石榴酒釀造過程中的多酚及其抗氧化性

李明月　郝雅蘭　樊明濤　陳婧婕　徐廣令

摘 要：使用福林酚法測定石榴酒的總酚含量，以還原能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子清除能力及羥基清除能力為抗氧化指標，對石榴酒釀造過程中多酚含量及抗氧化能力進行分析。結(jié)果表明，在釀造過程中，石榴酒總酚、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子清除能力及羥基清除能力在釀造過程中稍微有所下降， 但最終趨于穩(wěn)定并維持在較高水平， 還原能力則始終保持恒定，與原汁相比無明顯損失。石榴酒作為一種新型養(yǎng)生果酒，其多酚含量較高， 表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。同時，本試驗中所選的3種釀酒酵母在釀造過程中對石榴酒的抗氧化能力的影響彼此之間無顯著差異。

關(guān)鍵詞：石榴酒；多酚；抗氧化性

中圖分類號：TS262.7 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.005

石榴自古以來就有“水晶珠玉”之稱，被列為果中珍品，在我國各地廣泛分布。其風(fēng)味獨特且功能性成分含量很高，有生津化食，健脾益胃，降壓止瀉，驅(qū)除腸道寄生蟲等保健療效作用[1]。國內(nèi)多次報道：食用石榴有預(yù)防高血壓功效，石榴對流感病毒也有抑制作用[2]。然而，我國對于石榴產(chǎn)品的開發(fā)還不是很成熟，加工品種單調(diào)，長期以來均以鮮食為主。在石榴汁的榨取過程中，會由于石榴籽中苦味物質(zhì)的釋放而影響其風(fēng)味，但在石榴酒的釀造過程中可以經(jīng)果膠酶的作用解決這一問題。然而，現(xiàn)階段對石榴酒釀造過程中功能性成分變化的研究卻很少。通過對石榴酒的釀造過程中功能性成分例如多酚的變化進行系統(tǒng)研究，探討多酚類化合物的變化規(guī)律，可為進一步提升石榴的營養(yǎng)價值奠定良好的理論依據(jù)，也可促使擴大石榴酒的生產(chǎn)，將石榴資源的地方優(yōu)勢變?yōu)榻?jīng)濟優(yōu)勢。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

石榴原料：采用產(chǎn)于四川省德陽市石榴示范基地的紅皮突尼斯軟籽甜石榴。

釀酒酵母：1#（WLP775），2#（4766 cider），3#（EXCE-SP）。

儀器：HC-3018R 高速冷凍離心機（安徽中科中信科學(xué)儀器有限公司），3802-uv/vis 紫外分光光度計（尤尼柯儀器有限公司），HS-840μ 型水平層流單人凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），PHS-3S pH 計（上海精科儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 石榴酒釀造工藝 參考文獻[3-4] 中的方法。挑選石榴→剝殼→去皮去隔膜→果汁處理（60 mg·L-1SO2， 250 mg·L-1果膠酶）→裝罐（SO2熏罐）→接種（4%酵母）→ 酵母發(fā)酵→倒罐→滅菌→成品。

1.2.2 常用指標測定 可溶性固形物采用手持折光儀測定；酒精含量采用酒精比重計法[5]測定；pH值采用pH計法測定；總酸采用酸堿指示劑法測定；還原糖采用DNS法[6-7]測定。

1.2.3 多酚的測定 總酚采用Folin-Ciocaheus 法[8]測定，取稀釋50倍的酒樣1.0 mL，依次加入5 mL蒸餾水、1 mL FC顯色劑、3 mL質(zhì)量分數(shù)為7.5%碳酸鈉溶液，于避光處靜置2 h后，于765 nm波長下測定樣品的吸光度。根據(jù)不同濃度梯度的一水沒食子酸溶液吸光度所繪制的標準曲線，計算總酚的含量。

