T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3對(duì)黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細(xì)胞的影響

呂雅琳 周曉偉 胡彬 吳瓊 曾學(xué)思 劉毅 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（呂雅琳、胡彬、吳瓊、曾學(xué)思、劉毅、孫建方），江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（周曉偉）

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3對(duì)黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細(xì)胞的影響

呂雅琳 周曉偉 胡彬 吳瓊 曾學(xué)思 劉毅 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（呂雅琳、胡彬、吳瓊、曾學(xué)思、劉毅、孫建方），江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（周曉偉）

目的 探討體外T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）對(duì)與小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)的酪氨酸相關(guān)蛋白-2（TRP-2180-188）抗原肽刺激小鼠淋巴細(xì)胞的影響。方法 構(gòu)建TIM-3重組質(zhì)粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2，分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2至人上皮293T細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，制備含TIM-3、免疫球蛋白（Ig-tail）的上清液。TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠，分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，用TRP-2180-188抗原肽和白細(xì)胞介素（IL）-2刺激培養(yǎng)5 d，以未刺激細(xì)胞作為對(duì)照組。構(gòu)建B16F10細(xì)胞與上述TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系，分為空白對(duì)照組（加293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清液）、TIM-3組（加含TIM-3上清液）、陰性對(duì)照組（加含Ig-tail上清液）。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)共培養(yǎng)體系中干擾素（IFN）-γ和腫瘤壞死因子（TNF）-α濃度，流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)體系中CD8+T淋巴細(xì)胞。結(jié)果 酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)目的基因正確插入真核表達(dá)載體中，檢測(cè)到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2的293T細(xì)胞上清液中有TIM-3表達(dá)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2的293T細(xì)胞上清液中有Ig-tail的表達(dá)。CCK-8法檢測(cè)顯示24 h時(shí)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、TIM-3組淋巴細(xì)胞增殖活力分別為（100.00±10.42）%、（108.70±9.90）%、（78.06±6.37）%，48 h 時(shí)分別為（100.00±6.24）%、（168.00±2.98）%、（42.93±5.93）%；24 h、48 h時(shí)TIM-3組淋巴細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05）。TIM-3組48 h相比24 h淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù)低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05）。24 h時(shí)，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、TIM-3組 IFN-γ濃度分別為（216.44±7.85）、（223.67±7.79）、（192.96±5.05）ng/L，48 h時(shí)分別為（230.06±4.23）、（167.24±3.33）、（54.95±0.57）ng/L。24 h、48 h時(shí)，TIM-3組 IFN-γ 濃度低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05）。24 h、48 h時(shí)，TIM-3組TNF-α濃度低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05）。24 h時(shí)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、TIM-3組CD8+T淋巴細(xì)胞中位數(shù)分別為0.421%、2.22%、3.30%，48 h時(shí)分別為0.577%、0.691%、4.06%。24 h、48 h時(shí)TIM-3組CD8+T淋巴細(xì)胞中位數(shù)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)對(duì)照組。結(jié)論 TIM-3在體外能夠抑制B16F10細(xì)胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ、TNF-α，提高CD8+T淋巴細(xì)胞。

黑色素瘤，實(shí)驗(yàn)性；疫苗，亞單位；T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性；干擾素γ；T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-3

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子（T cell immunoglobulin and mucin domain，Tim）家族基因主要表達(dá)于T細(xì)胞，其編碼的蛋白包括信號(hào)肽、免疫球蛋白區(qū)、黏蛋白區(qū)、跨膜區(qū)和有磷酸化位點(diǎn)的胞內(nèi)區(qū)［1］。TIM家族在鼠中包括8個(gè)成員，在人類中包括3個(gè)成員。TIM-3為該家族成員，是一種重要的負(fù)性調(diào)控分子，抑制Th1介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)和同種免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受，參與腫瘤的免疫逃逸。本研究探討體外TIM-3對(duì)黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖、干擾素（IFN）γ和腫瘤壞死因子（TNF）α分泌及對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞的影響。

