2型糖尿病腎病患者腎組織中STOML2的表達及作用

陳浩雄 傅君舟 何 鳳 劉日光

2型糖尿病腎病患者腎組織中STOML2的表達及作用

陳浩雄 傅君舟 何 鳳 劉日光

廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科（廣州510180）

目的 探討2型糖尿病腎?。―N）患者腎組織中STOML2的表達及作用。方法 免疫組化檢測臨床2型糖尿病腎病患者腎組織STOML2的表達及定位，采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法建立穩(wěn)定過表達STOML2的HK-2細胞系，并應(yīng)用Western blot檢測腎小管上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）、Fibronectin和STOML2的表達。結(jié)果 STOML2在DN患者腎組織的腎小管上皮細胞胞漿中表達明顯升高。在高糖刺激HK-2細胞建立的EMT模型中，STOML2呈時間依賴表達上調(diào)。STOML2穩(wěn)定高表達時，E-cadherin表達下調(diào)，而Fibronectin明顯上調(diào)，即能促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。結(jié)論 STOML2可能通過促進腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞分化，進而參與糖尿病腎病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病腎病 上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 纖維化 STOML2

糖尿病（diabetic mellitus，DM）患者中，若血糖控制欠佳若干年可發(fā)展為糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）。DN是DM最常見也是最嚴重的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎衰竭（End Stage Renal Disease，ESRD）的常見病因，這嚴重影響了DM患者的生存和預(yù)后，目前研究顯示，糖尿病腎病的發(fā)生率隨著DM患者年齡的增長和病程延長而不斷增高［1］。國內(nèi)資料顯示，DN已成為我國ESRD的第二位病因［2］。迄今為止，糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究表明，腎小管間質(zhì)纖維化是DN進展為ESRD的主要病理基礎(chǔ)，上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）被認為是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)之一［3］。Stomatin樣蛋白2（stomatin like protein 2，STOML2）是近期新發(fā)現(xiàn)的基因，該基因在惡性腫瘤中的表達上調(diào)明顯，可促進腫瘤的轉(zhuǎn)移［4］。在本項研究中，我們檢測臨床糖尿病腎病患者腎組織中STOML2的表達及定位，并探討其在腎小管上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco Invitrogen），小鼠抗STOML2單抗（美國Abcam），小鼠抗E-cadherin單抗和小鼠抗Fibronectin單抗（美國B&D），兔抗a-tubulin多抗（美國Santa Cruz）。質(zhì)粒pSin-EF2-vector和pSin-EF2-STOML2由中山大學(xué)李雋教授惠贈。免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純化。

1.1.2 儀器設(shè)備 凝膠成像、圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad），Western印跡儀（美國R&D），紫外分光光度計（英國Jenway），3K18低溫離心機（美國Sigma），Zeiss Axio Imager A1正立熒光顯微鏡（德國ZEISS）。

1.2 方法

1.2.1 收集廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)病理確診為2型糖尿病腎病且病理分期為III期的腎組織20例，并選取臨床腎癌患者正常腎組織（距腫瘤10 cm）10例作為對照。每例標本部分組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋、切片。病理切片特殊染色（HE染色、Masson染色）由廣州市第一人民醫(yī)院病理科完成。

1.2.2 HKC細胞培養(yǎng)：人腎小管上皮細胞株（HK-2）由北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)鄭法雷教授惠贈。細胞用含10%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。將細胞消化吹打混勻，接種于6孔板中，待細胞生長至70%融合時，按實驗設(shè)計加入高糖（含50mmol/L葡萄糖）分別培養(yǎng)HK-2細胞24 h、48 h、72 h，收集細胞樣品，采用Western blot分析。

1.2.3 Western印跡 在各時間點收集細胞，加SDS細胞裂解液提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%BSA封閉，STOML2（1∶1000）、E-cadherin（1∶2500）、fibronectin（1∶5000）一抗4℃孵育過夜，抗兔a-tubulin（1∶1000）一抗室溫孵育1 h，相應(yīng)的二抗IgG（1∶1000）室溫孵育1 h后，顯影成像。以a-tubulin為內(nèi)參，應(yīng)用圖像分析軟件掃描特異性條帶。

1.2.4 免疫組織化學(xué)分析 采用免疫組化SP法檢測STOML2蛋白表達：取5μm厚的10%甲醛固定的石蠟切片，二甲苯脫蠟水化。3%過氧化氫（H2O2）5 min滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3次，熱修復(fù)抗原，室溫血清封閉10 min后分別滴加稀釋的一抗小鼠抗STOML2單克隆體（1：200），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，滴加鼠二抗IgG，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染核，自來水沖洗返藍，脫水、透明、封片，鏡檢。每次染色均同時以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。每張切片400倍下隨機選取20個不重疊視野，拍片。

