系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征及其p27kip1/PTEN蛋白表達(dá)

王智琴 彭學(xué)標(biāo)

510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院皮膚科

·論著·

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征及其p27kip1/PTEN蛋白表達(dá)

王智琴 彭學(xué)標(biāo)

510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院皮膚科

目的 探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的生物學(xué)行為，證實SLE患者BMSC是衰老的干細(xì)胞，并探討其衰老的可能機(jī)制。方法 用密度梯度離心和貼壁分離法對6例SLE患者和8例健康人BMSC進(jìn)行分離培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡觀察BMSC形態(tài)學(xué)改變及生長狀況并繪制生長曲線，誘導(dǎo)成骨、成脂分化檢測BMSC分化能力，流式細(xì)胞儀鑒定BMSC表面標(biāo)志物及分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，劃痕試驗檢測BMSC遷移能力，免疫熒光法及蛋白印跡法分析BMSC內(nèi)p27kip1/PTEN的分布及表達(dá)。結(jié)果 SLE患者組BMSC形態(tài)寬大、扁平、呈多角形，與健康對照組相比，其生長速率、遷移及成骨成脂分化能力均明顯降低。SLE組處于早期（Q2）、中晚期（Q4）凋亡的BMSC細(xì)胞比例（17.98%±3.26%，16.80%±9.63%）顯著高于健康對照組（8.23%±3.25%，3.33%±2.21%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tQ2=3.91，PQ2=0.011；tQ4=2.99，PQ4=0.048）。SLE組BMSC阻滯于G0/G1期的細(xì)胞百分比顯著高于健康對照組（92.34%±5.80%比78.65%±3.22%，t=3.635，P=0.015），同時其S期所占細(xì)胞百分比明顯低于健康對照組（0.86%±1.72%比5.06%±1.874%；t=3.084，P=0.027）。SLE患者BMSC經(jīng)內(nèi)參均一化后的p27、PTEN蛋白表達(dá)水平（即p27/β肌動蛋白，PTEN/β肌動蛋白）均高于健康對照者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tp27=2.784，PP27=0.039；tPTEN=4.812，PPTEN=0.041）。結(jié)論 SLE患者BMSCs表現(xiàn)出衰老特征，可能與細(xì)胞內(nèi)p27kip1/PTEN表達(dá)水平升高有關(guān)。

紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；間質(zhì)干細(xì)胞；衰老；細(xì)胞凋亡；p27kip1/PTEN

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）不僅存在造血干細(xì)胞異常，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）也存在異常。近年來同種異體BMSC移植治療頑固性難治性SLE取得了進(jìn)展。Sun等［1］報道了同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）移植治療4例環(huán)磷酰胺或糖皮質(zhì)激素抵抗的難治性SLE，其療效肯定且無移植相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生。但Carrion等［2］報道自體BMSC移植治療2例SLE效果卻不理想。提示SLE患者的BMSC可能存在某些缺陷。本研究旨在分析SLE患者BMSC異常的生物學(xué)行為及其細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p27kip1/PTEN表達(dá)，從而證實SLE患者BMSC可能是衰老的BMSC。

對象與方法

一、對象

活動期SLE患者6例為2015年1-7月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科住院患者，均符合1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會（ACR）修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時參照2012版SLE活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)。健康對照組8例系南方醫(yī)院職工，均無風(fēng)濕病史及家族史。SLE組患者年齡（24±3）歲，其中男23～28歲，女17～26歲；健康對照組年齡（25±5）歲，其中男15～28歲，女23～33歲，兩組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.529，P=0.605）。本研究經(jīng)過南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者和健康對照者均簽署知情同意書，按常規(guī)方法獲取骨髓標(biāo)本。