資料和方法

一、動(dòng)物、細(xì)胞、試劑和儀器

6周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠（揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證201512801），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（大連Takara公司）；人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16F10（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心），pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質(zhì)粒（美國(guó)InvivoGen公司），RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白胨、酵母浸出粉（美國(guó)Gibco公司），脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、胰蛋白酶、CpG-ODN1826、TRP-2180-188抗原肽（美國(guó)Invitrogen公司），DNA分子標(biāo)志物（大連TAKARA公司），抗生素Zeocin（法國(guó)Cayla公司），山羊抗小鼠IgG2a單抗（美國(guó)Proteintech公司），弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）、小鼠白細(xì)胞介素（IL）2（美國(guó) Sigma公司），小鼠淋巴細(xì)胞分離液、鼠IFN-γ ELISA試劑盒、鼠TNF-α ELISA試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司），絲裂霉素（江蘇泰諾源生物技術(shù)有限公司），CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），鼠CD8a抗體（德國(guó)美天旎生物公司），紫外分光光度計(jì)（DU800，美國(guó)Beckham Coulter公司），PCR儀、凝膠成像及分析裝置（美國(guó)Bio-Rad公司），流式細(xì)胞儀（FACSVerseTM，美國(guó)BD公司）。

二、TIM-3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

1.TIM-3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證：在線檢索TIM-3蛋白質(zhì)氨基酸序列及開放讀碼框ORF，通過(guò)BLAST比對(duì)由ORF得到的氨基酸序列和核酸序列。通過(guò)TMpred預(yù)測(cè)TIM-3可能的跨膜區(qū)域，同時(shí)參照Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果確定TIM-3胞外域。根據(jù)其胞外域結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的ORF用Primer premier5設(shè)計(jì)引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

小鼠TIM-3蛋白包含281個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其中1-19位為信號(hào)肽，20-193為胞外域，194-214位為跨膜區(qū)。設(shè)計(jì)擴(kuò)增優(yōu)化后的Tim3Ig融合蛋白（1-193位氨基酸）的核酸序列，正向引物：5′-GAATTC GCCGCCACCATG-3′，反向引物：5′-GGATCCTCAA TGATGATG-3′。

從小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞RT-PCR獲得的原始序列構(gòu)建到pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質(zhì)粒上的表達(dá)量很低，分析原始序列包含7個(gè)稀有密碼子，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，但不影響小鼠TIM-3的體外表達(dá)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，將優(yōu)化后的表達(dá)序列連接到pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質(zhì)粒上，酶切驗(yàn)證并測(cè)序比對(duì)。

2.TIM-3真核表達(dá)載體的表達(dá)：將狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞按1×105細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，加入500 μl含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合至90%以上時(shí)開始轉(zhuǎn)染，將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔400 μl；參照 LipofectamineTM2000 操作說(shuō)明進(jìn)行pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質(zhì)粒及pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h上清液中TIM-3及Ig-tail的濃度，凍存上清液備用。

三、TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠及B16F10細(xì)胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

1.TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠：初次免疫每份肽疫苗成分：5 μl TRP-2180-188抗原肽（10 g/L），45 μl 30%DMSO，50 μl CpG1826（1 g/L），50 μl弗氏不完全佐劑；加強(qiáng)免疫每份肽疫苗成分：10 μl TRP-2180-188抗原肽（10 g/L），40 μl 30%DMSO，50 μl CpG1826（1 g/L），50 μl弗氏不完全佐劑。將充分乳化后的肽疫苗于小鼠股外側(cè)分雙側(cè)皮下注射；免疫分初次免疫和加強(qiáng)免疫，將第1次免疫的時(shí)間設(shè)為第0天，初次免疫時(shí)間為第0，3，6天，共3次，加強(qiáng)免疫為第20天，共1次。

