系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者STAT3表達(dá)水平及其與DNA甲基化相關(guān)性研究

朱小華 梁俊 楊永生 徐金華

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者STAT3表達(dá)水平及其與DNA甲基化相關(guān)性研究

朱小華 梁俊 楊永生 徐金華

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

目的 探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血T淋巴細(xì)胞DNA甲基化水平、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）基因表達(dá)水平及二者的相關(guān)性。方法 取34例SLE患者和23例健康對(duì)照者外周血，分離T淋巴細(xì)胞，采用5甲基胞嘧啶抗體與流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA甲基化狀態(tài)，用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析STAT3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 SLE活動(dòng)期患者17例DNA甲基化水平（8.50±1.42）顯著低于健康對(duì)照者（11.31±1.34，P＜0.01），而其 STAT3基因表達(dá)水平（1.34±0.32）顯著高于健康對(duì)照者（1.02±0.28，P＜0.01）。SLE緩解期患者17例DNA甲基化水平（11.30±1.34）及STAT3基因表達(dá)水平（1.01±0.27）與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。SLE活動(dòng)期患者DNA甲基化水平顯著低于緩解期（P＜0.01），而其STAT3基因表達(dá)水平顯著高于緩解期（P＜0.01）。Pearson相關(guān)分析顯示，SLE患者DNA甲基化水平與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（SLE-DAI）呈負(fù)相關(guān)（r=-0.78，P＜0.01），STAT3基因表達(dá)水平與 SLE-DAI呈正相關(guān)（r=0.50，P＜0.01），而STAT3基因表達(dá)水平與DNA甲基化水平無(wú)相關(guān)（r=-0.13，P＞0.05）。結(jié)論 STAT3在外周血T淋巴細(xì)胞中的異常表達(dá)與SLE的病情活動(dòng)相關(guān)。STAT3基因表達(dá)水平與DNA甲基化水平無(wú)相關(guān)性。

紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；DNA甲基化；STAT3轉(zhuǎn)錄因子

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是累及全身多器官的慢性進(jìn)行性病譜性自身免疫病。表觀(guān)遺傳學(xué)研究顯示，DNA低甲基化通過(guò)促進(jìn)CD11a/CD18、CD70等共刺激分子的表達(dá)，使T細(xì)胞具有自身反應(yīng)性，活化的T細(xì)胞可促使B細(xì)胞活化、分泌免疫球蛋白，產(chǎn)生大量的針對(duì)自身抗原的抗體［1-2］。目前對(duì)于SLE中DNA甲基化異常的形成和調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚，涉及甲基化調(diào)控因素的研究很少。信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在細(xì)胞內(nèi)起著重要的信號(hào)傳遞作用，負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，通過(guò)誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物刺激的效應(yīng)作用［3］。本研究探討STAT3在SLE發(fā)病中的作用及與DNA甲基化的相關(guān)性。

材料與方法

1.材料：淋巴細(xì)胞分離液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CD3免疫磁珠分離器（德國(guó)Mitenyi Biotec公司），5甲基胞嘧啶抗體（美國(guó)Aviva Systems Biology公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），RNA抽提試劑盒（美國(guó)Promega公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.臨床病例收集：SLE患者34例，男4例，女30例，年齡 18～51（33.2±9.6）歲，為門(mén)診和住院患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（SLE-DAI）進(jìn)行評(píng)分。其中活動(dòng)期17例，診斷依據(jù)頰部紅斑等典型的臨床表現(xiàn)、抗核抗體等異常的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及SLE-DAI≥5；緩解期患者17例，診斷依據(jù)SLE病史，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及SLE-DAI＜5。健康對(duì)照組23例，男2例，女21例，年齡19～51（33.4±9.3）歲。

3.淋巴細(xì)胞的分離：采集SLE患者和健康對(duì)照者外周血10 ml，采用Ficoll密度梯度離心法，再采用CD3免疫磁珠按免疫磁珠及分離柱的說(shuō)明書(shū)分離T淋巴細(xì)胞。將分離的細(xì)胞分成2份，分別用于DNA甲基化檢測(cè)與STAT3的表達(dá)分析。