二、方法

1.試劑與儀器：成人BMSC專用培養(yǎng)基、成脂及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基［賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司］，胰酶、磷酸鹽緩沖液（美國Gbico公司），F(xiàn)icoll人淋巴細(xì)胞提取液（天津TBD公司），一抗兔抗人PTEN IgG抗體（美國Abcam公司），一抗兔抗人p27kip1IgG抗體購自（美國Cell Signaling Technology公司），二抗HRP羊抗兔IgG抗體（美國Millipore公司），一抗兔抗人β肌動蛋白IgG抗體、ripa裂解液、蛋白酶抑制劑（武漢谷歌生物科技有限公司），ECL液、熒光二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海博彩生物科技有限公司），SDS-PAGE凝膠配膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Countstar自動細(xì)胞計數(shù)分析儀（上海睿鈺生物科技有限公司），小動物活體成像儀（美國Kodak公司）。

2.BMSC分離培養(yǎng)及鑒定：密度梯度離心法和貼壁篩選法分離BMSC。方法如下：取肝素抗凝的骨髓10 ml，等體積PBS稀釋，向其中緩慢加入等體積1.077 g/ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，按Ficoll淋巴細(xì)胞分離液說明書操作，最后按5×104個/cm2密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10 d，其中每3天換1次液。用含EDTA的0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，按1∶2或1∶3接種傳代。最終取第4代（P4）BMSC行流式細(xì)胞儀檢測，鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記：制備細(xì)胞懸液，與FITC標(biāo)記的CD29，CD44，CD73，CD105，CD34，CD45，CD14，HLADR避光孵育15 min，洗滌后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測分析。明確所分離細(xì)胞為BMSC，再取P4 BMSC進(jìn)行各項實驗檢測。

3.誘導(dǎo)成骨分化：制備BMSC單細(xì)胞懸液，并接種于24孔板，設(shè)3個復(fù)孔。24 h，換BMSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天換液，共誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d。漂洗，固定，茜素紅S溶液染色，再漂洗，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。

4.誘導(dǎo)成脂分化：制備BMSC單細(xì)胞懸液，接種于24孔板，設(shè)3個復(fù)孔，每3天換液。直到細(xì)胞達(dá)到90%匯合，換BMSC成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A，誘導(dǎo)3 d后，換脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B，維持培養(yǎng)2 d后，再次換BMSC誘導(dǎo)培養(yǎng)基A，即為誘導(dǎo)/維持1個循環(huán)。如此循環(huán)重復(fù)3遍后，漂洗，固定，油紅O溶液染色，再漂洗，光學(xué)顯微鏡下觀察脂滴數(shù)量。

5.生長曲線繪制：制備BMSC單細(xì)胞懸液，按5 000個/孔接種于24孔板，設(shè)3個復(fù)孔，接種當(dāng)天記為第0天，每3天換液。從第2天起每隔48小時，消化3孔細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，用Countstar自動細(xì)胞計數(shù)分析儀計數(shù)3個復(fù)孔的細(xì)胞數(shù)，并取其平均值，繪制12 d的細(xì)胞生長曲線。

6.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期：①檢測細(xì)胞凋亡：制備BMSC單細(xì)胞懸液，離心，按細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，避光孵育15 min，立即采用流式細(xì)胞儀檢測；②檢測細(xì)胞周期：制備BMSC單細(xì)胞懸液，離心，70%乙醇固定30 min，離心，PBS漂洗，加入細(xì)胞周期試劑300 μl，避光室溫孵育30 min，立即采用流式細(xì)胞儀檢測。

7.細(xì)胞劃痕試驗：制備BMSC單細(xì)胞懸液，接種于6 cm皿。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，在6 cm皿底部畫4條平行標(biāo)記線。用小槍頭畫與標(biāo)記線垂直的細(xì)胞劃痕，漂洗，換成不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并立即置于顯微鏡下拍下劃痕情況，并做位置標(biāo)記；孵育24 h后，在顯微鏡下觀察相同位置的細(xì)胞遷移情況。

8.細(xì)胞免疫熒光檢測p27kip1/PTEN蛋白分布：制備BMSC單細(xì)胞懸液，接種于共聚焦皿中，待細(xì)胞生長至適當(dāng)密度，固定，洗滌；0.3%triton透膜，抗p27kip1（1∶200）、PTEN（1 ∶50）抗體孵育，洗滌，熒光二抗（1∶1 000）避光孵育，洗滌，4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色，洗滌；用免疫熒光顯微鏡攝片。用Image J圖像分析軟件分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