2.B16F10細(xì)胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)：斷頸處死加強(qiáng)免疫后1周的C57BL/6小鼠，取脾臟，參照小鼠淋巴細(xì)胞分離液操作說(shuō)明進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞提取，將提取的淋巴細(xì)胞按照2×106/ml濃度接種于含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，同時(shí)加入終濃度為10 μmol/l的TRP-2180-188抗原肽和20μg/L（相當(dāng)于≥100U/ml）IL-2，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行B16F10細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代，用終濃度25 mg/L絲裂霉素處理B16F10細(xì)胞，完全洗去絲裂霉素后與前述體外培養(yǎng)5 d的脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

四、TIM-3對(duì)與小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴細(xì)胞的影響

1.實(shí)驗(yàn)分組：按照每孔TRP-2180-188肽疫苗刺激脾淋巴細(xì)胞濃度2×106/ml、B16F10細(xì)胞濃度2×105/ml進(jìn)行共培養(yǎng)，分組如下：空白對(duì)照組：加293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清液；陰性對(duì)照組：加含Ig-tail（轉(zhuǎn)染pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2空質(zhì)粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h）上清液；TIM-3組：加含TIM-3（轉(zhuǎn)染pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2質(zhì)粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h）上清液。

2.CCK-8法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞增殖情況：在96孔板中，參照上述分組方法（本實(shí)驗(yàn)增加一組只含有293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h上清液和經(jīng)過(guò)絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞的空白組），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基或者上清液調(diào)整每孔最終總體積為100 μl，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h和48 h參照CCK-8試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)450 nm處吸光度A值并進(jìn)行結(jié)果分析。細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（空白對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。48 h淋巴細(xì)胞相對(duì)24 h增殖倍數(shù)=（實(shí)驗(yàn)組48 hA值-空白組A值）/（實(shí)驗(yàn)組24 hA值-空白組A值）。

3.ELISA檢測(cè)各組共培養(yǎng)體系24 h、48 h上清液中IFN-γ和TNF-α分泌情況：分別收集各組B16F10細(xì)胞與TRP-2180-188抗原肽刺激脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24 h和48 h的上清液，參照ELISA試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)上清液中IFN-γ和TNF-α濃度。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)體系中24 h和48 h CD8+T淋巴細(xì)胞：從共培養(yǎng)體系中吸取懸浮的淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)；將細(xì)胞300×g離心10 min，完全去除上清液；用 45 μl重懸 106細(xì)胞；加 5 μl CD8a 抗體；4℃避光孵育10 min；加1～2 ml緩沖液，300×g離心10 min，完全去除上清液；用500 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用FlowJo7.6.1軟件進(jìn)行分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、TIM-3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

將579 bp的目的片段連接至pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2質(zhì)粒，得到pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重組質(zhì)粒，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ/BgⅢ雙酶切驗(yàn)證，得到預(yù)期大小目的片段，見圖1。測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果與目標(biāo)序列一致。

pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2空質(zhì)粒和pFUSETIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48 h，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TIM-3和Ig-tail的濃度分別為 28.46、23.12 μg/L。

圖1 pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2重組質(zhì)粒的EcoRⅠ/BgⅢ雙酶切驗(yàn)證 1：重組質(zhì)粒（3 000 bp）；2：EcoRⅠ/BgⅢ雙酶切重組質(zhì)粒（酶切片段579 bp）；3：標(biāo)準(zhǔn)參照物

二、B16F10細(xì)胞與TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系構(gòu)建

1.TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠：經(jīng)TRP-2180-188肽疫苗加強(qiáng)免疫后1周的C57BL/6小鼠淋巴結(jié)較未免疫小鼠增大5～6倍，脾臟較未免疫小鼠增大1.5倍，表明肽疫苗免疫成功。