1.2.5 構(gòu)建STOML2穩(wěn)定過表達的HK-2細胞系 首先，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染制備慢病毒。將HEK293細胞均勻接種于10 cm皿中（培養(yǎng)皿預(yù)先以0.1%明膠鋪底），待細胞密度達到70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染，分別將目標質(zhì)粒Psin-EF2-STOML2/Psin-EF2-vector 2μg及其包裝質(zhì)粒psPAX2質(zhì)粒2μg和pMD2.G質(zhì)粒2μg，分別震蕩混勻加入67μl磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑，混勻室溫靜置20分鐘將轉(zhuǎn)染體系加入培養(yǎng)皿中，輕晃混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h候后換液成完全培養(yǎng)基15mL，培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)基，2000 rpm離心，收集上清。超濾柱過濾，4℃，6000 g離心30 min，使體積縮小至1 mL。病毒濃縮液分裝后于-80℃冰箱存放，備用。其次，將慢病毒液感染靶細胞。將靶細胞HK-2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)至60%左右密度，用生理鹽水洗一遍后加入2 mL完全培養(yǎng)基，再加入500μl病毒濃縮液，并加入polybrance試劑（促進病毒顆粒的融合感染）至終濃度為8μg/mL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。補加2 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)感染24 h。24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。并利用1μg/mL嘌呤霉素篩選已轉(zhuǎn)染成功的陽性克隆細胞，擴增后凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1 STOML2在DN腎組織中表達明顯上調(diào) 正常對照組的HE染色顯示腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球大小正常，腎間質(zhì)無增寬；Masson染色顯示腎小球及腎間質(zhì)無明顯膠原沉積；免疫組化顯示，近曲小管和遠曲小管的腎小管上皮細胞胞核中幾乎無STOML2表達。而DN腎組織HE染色顯示腎小球出現(xiàn)肥大或硬化，腎間質(zhì)增寬；Masson染色顯示腎小球及腎間質(zhì)有明顯膠原沉積，表明存在腎臟纖維化；免疫組化顯示，STOML2在腎小管上皮細胞漿高表達，明顯較對照組升高，見圖1。

2.2 STOML2在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞EMT模型中表達上調(diào) 高糖（High glucose，HG）（50 mmol/L）刺激HK-2細胞建立高糖誘導(dǎo)的EMT模型過程中，上皮細胞的Marker分子E-cadherin表達隨HG刺激時間的延長而降低，而間充質(zhì)細胞的Marker分子Fibronectin隨HG刺激時間的延長而增加，此時STOML2表達逐漸上調(diào)，在HG刺激72h時表達最高，見圖2，提示STOML2可能參與調(diào)控高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞EMT過程。

2.3 穩(wěn)定過表達STOML2可誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生EMT 我們采用慢病毒的方法將質(zhì)粒Psin-EF2-STOML2/Psin-EF2-vector分別轉(zhuǎn)染至HK-2細胞，采用嘌呤霉素篩選陽性克隆細胞，建立穩(wěn)定的細胞系（HK-2-Control，HK-2-STOML2），收集細胞樣品，采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在STOML2穩(wěn)定高表達時，E-cadherin表達下調(diào)，而Fibronectin明顯上調(diào)，見圖3，表明STOML2可以誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生EMT。

3 討 論

圖1 STOML2在DN腎組織中表達明顯上調(diào)（×200）

圖2 STOML2在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞EMT模型中表達上調(diào)

圖3 穩(wěn)定過表達STOML2可誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生EMT

以往研究認為腎小球病變在糖尿病腎病的發(fā)病中起重要作用，然而近年來研究者發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)病變在糖尿病腎臟病發(fā)病早期也至關(guān)重要，并且腎小管間質(zhì)病變的嚴重程度與蛋白尿排泄量和腎功能進行性下降密切相關(guān)，對糖尿病腎病患者的生存和預(yù)后有嚴重影響［5］。糖尿病腎病患者的臨床病理變化為：早期出現(xiàn)腎小管肥大，空泡變性，腎小管管腔擴張，刷狀緣面積減少DN，腎小管基底膜增厚；晚期表現(xiàn)為腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化，間質(zhì)纖維化的部位多伴有腎小球硬化。Gnudi等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病微量蛋白尿患者僅29%出現(xiàn)典型的腎小球硬化和小動脈透明變，然而有42%患者出現(xiàn)腎間質(zhì)病變，表現(xiàn)為腎小管肥大和間質(zhì)擴張［6］。糖尿病早期腎臟小管間質(zhì)病理改變是啟動和促進腎小管間質(zhì)纖維化進程的關(guān)鍵因素且不完全依賴于腎小球病變，是導(dǎo)致DN的獨立因素之一［7］，所以對DN腎小管間質(zhì)病變的研究也非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)STOML2在臨床DN患者腎組織及高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中均高表達，體外高表達STOML2能明顯促進腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，提示STOML2可能促進DN的纖維化發(fā)生發(fā)展。