1.2.4 抗氧化活性的測定 參考文獻[9-10]中的方法。（1）還原能力的測定：取0.2 mL酒樣，依次加入1 mL蒸餾水、濃度為0.2 mol·L-1pH值為6.6的磷酸緩沖液2.5 mL、質(zhì)量分數(shù)1%的鐵氰化鉀2.5 mL。將混合溶液置于50 ℃保溫箱中，恒溫20 min后加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸1 mL、蒸餾水2.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵0.5 mL，于700 nm下測定吸光度。以混合溶液的吸光度計算試樣的還原能力，則吸光度越高還原能力越強。

（2）DPPH 自由基清除率的測定：取200 μL酒樣加入1 800 μL蒸餾水、濃度為0.1 mmol·L-1的DPPH自由基醇2 mL，靜置30 min后，于517 nm下測定吸光度。吸光度越小，則自由基清除能力越強。

計算公式：DPPH自由基清除率=（1-A1/A0）×100%

式中：A1為石榴酒酒樣吸光度；A0為空白組吸光度。

（3）超氧陰離子清除率的測定：取50 mmol·L-1 Tris-HCl 緩沖液（pH值8.2） 4.5 mL，加入1 mL酒樣、25 mmol/L 的鄰苯三酚0.4 mL，靜置25 min。加入8 mmol·L-1 HCl 1 mL以終止反應(yīng)，后于299 nm下測定吸光度?？瞻讓φ战M以相同體積的蒸餾水代替樣品。

計算公式：超氧陰離子清除率=[Ao-（Ax-Axo）]/Ao×100%

式中：Ax為石榴酒酒樣吸光度；Ao為以水代替樣品做空白對照；Axo為樣品液本底水代替鄰苯三酚。

（4）羥基自由基清除率的測定：將1 mL 9 mmol·L-1的FeSO4、1 mL 9 mmol·L-1水楊酸乙醇混合，后加入1 mL酒樣（以Ao做空白對照，用水代替樣品），加入1 mL 8.8 mmol·L-1的H2O2啟動反應(yīng)。置于37 ℃下反應(yīng)30 min，于510 nm下測定吸光度。

計算公式：羥基自由基清除率=[Ao-（Ax-Axo）]/Ao×100%

式中：Ax為石榴酒酒樣吸光度；Ao為以水代替樣品做空白對照；Axo為本底反應(yīng)以水代替H2O2。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料四川甜石榴基本理化指標分析

原料紅皮突尼斯軟籽甜石榴原液中可溶性固形物含量約為14.1 Brix，總酸4.52 g·L-1（以酒石酸計），pH值3.73。主發(fā)酵結(jié)束后，可溶性固形物含量下降到5 Brix，總酸稍微有所上升，含量為5.25～5.43 g·L-1，成品酒的酒精度為4%vol～5%vol，本發(fā)酵過程沒有另外添加糖，屬于原汁發(fā)酵的低度果酒，最終pH值范圍為3.78～3.79，幾乎和原汁相同，比葡萄酒的pH值要高一些。

2.2 總酚變化

石榴多酚是一類強抗氧化劑，有助于改善關(guān)節(jié)彈力和皮膚彈性，強化動脈、靜脈和毛細血管[11-12]，其對抗關(guān)節(jié)炎和運動傷害的炎癥功效也有所報導(dǎo)[13-14]。因此，在石榴酒的釀造過程中對多酚含量的變化進行研究，有助于改善石榴酒品質(zhì)。

以沒食子酸作為標準物得到的多酚的標準曲線為：

Y=0.011 8X+0.012 0 （R2=0.999 3），

決定系數(shù)R2大，說明該關(guān)系式線性良好。利用該關(guān)系式計算石榴酒樣品的多酚含量，獲得石榴酒在發(fā)酵過程中隨時間變化的關(guān)系（圖1）。

由圖1可以看出，對于不同種類的酵母，在石榴酒的釀造過程中總酚的含量在前兩天均有一定的下降，隨后逐漸趨于平穩(wěn)。在石榴酒釀造初期，石榴汁中含有較多的氧，多酚自身分解及氧化，導(dǎo)致含量降低。隨著氧被耗盡，多酚含量趨于穩(wěn)定，而與所用酵母種類關(guān)系不大，且最終仍穩(wěn)定于較高的水平。