2.絲裂霉素處理B16F10細(xì)胞：24 h和48 h分別在光鏡下觀察顯示：經(jīng)絲裂霉素處理后B16F10細(xì)胞密度明顯低于未處理的細(xì)胞。CCK-8法檢測(cè)顯示，24 h空白組、經(jīng)絲裂霉素處理組、未經(jīng)絲裂霉素處理組A值分別為 0.262±0.043、0.347±0.014、0.698±0.042，48 h時(shí)分別為 0.261±0.012、0.331±0.011、1.121±0.040。24 h和48 h時(shí)，未經(jīng)絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞A值均高于經(jīng)絲裂霉素處理B16F10細(xì)胞（均P＜0.05）；經(jīng)絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞24 h與48 h時(shí)的A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；未經(jīng)絲裂霉素處理的B16F10細(xì)胞48 h時(shí)A值明顯高于24 h時(shí)（P＜0.05）。

3.TRP-2180-188抗原肽、IL-2體外刺激免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TRP-2180-188抗原肽、IL-2體外刺激的細(xì)胞形態(tài)基本無(wú)變化，經(jīng)TRP-2180-188抗原肽、IL-2體外刺激的淋巴細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)集落性增殖，并且出現(xiàn)體積增大、胞核大、胞質(zhì)豐富的細(xì)胞。見圖2。

4.B16F10細(xì)胞與TRP-2180-188肽疫苗刺激淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)：隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，淋巴細(xì)胞體積增大、胞核變大、胞質(zhì)豐富，逐漸出現(xiàn)淋巴細(xì)胞向B16F10細(xì)胞周圍聚集的現(xiàn)象。見圖3。

圖2 光鏡下觀察免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)5 d后的形態(tài)（×40） 2A：未接受刺激細(xì)胞：細(xì)胞形態(tài)基本無(wú)變化；2B：接受TRP-2180-188抗原肽、IL-2刺激細(xì)胞：細(xì)胞集落性增殖，出現(xiàn)體積增大、胞核大、胞質(zhì)豐富的細(xì)胞

圖3 光鏡下觀察小鼠脾淋巴細(xì)胞與B16F10共培養(yǎng)體系（×100） 3A：未接受TRP-2180-188抗原肽、IL-2刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞與B16F10共培養(yǎng)48 h，淋巴細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化，向B16F10細(xì)胞周圍聚集；3B：經(jīng)體外刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞與B16F10共培養(yǎng)48 h，淋巴細(xì)胞體積增大，胞核變大，胞質(zhì)豐富，并向B16F10細(xì)胞周圍聚集

三、共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞增殖情況

24 h時(shí)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、TIM-3組淋巴細(xì)胞活力（%）分別為100.00±10.42、108.70±9.90、78.06±6.37，48 h時(shí)分別為 100.00±6.24、168.00±2.98、42.93±5.93。24 h、48 h時(shí) TIM-3組淋巴細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05）。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、TIM-3組48 h相對(duì)24 h淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù)分別為3.84 0.59、5.91 0.63、2.08 0.19，TIM-3組低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05）。

四、共培養(yǎng)體系24、48 h上清液中IFN-γ和TNF-α分泌情況和CD8+T淋巴細(xì)胞

24、48 h時(shí)TIM-3組上清液中IFN-γ濃度均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），TNF-α濃度均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。24、48 h時(shí)，TIM-3組共培養(yǎng)體系中CD8+T淋巴細(xì)胞中位數(shù)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。見表1。

表1 淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系24 h和48 h時(shí)IFN-γ、TNF-α濃度及CD8+T淋巴細(xì)胞