9.Western印跡法檢測p27kip1/PTEN蛋白表達(dá)水平：收集BMSC，提取總蛋白，配分離膠和積層膠，加蛋白樣品，80 V電泳 30 min，120 V電泳至所需時間。轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗 p27kip1（1 ∶1 000），PTEN（1 ∶500），GAPDH（1 ∶3 000），β 肌動蛋白（1∶1 000），洗膜，再孵育HRP標(biāo)記的二抗（1∶4 000），洗膜后用ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光。結(jié)果用Quantity one圖像分析軟件測定條帶灰度值。

三、統(tǒng)計分析

圖1 SLE患者與健康對照骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）細(xì)胞形態(tài)（×100） 健康對照（1A）BMSC細(xì)胞細(xì)長，呈梭形，而SLE患者（1B）BMSC細(xì)胞寬大、扁平，呈多角形

圖2 SLE患者與健康對照骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）成骨、成脂分化能力比較（×40） BMSC形成的鈣結(jié)節(jié)被茜素紅S染成紅色：健康對照（2A）BMSC形成鈣結(jié)節(jié)數(shù)目少，稀疏，且染色淺；SLE患者（2B）BMSC形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目多，且簇集成團(tuán)，染色深。BMSC形成的脂滴被油紅O染成紅色：健康對照（2C）BMSC形成脂滴數(shù)目少，零散；SLE患者（2D）BMSC形成的脂滴數(shù)目多，融合成小片狀

結(jié) 果

一、BMSC的鑒定

SLE組和健康對照組BMSC表面抗原標(biāo)記測定結(jié)果顯示，CD29、CD44、CD105、CD73 表達(dá)均為陽性，而CD14、CD34、CD45和HLA-DR表達(dá)均為陰性，兩組BMSCs表面抗原表達(dá)一致。

二、SLE患者BMSC的衰老征象

1.BMSC細(xì)胞形態(tài)：顯微鏡下觀察SLE患者和健康對照者BMSCs（P4）體外生長形態(tài)，健康對照組BMSC呈長梭形，而SLE組BMSCs細(xì)胞體積增大、扁平、多角形，呈衰老狀態(tài)。見圖1。

2.BMSC成骨、成脂分化能力：SLE患者及健康對照者的BMSC均能向成骨、成脂分化，SLE患者BMSC形成鈣結(jié)節(jié)數(shù)及脂滴數(shù)均多于健康對照者，即SLE患者BMSC成骨、成脂分化能力均低于健康對照者。見圖2。

3.BMSC增殖能力：SLE患者與健康對照者的BMSC生長曲線均呈S形，接種后第2天起細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，第8天達(dá)到高峰，之后進(jìn)入平臺期。但SLE組BMSC生長速率較健康對照組慢。見圖3。

4.BMSC遷移能力：劃痕試驗后，顯微鏡下觀察SLE組和健康對照組細(xì)胞24 h遷移距離，評估兩組BMSC的遷移能力，SLE組BMSC 24 h遷移能力較健康對照組差。見圖4。

圖3 SLE患者與健康對照P4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線比較

5.BMSC細(xì)胞凋亡：SLE組處于早期（Q2）、中晚期（Q4）凋亡的BMSC細(xì)胞比例（17.98%±3.26%，16.80%±9.63%）顯著高于健康對照組（8.23%±3.25%，3.33%±2.21%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tQ2=3.91，PQ2=0.011；tQ4=2.99，PQ4=0.048）。見圖 5。

6.BMSC細(xì)胞周期：SLE組BMSC阻滯于G0/G1期的細(xì)胞百分比（92.34%±5.80%）顯著高于健康對照組（78.65%±3.22%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.635，P=0.015）；同時其S期所占細(xì)胞百分比（0.86%±1.72%）明顯低于健康對照組（5.06%±1.874%），差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.084，P=0.027）。見圖 6。

三、p27kip1/PTEN檢測結(jié)果

1.免疫熒光法檢測p27kip1/PTEN在BMSC內(nèi)的分布：SLE組及健康對照組 BMSC內(nèi) p27kip1、PTEN蛋白在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均有表達(dá)，且細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)均高于細(xì)胞質(zhì)。見圖7。