2.3 還原能力

由于酒樣中的抗氧化劑能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵（亞鐵氰化鉀），二價鐵進一步和三氯化鐵反應(yīng)生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍（Fe4[Fe（CN）6]3 ），因此，測定700 nm處的高低可以間接反映抗氧化劑的還原能力大小，吸光度越大，還原能力越強。

由圖2可以得知，石榴酒在釀造過程中，還原能力沒有太大的變化，始終維持在一個較高的水平，而所用酵母對石榴酒的還原能力基本沒有影響。天然化合物的還原能力可以反映其抗氧化性，石榴酒與其他果酒相比有較強的還原能力[15]。

2.4 DPPH清除能力

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在波長為517 nm下具有最大吸收。有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降，且下降程度呈線性關(guān)系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而以評價試驗樣品的抗氧化能力[16-17]。

由圖3可以得知，對于不同種類的酵母，在石榴酒的釀造過程中DPPH清除率在前兩天均有一定的下降，隨后稍有上升趨勢。在石榴酒釀造初期，石榴汁中含有較多的氧，導(dǎo)致其DPPH清除率降低，隨后隨著氧氣耗盡，DPPH清除率基本維持在一個較高的水平。不同種類酵母對此項指標影響不大，最終其DPPH清除率穩(wěn)定在92%左右，與原汁相差很小。

2.5 超氧陰離子清除能力

利用鄰苯三酚在弱堿性介質(zhì)中會自身氧化分解產(chǎn)生有色中間物和O2·-，O2·-對自氧化又起催化作用，此有色物質(zhì)在299 nm處有最大吸收波長，依據(jù)有色中間物的生成量，判斷O2·-的生成量。若體系中加入清除O2·-的物質(zhì)，則會減少有色物質(zhì)的生成，吸光度降低。吸光度越低，清除O2·-的效果越好。

由圖4可以得知，在石榴酒釀造的初期，其超氧陰離子清除能力呈現(xiàn)降低的趨勢，但最終穩(wěn)定在70%左右，所用酵母種類對最終結(jié)果沒有顯著影響。在釀造初期，由于石榴汁中含有一定量的氧，而使其超氧陰離子清除能力下降，但最終仍穩(wěn)定在高于其他果酒的較高水平上[18]。

2.6 羥基自由基清除能力

羥基自由基是目前所知活性氧自由基中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，可以使細胞壞死或突變，羥基自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬等有關(guān)[19]。羥基自由基易攻擊芳環(huán)化合物產(chǎn)生羥基化合物，在羥基自由基體系中加入水楊酸， 用比色法測定其羥基化產(chǎn)物2，3—二羥基苯甲酸的含量，進而判斷樣品的羥基自由基清除能力。

由圖5可以得知，對于不同種類的酵母，在釀造前兩天羥基自由基清除率均呈上升趨勢，后趨于穩(wěn)定，最終均穩(wěn)定在98%左右，所用酵母種類對其影響很小。在釀造初期，由于酵母發(fā)酵果渣中抗氧化性物質(zhì)溶解，而使其羥基自由基清除能力上升，但最終趨于穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本試驗研究了石榴酒釀造過程中多酚含量的變化，并且對石榴酒抗氧化性進行了測定。不同種類酵母對石榴酒發(fā)酵過程中功能性成分的變化幾乎無影響，且與原汁基本相同。石榴酒在釀造過程中其多酚的損失量較小，保留了絕大多數(shù)的多酚，這對食用者的身體是有好處的。石榴酒的還原能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子清除能力及羥基清除能力等抗氧化指標，在釀造初期雖有所降低，但最終均保持在較高水平，說明石榴酒是一個抗氧化能力比較強的產(chǎn)品。開發(fā)石榴酒不僅填補了果酒市場的空缺， 對人們的身體健康也有極大的好處，是一種值得推廣的新型養(yǎng)生果酒。同時開發(fā)利用石榴酒，還極大地延長了石榴的產(chǎn)業(yè)鏈，為當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展做貢獻。

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