討 論

TIM-3是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子，是區(qū)分Thl和Th2細(xì)胞的表面標(biāo)志，在產(chǎn)IFN-γ的活化T淋巴細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。小鼠TIM-3有全長(zhǎng)跨膜型TIM-3（full-length membrane-anchored form of TIM-3，flTIM-3）和可溶型TIM-3（soluble form of TIM-3，sTIM-3）兩種形式。flTIM-3含有信號(hào)肽、免疫球蛋白V區(qū)、黏蛋白區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。sTIM-3僅含有信號(hào)肽、免疫球蛋白V區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。研究表明TIM-3還表達(dá)于Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞、髓系來(lái)源抑制細(xì)胞、淋巴瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞［2-5］。凝集素家族中β半乳糖苷結(jié)合凝集素9是TIM-3的主要配體，在組織內(nèi)分布廣泛，二者結(jié)合后，給T細(xì)胞提供了一種負(fù)性共刺激信號(hào)，下調(diào)免疫反應(yīng)，抑制Th1介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)和同種免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受［6-7］。TIM-3在腫瘤組織中選擇性表達(dá)，并在多水平參與腫瘤免疫：與T細(xì)胞功能耗竭有關(guān)，參與腫瘤免疫中T細(xì)胞應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控；促進(jìn)髓系來(lái)源抑制細(xì)胞的擴(kuò)增，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤發(fā)展；也可能促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟和激活自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤免疫應(yīng)答。在實(shí)體和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的動(dòng)物模型研究中，TIM-3在腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制中起重要作用，在大部分受抑制或者功能缺陷的CD8+T細(xì)胞表達(dá)TIM-3［8-10］。阻斷TIM-3后出現(xiàn)與阻斷程序性死亡1（PD-1）通路相似的抗腫瘤活性［11］。阻斷TIM-3可以恢復(fù)IFN-γ、TNF-α的分泌和NY-ESO-1特異性CD8+T細(xì)胞的的增殖。以上研究提示，單獨(dú)使用TIM-3靶向免疫治療或者聯(lián)合其他方法有治療腫瘤的可能性。

本研究探討體外條件下，包含信號(hào)肽及胞外區(qū)的TIM-3融合蛋白對(duì)黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細(xì)胞影響，期望能夠提高淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌水平。但是我們的研究發(fā)現(xiàn)，包含信號(hào)肽及胞外區(qū)的TIM-3融合蛋白降低了黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴細(xì)胞的增殖和IFN-γ、TNF-α分泌水平，分析原因可能與我們研究中合成的TIM-3融合蛋白為僅含信號(hào)肽及胞外區(qū)的TIM-3，與sTIM-3類似，而非flTIM-3。以往的研究主要應(yīng)用 flTIM-3［12-13］，flTIM-3 能夠促進(jìn) Th1 細(xì)胞擴(kuò)增，抑制Treg細(xì)胞增殖。目前對(duì)sTIM-3研究較少，其功能及相關(guān)機(jī)制尚不明確；有研究表明在轉(zhuǎn)染sTIM-3質(zhì)粒的小鼠黑素瘤模型中，sTIM-3促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，降低荷瘤小鼠生存時(shí)間，體外實(shí)驗(yàn)顯示sTIM-3抑制T細(xì)胞對(duì)抗原特異性刺激的反應(yīng)，抑制Th1細(xì)胞IL-2及IFN-γ的產(chǎn)生，用抗TIM-3單抗阻斷sTIM-3后可恢復(fù)T細(xì)胞功能，均提示sTIM-3抑制T細(xì)胞的功能［14］，我們的研究與該結(jié)果一致。

我們的研究中，TIM-3組CD8+T淋巴細(xì)胞高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，可能與TIM-3提高CD8+T淋巴細(xì)胞某類亞群的增殖有關(guān)，我們?cè)诤罄m(xù)試驗(yàn)中將對(duì)T細(xì)胞表型進(jìn)行進(jìn)一步研究，從而探討TIM-3對(duì)T細(xì)胞增殖和分化的影響。

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Effect of T-cell immunoglobulin and mucin domain-3 on TRP-2180-188peptide-stimulated murine spleen lymphocytes co-cultured with B16F10 murine melanoma cells

Lyu Yalin,Zhou Xiaowei,Hu Bin,Wu Qiong,Zeng Xuesi,Liu Yi,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Lyu YL,Hu B,Wu Q,Zeng XS,Liu Y,Sun JF）;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China（Zhou XW）

