王薇，王治國，李少男.臨床實驗室對廠家聲明的精密度和真實度的性能驗證要求［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25（12）：1001-1005.

［5］滕青，汪傳喜，戎霞，等.全血和機采血小板獻血不良反應(yīng)的調(diào)查分析［J］.廣州醫(yī)藥，2011，42（3）：65-66.

［6］葛紅衛(wèi)，王鴻捷.血站實驗室血液檢測方法確認的技術(shù)實踐［J］.中國輸血雜志，2014，27（4）：345-348.

［7］姚鳳蘭，汪德海，查祎，等.Procleix TIGRIS核酸分析系統(tǒng)分析性能及操作性能確認研究［J］.中國輸血雜志，2014，27（4）.361-367.

［8］曹誼，王凱，王玲玲，等.HBV/HCV/HIV血液核酸篩查試劑的性能驗證研究［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2015（12）：90-92.

［9］張保平，董莉，馮新平，等.乙肝病毒表面抗原方法學(xué)性能驗證的評價和分析［J］.職業(yè)與健康，2010，26（7）：106-106.

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.022

2016-03-25）