DN進展為終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)是腎小管間質(zhì)纖維化，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在腎臟局部進行性積聚是DN的主要病理表現(xiàn)，而承擔(dān)ECM合成的主要是肌成纖維細胞［8］。目前研究表明在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程中，約30%～50%的新增成纖維細胞來源于腎小管上皮細胞的EMT過程［9］。在糖尿病中引發(fā)EMT的原因主要為高血糖、血管緊張素Ⅱ（AT-Ⅱ）、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）和氧化應(yīng)激等這些因素均可促進TGF-β1的表達，并通過TGF-β通路的活化促進DN的發(fā)生發(fā)展［6，10］。EMT是具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)化成具有活動能力、能夠在細胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細胞的過程，其特征為上皮細胞表型喪失及間質(zhì)特性的獲得。EMT主要表現(xiàn)為上皮細胞標志蛋白上皮鈣粘蛋白（E-cadherin）、ZO-1、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等的表達降低；間質(zhì)細胞標志蛋白纖維連結(jié)素（Fibronectin）、玻形蛋白（vimentin）、神經(jīng)鈣粘蛋白（N-catenin）等表達增加，導(dǎo)致細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變［11］。Zhang等［12］的研究發(fā)現(xiàn)STOML2能降低食管鱗狀上皮細胞的粘附，下調(diào)E-cadherin表達。本研究顯示穩(wěn)定過表達STOML2的腎小管上皮細胞，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達明顯下調(diào)，而間充質(zhì)細胞標志蛋白Fibronectin明顯上調(diào)，表明STOML2能有效促進腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，進而促進細胞外基質(zhì)的生成。

由于腎纖維化早期階段的EMT是可逆的，所以及早干預(yù)有可能誘導(dǎo)已發(fā)生EMT的腎小管上皮細胞恢復(fù)正常，維持腎臟正常的組織結(jié)構(gòu)和功能。通過本項研究，明確了高糖能上調(diào)STOML2的表達，且高表達STOML2能有效促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，這不僅加深了對EMT及DN腎間質(zhì)纖維化的認識，還提示減低STOML2的表達和功能可作為一個新的DN治療靶點。

［1］KANWAR YS，SUN L，XIE P，et al.A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy［J］.Annu Rev Pathol，2011，6：395-423.

［2］SATIRAPOJB.Review on pathophysiology and treatment of diabetic kidney disease［J］.J Med Assoc Thai，2010，93 Suppl6：S228-241.

［3］MATHIESON PW.The podocyte as a target for therapies——new and old［J］.Nat Rev Nephrol，2011，8（1）：52-56.

［4］LAPATSINA L，BRAND J，POOLE K，et al.Stomatindomain proteins［J］.Eur JCell Biol，2012，91（4）：240-245.

［5］AGGARWAL PK，VERON D，THOMAS DB，et al. Semaphorin3a promotes advanced diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2015，64（5）：1743-1759.

［6］GNUDI L，THOMAS SM，VIBERTI G.Mechanical forces in diabetic kidney disease：a trigger for impaired glucose metabolism［J］.J Am Soc Nephrol，2007，（8）：2226-2232.

［7］NAKAGAWA T，TANABE K，CROKER BP，et al.Endothelial dysfunction as a potential contributor in diabetic nephropathy［J］.Nat Rev Nephrol，2011，7（1）：36-44.

［8］LIU Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，（2）：212-222.

［9］ZEISBERG EM，POTENTA SE，SUGIMOTO H，et al. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-tomesenchymal transition［J］.JAm Soc Nephrol，2008，19（12）：2282-2287.

［10］WEIJ，SHIY，HOU Y，et al.Knockdown of thioredoxin-interacting protein ameliorates high glucose-induced epithelial tomesenchymal transition in renal tubular epithelial cells［J］.Cell Signal，2013，25（12）：2788-2796.

［11］ZEISBERGM，NEILSON EG.Biomarkers for epithelialmesenchymal transitions［J］.JClin Invest，2009，119（6）：1429-1437.

［12］ZHANG L，DING F，CAOW，et al.Stomatin-like protein 2 is overexpressed in cancer and involved in regulating cell growth and cell adhesion in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2006，12（5）：1639-1646.

The role of STOML2 in renal tissue of patients w ith type 2 diabetic nephropathy

Chen Haoxiong，F(xiàn)u Junzhou，He Feng，et al.Department of Nephrology，Guangzhou First People'sHospital，Guangzhou 510180，China

Objective To investigate the expression and role of STOML2 in renal tissue of patientswith type 2 diabetic nephropathy. M ethods To detecthe expression and localization of STOML2 in clinical renal tissue in patientswith type 2 diabetic nephropathy by immunohistochemistry，and use lentiviral transfectionmethod to establish a stable cell line of over-expressing STOML2，lastly applywestern blot to detect the expression of E-cadherin，F(xiàn)ibronectin and STOML2 in renal tubular epithelial cells. Results STOML2 was significantly increased in renal tubular epithelial cytoplasm of patients with DN.In the EMT model of HK-2 cells stimulated by high glucose，STOML2 was increased in a time dependent.Overexpression of STOML2 led to E-cadherin down-regulated，while Fibronectin up-regulated，which promoted the occurrence of EMT in renal tubular epithelial cells. Conclusion STOML2 may be involved in the development and progression of renal fibrosis in diabetic nephropathy by mediating epithelial-mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells.

Diabetic nephropathy；Epithelial-mesenchymal transition；Fibrosis；STOML2

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.013

2016-04-08）

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技引導(dǎo)項目（20151A010019）

傅君舟，E-mail：fujzhou@163.com