表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)牛奶中三聚氰胺

王琳，王雪，田靜秒，朱華

（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，北京101200）

表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)牛奶中三聚氰胺

王琳，王雪，田靜秒，朱華

（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，北京101200）

建立一種用于檢測(cè)三聚氰胺的快速分析方法。采用表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）分析方法檢測(cè)三聚氰胺。該方法的方法檢測(cè)限為50ng/mL。該方法的檢測(cè)結(jié)果受pH的影響，在酸性條件下，三聚氰胺的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)較顯著。該方法可以用于檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺，檢測(cè)限為1μg/mL。該方法操作簡(jiǎn)便，所用時(shí)間短，牛奶前處理與檢測(cè)時(shí)間一共只需5min，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

表面增強(qiáng)拉曼光譜；三聚氰胺；牛奶

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（SERS）是拉曼光譜技術(shù)中的一種，它發(fā)展于20世紀(jì)70年代。吸附在粗糙化金屬表面的化合物，由于表面局域等離子激元被激發(fā)所引起的電磁增強(qiáng)，以及粗糙表面上的原子簇及吸附其上的分子構(gòu)成拉曼增強(qiáng)的活性點(diǎn)，這兩者的作用使被測(cè)定物的拉曼散射產(chǎn)生極大的增強(qiáng)效應(yīng)。其增強(qiáng)因子可達(dá)103～107，已發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生SERS的金屬有金、銀等少數(shù)金屬。此技術(shù)具有選擇性好和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)際檢測(cè)限可達(dá)10-12克級(jí)。因此，SERS技術(shù)作為一種新興的定性與定量檢測(cè)技術(shù)，近年來引起了極大的重視，取得了若干研究進(jìn)展［1-3］。

三聚氰胺簡(jiǎn)稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺。三聚氰胺（Melamine）是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，是尿素后加工產(chǎn)品［4］。它是白色單斜晶體，具有D3h對(duì)稱性［5］。三聚氰胺具有較強(qiáng)的黏性，在機(jī)體內(nèi)的代謝屬于不活潑代謝或惰性代謝［6］，容易在體內(nèi)吸附形成結(jié)石的草酸、鞣酸及鈣等物質(zhì)，并沉積在泌尿系統(tǒng)中。長(zhǎng)期攝入三聚氰胺會(huì)造成泌尿系統(tǒng)損害，引起膀胱及腎的結(jié)石，并可進(jìn)一步引起移行性細(xì)胞增生進(jìn)而誘發(fā)膀胱癌［7］。乳制品是嬰幼兒的主要食物來源，嬰幼兒代謝能力弱，所以長(zhǎng)期食用含有三聚氰胺的食物就會(huì)對(duì)身體造成危害甚至威脅生命安全。2008年我國(guó)發(fā)生被三聚氰胺污染的乳制品導(dǎo)致嬰幼兒結(jié)石及數(shù)起嬰幼兒死亡病例。

綜上，由于三聚氰胺威脅健康，因此禁止被添加到食物中。但是，因?yàn)槭称饭I(yè)上普遍采用的、被定為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)生鮮奶蛋白質(zhì)含量的方法是凱氏定氮法［8］，凱氏定氮法并不是直接檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，而是通過測(cè)氮含量來推算蛋白質(zhì)含量。三聚氰胺含氮量高達(dá)66%左右，將其混入摻水或劣質(zhì)生鮮奶中，就可以造成檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)含量達(dá)標(biāo)的假象。因此，不法商家仍然會(huì)在牛奶中添加三聚氰胺以牟取利益，因此研究牛奶中三聚氰胺的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法十分必要。

表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)牛奶中非法添加三聚氰胺具有操作簡(jiǎn)單，快速和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，本文采用膠體金顆粒作為表面增強(qiáng)拉曼光譜的增強(qiáng)試劑，研究了采用SERS技術(shù)檢測(cè)牛奶中非法添加的三聚氰胺的可行性，為進(jìn)一步研究SERS技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1儀器

手持式拉曼光譜檢測(cè)儀（IDRaman mini）（激發(fā)光波長(zhǎng)785nm，激光輸出功率100mW，光譜范圍400cm-1～2 300 cm-1，光譜分辨率12 cm-1～14 cm-1）：購于海洋光學(xué)公司。