ObjectiveTo evaluate the effectofT-cellimmunoglobulinandmucindomain-3（TIM-3）on TRP-2180-188peptide-stimulated murine spleen lymphocytes co-cultured with B16F10 murine melanoma cells.MethodsA recombinant plasmid pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2 encoding TIM-3 was constructed.Then,the recombinant plasmid and an empty plasmid pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2 were transfected into human 293T epithelial cells followed by 48-hour culture for the preparation of supernatants containing TIM-3 and Ig-tail respectively.C57BL/6 mice were immunized with the TRP-2180-188peptide vaccine for 4 sessions.One week after the last vaccination,C57BL/6 mice were sacrificed,and spleen lymphocytes were collected and then cultured with the TRP-2180-188peptide and interleukin-2（IL-2）for 5 days,with lymphocytes untreated with the TRP-2180-188peptide or IL-2 serving as the control group.Mitomycin-treated B16F10 murine melanoma cells and TRP-2180-188peptide-stimulated lymphocytes were co-cultured with the presence of supernatants of 293T cells that had been cultured for 48 hours（blank control group）,TIM-3-containing supernatants（TIM-3 group）and Ig-tail-containing supernatants（negative control group）separately.After 24 and 48 hours of co-culture,cell counting kit-8（CCK-8）assay was performed to estimate the proliferative activity of lymphocytes,enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to determine the supernatant levels of interferon （INF）-γ and tumor necrosis factor （TNF）-α,flow cytometry to determine the percentage of CD8+T cells in the co-culture system.ResultsEnzyme digestion and sequence analysis showed that the TIM-3 gene was successfully inserted into the eukaryotic expression plasmid.After 48-hour culture,TIM-3 and Ig-tail expressions were detected in the supernatants of 293T cells transfected with the recombinant plasmid and empty plasmid respectively.As CCK-8 assay showed,the proliferative activity of lymphocytes was significantly lower in the TIM-3 group than in the blank control group and negative control group after 24-and 48-hour culture（78.06%±6.37%vs.100.00%±10.42%and 108.70%±9.90%at 24 hours,42.93%±5.93%vs.100.00%±6.24%and 168.00%±2.98%at 48 hours,allP＜0.05）,so was the ratio of cellular proliferative activity at 48 hours to that at 24 hours （allP＜0.05）.Compared with the blank control group and negative control group,the TIM-3 group showed significantly decreased supernatant levels of IFN-γ and TNF-α after 24-hour （IFN-γ：192.96±5.05 ng/L vs.216.44±7.85 ng/L and 223.67±7.79 ng/L,bothP＜0.05;TNF-α：58.43±0.26 ng/L vs.26.43±0.01 ng/L and 86.85±1.12 ng/L,bothP＜0.05）and 48-hour culture （IFN-γ：54.95±0.57 ng/L vs.230.06±4.23 ng/L and 167.24±3.33 ng/L,bothP＜0.05;TNF-α：30.23±0.26 ng/L vs.26.84±0.20 ng/L and 45.34±0.22 ng/L,bothP＜0.05）.In addition,the median percentage of CD8+T cells was significantly increased in the TIM-3 group compared with the blank control group and negative control group after 24-and 48-hour culture（3.30%vs.0.421%and 2.22%at 24 hours,4.06%vs.0.577%and 0.691%at 48 hours,allP＜0.05）.Conclusion TIM-3in vitrocan suppress the proliferative activity of and secretion of IFN-γ and TNF-α by lymphocytes,but increase the percentage of CD8+T cells in the co-culture system of TRP-2180-188peptide-stimulated lymphocytes and B16F10 cells.

Melanoma,experimental;Vaccines,subunit;T-lymphocytes,cytotoxic;Interferon-gamma;T cell immunoglobulin and mucin domain-3

s：Liu Yi,Email：dr.liuyi@gmail.com;Sun Jianfang,Email：sunjf57@163.com

2015-05-11）

（本文編輯：尚淑賢）

劉毅，Email：dr.liuyi@gmail.com；孫建方，Email：sunjf57@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171513）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012506、BK20131063）；2012高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20121106110040）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171513）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012506,BK20131063）;Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China in 2012（20121106110040）