4.DNA甲基化檢測(cè)：采用5甲基胞嘧啶抗體與流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA甲基化狀態(tài)［4］，具體過(guò)程如下：將分離的一份外周血T淋巴細(xì)胞，在離心管中調(diào)整細(xì)胞為106/ml。PBS清洗1次，4%甲醛PBS室溫固定20 min后，PBS清洗3次；含0.5%Triton-100的PBS通透化處理15 min，PBS清洗3次；含10%羊血清的PBS封閉60 min后，用5甲基胞嘧啶抗體（終濃度為1 mg/L）37℃下孵育30 min，再用含0.1%吐溫20的PBS室溫下清洗3次；用鋁箔包裹后在室溫下用FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育60 min以上，用含0.1%吐溫20的PBS清洗3次。在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度，設(shè)立不加5甲基胞嘧啶抗體的陽(yáng)性對(duì)照，DNA甲基化水平=（樣品熒光強(qiáng)度－陽(yáng)性對(duì)照熒光強(qiáng)度）/陽(yáng)性對(duì)照熒光強(qiáng)度。

5.STAT3基因表達(dá)水平檢測(cè)：將分離的T淋巴細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTPCR擴(kuò)增STAT3與內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白。引物序列：STAT3 正向引物：5′-CGACCTGCAGCAATACCATTG A-3′，反向引物：5′-ACTCCATGTCAAAGGTGAGGG A-3′，共 135 bp；β 肌動(dòng)蛋白正向引物：5′-GCACCA CACCTTCTACAATGAGC-3′，反向引物：5′-GGATA GCACAGCC TGGATAGCAAC-3′，共 156 bp。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，50個(gè)循環(huán)；95℃保溫 1 min。制作熔點(diǎn)曲線(xiàn)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每個(gè)樣品目的基因的Ct值用內(nèi)參基因的平均Ct值來(lái)進(jìn)行歸一化（△Ct目標(biāo)=Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)參），分別獲得病例組和對(duì)照組樣品目的基因的△Ct值，然后計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量即 2-△△Ct。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Excel軟件記錄與整理數(shù)據(jù)，使用Stata7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析比較多組間總體差異，組內(nèi)多重比較時(shí)采用Bonferroni校正法，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.SLE患者與健康對(duì)照組DNA甲基化水平比較：SLE活動(dòng)期患者、緩解期患者及健康對(duì)照組DNA甲基化水平分別為8.50±1.42、11.30±1.34和11.31±1.34，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.18，P＜0.01）。兩兩多重比較結(jié)果顯示，SLE活動(dòng)期顯著低于緩解期及健康對(duì)照組（均P＜0.01），而SLE緩解期與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.SLE患者與健康對(duì)照組STAT3基因的表達(dá)：SLE活動(dòng)期患者、緩解期患者及健康對(duì)照組STAT3基因表達(dá)水平分別為1.34±0.32、1.01±0.27和1.02±0.28，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.66，P＜0.01）。兩兩多重比較結(jié)果顯示，SLE活動(dòng)期患者組顯著高于緩解期組和健康對(duì)照者（均P＜0.01），而SLE緩解期組與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。STAT3基因表達(dá)曲線(xiàn)圖見(jiàn)圖1。

3.SLE患者DNA甲基化水平、STAT3基因表達(dá)水平與SLE-DAI的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析顯示，SLE患者DNA甲基化水平與SLE-DAI成負(fù)相關(guān)（r=-0.78，P＜0.01），見(jiàn)圖 2。STAT3基因表達(dá)水平與 SLE-DAI呈正相關(guān)（r=0.50，P＜0.01），見(jiàn)圖3。而STAT3基因表達(dá)水平與DNA甲基化水平無(wú)明顯相關(guān)性（r=-0.13，P＞0.05）。

圖1 STAT3的曲線(xiàn)圖

圖2 SLE患者DNA甲基化水平與SLE-DAI的相關(guān)性

圖3 SLE患者STAT3的表達(dá)水平與SLE-DAI的相關(guān)性

討 論

人類(lèi)基因組中約有70%組織特異表達(dá)的基因5′端上游區(qū)有富含CpG二核苷酸對(duì)的CpG島。CpG島的甲基化及其去除的狀態(tài)，對(duì)維持和調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)起重要作用，當(dāng)某些CpG島的甲基化去除，可引起細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)異常，從而引至各種疾病的發(fā)生［5-6］。研究［6-8］表明，表觀(guān)遺傳學(xué)變化與幾類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，主要包括癌癥、免疫缺陷病及自身免疫性疾病。