1.2材料與試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：購于中國(guó)獸藥研究所；氯金酸、檸檬酸三鈉：購于北京科實(shí)玻璃儀器有限公司；其他試劑：購于西隴化工股份有限公司。

1.3膠體金制備

采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備膠體金溶液［9］，配制100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的氯金酸溶液，邊攪拌邊加熱至沸騰，快速加入3 mL的檸檬酸三鈉溶液，觀察溶液顏色變化，溶液顏色完全變?yōu)榧t色后開始計(jì)時(shí)，5 min后停止加熱，使其緩慢冷卻至室溫，加超純水補(bǔ)足體積至100 mL。

1.4表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)步驟

首先，檢測(cè)待測(cè)分子標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼圖譜，以該圖譜作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜；接著，將40 μL樣品與360 μL增強(qiáng)試劑（膠體金顆粒溶液）放入樣品瓶中，混合，搖勻；再將樣品瓶放入拉曼檢測(cè)儀的樣品池中，獲取樣品的拉曼圖譜，將樣品的拉曼圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，以能否觀察到特征峰作為能否檢出的判斷依據(jù)。

手持式拉曼光譜檢測(cè)儀的操作步驟：1）確認(rèn)儀器中已放入電池，或已連接外接取電設(shè)備（如電腦），并且樣品池中沒有樣品瓶，再按下開機(jī)按鈕啟動(dòng)儀器。進(jìn)入密碼輸入界面，輸入四位數(shù)字密碼，按確認(rèn)鍵。等待儀器自檢結(jié)束，進(jìn)入檢測(cè)界面。2）將樣品瓶放入樣品池，或?qū)⑻筋^對(duì)準(zhǔn)待測(cè)樣品，按下確認(rèn)鍵，再按下運(yùn)行鍵，接著再按下確認(rèn)鍵，等待儀器獲得樣品的拉曼圖譜。3）結(jié)果界面顯示紅色的樣品圖譜，按下結(jié)果界面左下方的儲(chǔ)存鍵，將樣品的拉曼圖譜儲(chǔ)存到儀器中。拉曼圖譜的存儲(chǔ)名稱為檢測(cè)時(shí)間的小時(shí)-分鐘-秒鐘，存儲(chǔ)位置為“SPECTRA”文件夾中檢測(cè)日期的文件夾。4）將儀器連接電腦，按下USB鍵，打開“SPECTRA”文件夾，將需要的數(shù)據(jù)導(dǎo)出。

1.5研究pH對(duì)SERS檢測(cè)三聚氰胺的影響

取膠體金溶液，不加入三聚氰胺，將pH調(diào)節(jié)到2.0，7.0或12.0，之后按照1.4的方法進(jìn)行檢測(cè)。

使用去離子水溶解三聚氰胺，配制質(zhì)量濃度為50 ng/mL的三聚氰胺溶液，將三聚氰胺溶液與膠體金溶液按照體積比1∶9的比例混合均勻，將pH調(diào)節(jié)到2.0，7.0或12.0，之后按照1.4的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6研究SERS檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法

取0.5 mL牛奶，加入0.5 mL去離子水，混勻。加入25μL的樣品前處理試劑Ⅰ（106 g/L亞鐵氰化鉀溶液）與25μL的樣品前處理試劑Ⅱ（220 g/L乙酸鋅溶液），混勻，渦旋振蕩30 s至1 min。14 000 r/min離心1 min，取中間清液，使用0.45 μm的濾膜過濾。取過濾后的溶液，與膠體金溶液按照體積比1∶9的比例混合均勻，按照1.4的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1pH對(duì)SERS檢測(cè)三聚氰胺的影響