2.Western印跡法檢測p27kip1/PTEN在BMSC內(nèi)的表達(dá)：通過Quqntity one 軟件對 p27kip1、PTEN、β肌動蛋白蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，SLE患者BMSC經(jīng)內(nèi)參均一化后的p27、PTEN蛋白表達(dá)水平（即 p27/β 肌動蛋白，PTEN/β 肌動蛋白）均高于健康對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tp27=2.784，PP27=0.039；tPTEN=4.812，PPTEN=0.041）。見圖 8。

討 論

MSC是一類中胚層來源的非造血干細(xì)胞，主要來源于骨髓、臍帶血、脂肪等組織［3］，是造血微環(huán)境的重要成分，具有高度自我更新、體外高度擴(kuò)增、多向分化、免疫調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)免疫耐受、組織修復(fù)再造等特點。本實驗中所提取的BMSC具備細(xì)胞貼壁生長；表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105和CD73表達(dá)均陽性，CD14、CD34、CD45和 HLA-DR 表達(dá)均陰性；能向成骨、成脂方向分化等特征，基本符合國際細(xì)胞治療協(xié)會（ISCT）于2006年公布的BMSC鑒定標(biāo)準(zhǔn)［3］。

圖4 SLE患者與健康對照骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）遷移能力差異（×40） 通過比較劃痕縮窄程度評估劃痕0 h（4A、4C）～24 h BMSC遷移能力；24 h時（4B），SLE患者BMSC劃痕略有縮窄，部分BMSC向劃痕中間遷移即遷移能力減弱；健康對照（4D）BMSC劃痕縮窄更明顯，BMSC明顯向劃痕中間遷移

圖5 流式細(xì)胞儀檢測SLE患者與健康對照骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞凋亡差異 Q1：壞死細(xì)胞群（細(xì)胞碎片）；Q2：中晚期凋亡細(xì)胞群；Q3：正常細(xì)胞群；Q4：早期凋亡細(xì)胞群

圖6 流式細(xì)胞儀檢測SLE患者與健康對照骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期差異 G0/G1：DNA合成前期細(xì)胞群；S：DNA合成期細(xì)胞群；G2/M：細(xì)胞分裂期細(xì)胞群

細(xì)胞衰老是一種DNA損傷、氧化應(yīng)激、端?？s短、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白基因表達(dá)失衡或其他細(xì)胞有害刺激所致的不可逆的生長停滯，是機(jī)體退化過程中生理功能下降和紊亂的表現(xiàn)。MSC衰老征象主要表現(xiàn)為［4］：①細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞集落數(shù)量下降、集落變??；②細(xì)胞遷移能力減弱；③分化潛能顯著下降；④MSC出現(xiàn)明顯的不可逆G0/G1期阻滯，細(xì)胞凋亡增多；⑤調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)基因的表達(dá)變化，如生長調(diào)控蛋白（p53、p21、p16等）異常表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，SLE組BMSC增殖能力、遷移能力均明顯減弱，分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞比例減少，發(fā)生G0/G1期阻滯，早、中晚期凋亡BMSC比例增加，p27Kip1、PTEN蛋白表達(dá)增加。我們的研究結(jié)果與孟德芳等［5］、Sun 等［6］、Nie等［7］的結(jié)果相似，證實SLE患者BMSC是一種衰老的干細(xì)胞。

圖7 免疫熒光法檢測SLE患者和健康對照骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞p27、PTEN蛋白分布（×200） 綠色表示p27蛋白，紅色表示PTEN蛋白，藍(lán)色表示核區(qū)

圖8 Western印跡法檢測SLE患者和健康對照骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞p27、PTEN蛋白表達(dá)的差異