本研究結(jié)果顯示，SLE患者體內(nèi)DNA甲基化水平顯著降低，且DNA甲基化水平與SLE-DAI呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明表觀(guān)遺傳學(xué)的改變可能是SLE發(fā)病的重要機(jī)制。目前有研究［1，9］證實(shí)，DNA 低甲基化通過(guò)促進(jìn)LFA-1、CD70等共刺激分子的表達(dá)，使T細(xì)胞具有自身反應(yīng)性，活化的T細(xì)胞一方面促使B細(xì)胞活化、分泌免疫球蛋白；另一方面，大量殺傷巨噬細(xì)胞，增加血液循環(huán)中的自身抗原，降低了對(duì)免疫復(fù)合物的清除，兩者相互促進(jìn)，產(chǎn)生了大量針對(duì)自身抗原的抗體。

STAT3是一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，與免疫、炎癥以及細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡等有關(guān)［3］。STAT3 可刺激 T 細(xì)胞分泌 IL-10［10］，并在 Th17/Th1平衡通路中起調(diào)控作用［11］。STAT3在腎小球中的激活可導(dǎo)致增生性免疫復(fù)合物性腎小球腎炎［12］。免疫組化［13］顯示，狼瘡模型小鼠的系膜細(xì)胞中STAT3被激活，引起系膜細(xì)胞增殖，進(jìn)而參與狼瘡腎炎的發(fā)生發(fā)展。本文結(jié)果顯示，SLE活動(dòng)期患者STAT3基因表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，且STAT3基因表達(dá)水平與SLE-DAI呈正相關(guān)，說(shuō)明STAT3基因在外周血T淋巴細(xì)胞中的異常表達(dá)可能與SLE的發(fā)病有關(guān)。

STAT3基因參與DNA甲基化的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，用STAT3 siRNA處理惡性T淋巴細(xì)胞后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的表達(dá)明顯下降，導(dǎo)致DNA低甲基化［14］。但本研究中，SLE患者STAT3基因的表達(dá)水平與DNA甲基化水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性，STAT3在SLE表觀(guān)遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的作用有待進(jìn)一步研究。

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STAT3 expression and its relationship with DNA methylation in patients with systemic lupus erythematosus

Zhu Xiaohua,Liang Jun,Yang Yongsheng,Xu Jinhua
Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

ObjectiveTo investigate DNA methylation status as well as signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） gene expression in peripheral blood T-lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus （SLE）,and to explore their relationship.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 34 patients with SLE and 23 healthy controls followed by the isolation of T-lymphocytes.Flow cytometry was performed to evaluate DNA methylation status using antibodies against 5-methylcytosine （5-mc）,reverse transcription （RT）-PCR to detect the mRNA expression of STAT3 in T-lymphocytes.ResultsCompared with healthy controls,17 patients with active SLE showed significantly decreased DNA methylation levels（8.50±1.42 vs.11.31±1.34,P＜0.01）,but increased STAT3 mRNA expression levels（1.34±0.32 vs.1.02±0.28,P＜0.01）.However,there were no significant differences between 17 patients with stable SLE and healthy controls in DNA methylation levels（11.30±1.34 vs.11.31±1.34,P＞0.05）or STAT3 mRNA expression levels（1.01±0.27 vs.1.02±0.28,P＞0.05）.Patients with active SLE also showed significantly reduced DNA methylation levels,but enhanced STAT3 mRNA expression compared with those with stable SLE （bothP＜0.01）.As Pearson correlation analysis showed,SLE disease activity index （SLE-DAI）was negatively correlated with DNA methylation levels in patients with SLE （r=－0.78,P＜0.01）,but positively correlated with STAT3 mRNA expression （r=0.50,P＜0.01）,and no significant correlation was observed between STAT3 mRNA expression and DNA methylation levels（r=－0.13,P＞0.05）.ConclusionThe aberrant expression of STAT3 in peripheral blood T-lymphocytes may be related to disease activity in SLE,but unrelated to DNA methylation levels.

Lupus erythematosus,systemic;DNA methylation;STAT3 transcription factor

Xu Jinhua,Email：hsyyxjh@163.com

2015-04-13）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

徐金華，Email：hsyyxjh@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（81371745）；上海市自然科學(xué)基金（12ZR1404500）

Fund programs：National Natural Science Foundation of China（81371745）;Shanghai Natural Science Foundation（12ZR1404500）