膠體金溶液的拉曼圖譜見圖1（a），三聚氰胺的拉曼圖譜見圖1（b）。

圖1　膠體金與三聚氰胺的拉曼圖譜Fig.1Raman atlas of colloidal gold and SERS atlas of melamine

由圖1可見，檢測(cè)時(shí)調(diào)節(jié)pH至酸性，可以觀察到三聚氰胺的拉曼特征峰，波數(shù)為710 cm-1，由676 cm-1的峰發(fā)生紅移而至。推測(cè)該峰來自于三聚氰胺分子的對(duì)稱骨架伸縮振動(dòng)［10］。檢測(cè)時(shí)pH值為中性或堿性，則無法觀察到上述特征峰。說明調(diào)節(jié)pH值至酸性，能夠引起或促進(jìn)膠體金對(duì)拉曼光譜的增強(qiáng)效應(yīng)。

三聚氰胺的表面增強(qiáng)圖譜，與三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)圖譜有區(qū)別，984 cm-1特征峰消失，676 cm-1特征峰紅移至710 cm-1。推測(cè)三聚氰胺與膠體金顆粒表面發(fā)生相互作用，拉曼振動(dòng)模式有所改變，因此特征峰發(fā)生位移或其他變化。

酸性條件下，三聚氰胺的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)較顯著。膠體金對(duì)待測(cè)分子拉曼散射的增強(qiáng)機(jī)制，與化學(xué)鍵效應(yīng)（來自于吸附分子與金屬的復(fù)合、成鍵）有關(guān)，也與電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)有關(guān)。推測(cè)溶液pH變?yōu)樗嵝?，影響了三聚氰胺的電性與電荷分布，從而影響了三聚氰胺與膠體金顆粒表面的吸附基團(tuán)或吸附模式，以及三聚氰胺與膠體金顆粒的拉曼共振效應(yīng)，因此使膠體金顆粒對(duì)三聚氰胺拉曼散射的表面增強(qiáng)作用進(jìn)一步加強(qiáng)。堿性條件影響不顯著。

本方法檢測(cè)三聚氰胺的檢測(cè)限為50 ng/mL。

2.2檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺

市售牛奶，添加不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺，檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2　牛奶中三聚氰胺的拉曼圖譜Fig.2SERS atlas of melamine in milk

由圖2可見，牛奶中添加三聚氰胺的質(zhì)量濃度為1、2、5 μg/mL，可以觀察到三聚氰胺的拉曼特征峰，波數(shù)為710 cm-1。說明該方法可以檢測(cè)牛奶中非法添加的三聚氰胺。

本方法檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺，檢測(cè)限為1μg/mL。

3　討論

三聚氰胺對(duì)生物有重大危害，被三聚氰胺污染的飼料可以導(dǎo)致寵物貓、狗中毒死亡，被三聚氰胺污染的嬰幼兒食品可以導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石，因此，開發(fā)能夠準(zhǔn)確迅速的檢測(cè)三聚氰胺的方法有重要意義。本研究建立了SERS檢測(cè)三聚氰胺的高靈敏方法，方法檢測(cè)限為50 ng/mL。本研究還建立了SERS檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法，檢測(cè)限為1 μg/mL，該方法操作簡(jiǎn)便，所用時(shí)間短，牛奶前處理與檢測(cè)時(shí)間一共只需5 min，試劑穩(wěn)定，配合手持式或便攜式拉曼光譜儀，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

本文通過研究pH對(duì)SERS檢測(cè)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)酸性條件下，三聚氰胺的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)較顯著，這一研究結(jié)果，為進(jìn)一步研究表面增強(qiáng)拉曼分析的原理與檢測(cè)效果奠定了基礎(chǔ)。

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Surface Enhanced Raman Spectroscopy（SERS）Assay Method for Melamine in Milk

WANG Lin，WANG Xue，TIAN Jing-miao，ZHU Hua
（Beijing Purkinje General Instrument CO.，LTD.，Beijing 101200，China）

A fast surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）assay method for melamine was developed. The limit of detection of the SERS method was 50 ng/mL.The SERS spectrums under three different pH conditions were studied，and the results showed that the pH of the system had obvious effect on the SERS，and the SERS was most enhanced under acidic condition.For detecting milk，the limit of detection of the SERS method was 1 μg/mL.The SERS method was simple and rapid and could be finished in five minutes.The SERS method could be a convenient tool for field detection of melamine.

surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）；melamine；milk

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.038

王琳（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：快速診斷檢測(cè)技術(shù)的研究開發(fā)和應(yīng)用等。

2015-11-25