細(xì)胞周期的失調(diào)控被認(rèn)為在細(xì)胞衰老中具有關(guān)鍵作用，而細(xì)胞衰老的調(diào)控蛋白主要包括 p53/p21Cip1、p16INK4a/Rb、p27Kip1/PTEN 等 。 目 前 p53/p21Cip1、p16INK4a/Rb在國內(nèi)外已有相關(guān)研究報道，Gu 等［8-9］和 Shibata 等［10］先后發(fā)現(xiàn)SLE患者BMSC內(nèi)p16INK4a、p53/p21Cip1表達(dá)均明顯增高，p16INK4a的下游基因如p-Rb表達(dá)降低。然而，對p27Kip1/PTEN的研究較少。p27Kip1是一種重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平及分布受多種機(jī)制調(diào)控。PTEN是一種抑癌基因，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期，PTEN在許多衰老細(xì)胞內(nèi)被活化，而后通過抑制AKT磷酸化，使p27Kip1表達(dá)上調(diào)，最終使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，參與調(diào)控細(xì)胞衰老進(jìn)程。此外，Sun 等［11］研究發(fā)現(xiàn) p27Kip1/PTEN蛋白參與調(diào)控鼠聽覺祖細(xì)胞的增殖和分化。我們發(fā)現(xiàn)，SLE患者BMSC高表達(dá)p27Kip1/PTEN，且發(fā)生G0/G1期阻滯，增殖、成骨、成脂分化能力差，表明SLE患者BMSC中高表達(dá)p27Kip1/PTEN可促使G1期阻滯及抑制細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞衰老。衰老的BMSC增殖、分化、遷移等修復(fù)能力減弱，致使其免疫調(diào)節(jié)、免疫耐受異常，可能與SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

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Biological characteristics of and protein expressions of p27kip1/PTEN in bone marrow mesenchymal stem cells from patients with systemic lupus erythematosus

Wang Zhiqin,Peng Xuebiao

Department of Dermatology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

Objective To evaluate biological behaviors of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）from patients with systemic lupus erythematosus （SLE）,to confirm that the BMSCs are aging stems cells,and to explore mechanisms underlying their aging.Methods BMSCs were isolated from bone marrow of 6 patients with SLE（patient group）and 8 healthy human controls （control group）by density-gradient centrifugation and plastic adherence,and culturedin vitro.Optical microscopy was conducted to observe morphological changes and growth of BMSCs,and growth curves were drawn.The differentiation ability of BMSCs was evaluated through culture of them with adipogenic and osteogenic induction medium.Flow cytometry was performed to identify cellular surface markers and to analyze cell cycle and apoptosis,and scratch assay to assess the migration ability of BMSCs.Immunofluorescence assay and Western blot analysis were carried out to analyze the distribution and expression of p27kip1/PTEN in BMSCs respectively.Results Patient-derived BMSCs,which had a broad,flat and polygonal shape,showed decreased growth rate,migration activity as well as adipogenic and osteogenic ability compared with those from the controls.There was a significant increase in the proportion of BMSCs in early stage（17.98% ±3.26%vs.8.23%±3.25%,t=3.91,P=0.011）as well as in middle to late stages（16.80% ±9.63%vs.3.33% ±2.21%,t=2.99,P=0.048）of apoptosis in the patient group compared with the control group.Moreover,compared with the control group,the patient group showed a significantly higher proportion of BMSCs arrested in the G0/G1 phase（92.34% ±5.80%vs.78.65% ±3.22%,t=3.635,P=0.015）,but a lower proportion in the S phase（0.86% ±1.72%vs.5.06% ±1.874%,t=3.084,P=0.027）.The protein expressions of p27 and PTEN were significantly higher in the patient group than in the control group（p27/β-actin:t=2.784,P=0.039;PTEN/β-actin:t=4.812,P=0.041）.Conclusion The BMSCs from SLE patients exhibit senescence-related features,which may be associated with elevated expression levels of p27kip1/PTEN.

Lupus erythematosus,systemic;Mesenchymal stem cells;Aging;Apoptosis;p27kip1/PTEN

Peng Xuebiao,Email:pengxuebiao@126.com

彭學(xué)標(biāo)，Email：pengxuebiao@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.008

廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313317）

Fund program:Natural Science Foundation of Guangdong Province of China（2014A030313317）

2015-08-26）

（本文編輯：吳曉初）